第三章 普通光學(xué)顯微鏡的原理與使用

顯微鏡的發(fā)展顯微鏡的光學(xué)原理顯微鏡的幾個基本概念顯微鏡的結(jié)構(gòu)顯微鏡的使用顯微鏡的維護普通光學(xué)顯微鏡原理與使用要知道的幾個重要的分辨率人眼：0.2mm光學(xué)顯微鏡：0.2um電子顯微鏡：0.2nm1.顯微鏡的發(fā)展1.1人眼：人眼觀察物體的能力是有限的。一般的情況下，在25cm的明視距離內(nèi)，人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的兩個物體。也就是說，當(dāng)兩個物體相距不到0.1mm的時候，人眼就會把它們看成是一個物體了。這個極限便稱為人眼的分辨本領(lǐng)。1.2放大鏡：約在四百年前眼鏡片工匠們開始磨制放大鏡。當(dāng)時的放大鏡的放大倍數(shù)只有3—5x

1.3顯微鏡：1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者造出類似顯微鏡的放大儀器。1673～1677年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡19世紀70年代，德國人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎(chǔ)。1850年出現(xiàn)了偏光顯微術(shù)；1893年出現(xiàn)了干涉顯微術(shù)；1935年荷蘭物理學(xué)家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術(shù)，羅伯特·虎克制造的顯微鏡（1665）放大倍數(shù)：140倍

列文虎克和他的顯微鏡（約1680）2顯微鏡的光學(xué)原理2.1折射和折射率

光線在均勻的各向同性介質(zhì)中，兩點之間以直線傳播，當(dāng)通過不同密度介質(zhì)的透明物體時，則發(fā)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質(zhì)的傳播速度不同造成的。2.2凸透鏡的五種成象規(guī)律

(1)當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以外時，則在象方二倍焦距以內(nèi)、焦點以外形成縮小的倒立實象；(2)當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距上時，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實象；(3)當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點以外時，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實象；(4)當(dāng)物體位于透鏡物方焦點上時，則象方不能成象；(5)當(dāng)物體位于透鏡物方焦點以內(nèi)時，則象方也無象的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠的位置形成放大的直立虛象。2.3顯微鏡的成像原理

顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的微小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。物體位于物鏡前方，離開物鏡的距離大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所以，它經(jīng)物鏡以后，必然形成一個倒立的放大的實像A'B'。A'B'靠近F2的位置上。再經(jīng)目鏡放大為虛像A''B''后供眼睛觀察。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身，而是物體被物鏡所成的已經(jīng)放大了一次的像。

觀察者顯微鏡光路示意圖3顯微鏡的幾個基本概念3.1光源：能發(fā)射光波的物體?？梢姽忸l率范圍：7.5×1014-3.9×1014

Hz。

真空中對應(yīng)的波長范圍：390nm–760nm

相應(yīng)光色：紫、藍、青、綠、黃、橙、紅3.2分辨率(鑒別距離)：顯微鏡能分辨的最小距離，用D表示。顯微鏡的鑒別距離越小，分辨率越高。D=0.61λ/nsin

D：分辨率λ:光波的波長n:介質(zhì)折射率α:物鏡鏡口角普通光線的波長為400~700nm，因此顯微鏡分辨力數(shù)值0.2μm左右，人眼的在明視距離分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設(shè)計的最大放大倍數(shù)通常為1000X.介質(zhì)空氣水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.663.3孔徑角：由標本上一點發(fā)出的進入物鏡最邊緣光線L和進入物鏡中心光線OA之間的夾角

稱為孔徑角。3.4數(shù)值孔徑：令N·A=nsin

,叫物鏡的數(shù)值孔徑。數(shù)值孔徑與顯微鏡的分辨率有密切關(guān)系，越短，NA越大，分辨率越高。3.5放大率在顯微鏡下所看到的物像和實際物體之間的大小比例叫顯微鏡的放大率或放大倍數(shù)。顯微鏡下物像的放大主要由物鏡、鏡筒長度、目鏡所決定。適合的放大倍數(shù)決定于物鏡的數(shù)值孔徑，一船應(yīng)為數(shù)值孔徑的500――1000倍。色差:光的波長不同，所以在通過透鏡時的折射率也不同，這樣物方一個點，在像方則可能形成一個色斑。光學(xué)系統(tǒng)最主要的功能就是消色差.單色光不產(chǎn)生色差。3.6透鏡像差球差：球差是軸上點的單色相差，是由于透鏡的球形表面造成的。球差造成的結(jié)果是，一個點成像后，不再是個亮點，而是一個中間亮邊緣逐漸模糊的亮斑，從而影響成像質(zhì)量。像散：由于發(fā)光物點不在光學(xué)系統(tǒng)的光軸上，它所發(fā)出的光束與光軸有一傾斜角。該光束經(jīng)透鏡折射后，光束不能聚焦于一點，成像不清晰，故產(chǎn)生像散。明晰圓弧矢焦線子午焦線3.7焦點深度

在顯微鏡的光軸上有一段距離范圍內(nèi)物體被看得清晰。超出這段距離的物體就模糊不清。這段距離位于顯微鏡焦點的上下很小的范圍之內(nèi)。這段距離的上下限叫焦點深度。3.8視場數(shù)

觀察顯微鏡時，所看到的明亮的圓形范圍叫視場。

視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內(nèi)所能容納被檢物體的實際范圍。視場直徑愈大，愈便于觀察。

蔡司視場數(shù)是23mm，用100X的物鏡，其視場數(shù)是23mm/100＝0.23mm，就是說把一個0.23mm的線段放在顯微鏡下觀察，線段兩端正好在視野邊緣。顯微鏡的總放大率小的時候所能看到的標本的范圍大，而總放大率愈大所能看到的標本的局部愈小。所以說視野與顯微鏡的總放大率成反比。3.9工作距離工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時，被檢物體應(yīng)處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此，它與焦距是兩個概念，平時習(xí)慣所說的調(diào)焦，實際上是調(diào)節(jié)工作距離。在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)也包括蓋玻片在內(nèi)。對蓋玻片厚度有一定的要求。國際上規(guī)定，蓋玻片的標準厚度為0.17mm，許可范圍在0.16-0.18mm，在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計算在內(nèi)。物鏡外殼上標的0.17，即表明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。提高顯微鏡分辨率的方法：（1）增大物鏡的數(shù)值孔徑在物鏡和蓋玻片之間充以n較大的油，如香柏油n=1.52,不僅使n增大，而且孔徑角

也增大。（2）用短波長的光照射如紫外光顯微鏡，電子顯微鏡。4顯微鏡的結(jié)構(gòu)

組成光學(xué)放大系統(tǒng)照明系統(tǒng)機械和支架系統(tǒng)物鏡光源折光鏡聚光鏡濾光片目鏡

4.1物鏡物鏡是光學(xué)顯微鏡成像系統(tǒng)中決定其分辨率或叫分辨本領(lǐng)的最關(guān)鍵部件。(1)消色差物鏡

色差校正使可見光中紅光和藍光聚焦于一點，而黃綠光則聚焦于另一點。能夠消除光譜中紅光和藍光所形成的色差。這種物鏡與目鏡配用時可達到消色差物鏡所要求的光學(xué)性能。(2)復(fù)消色差物鏡

能消除可視光中黃、紅、藍即包括幾乎所有譜線在成像過程中所造成的色差，是性能最高的物鏡。(3)平象物鏡它們所成的影象基本上是平的，對目視觀察及顯微攝影都極為方便，在同樣放大倍數(shù)下它成的影象比用一般物鏡要大一點。在平象物鏡的金屬外框上，刻有Flanachr、

planapo、

plan

等字樣。

4.2目鏡目鏡的作用是把物鏡放大的實象再放大一級，并把物象映入觀察者的眼中，實質(zhì)上目鏡就是一個放大鏡。顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數(shù)值孔徑所決定的，而目鏡只是起放大作用。對于物鏡不能分辨出的結(jié)構(gòu)，目鏡放的再大，也仍然不能分辨出。4.3聚光鏡聚光鏡裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40以上的物鏡時，則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補光量的不足和適當(dāng)改變從光源射來的光的性質(zhì)，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。5光學(xué)顯微鏡的使用實驗時要把顯微鏡放在座前桌面上稍偏左的位置，鏡座應(yīng)距桌沿6～7cm左右。打開光源開關(guān)，調(diào)節(jié)光強到合適大小。轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡頭正對載物臺上的通光孔。

將所要觀察的玻片放在載物臺上，使玻片中被觀察的部分位于通光孔的正中央。先用低倍鏡觀察（4X）。觀察之前，先轉(zhuǎn)動粗動調(diào)焦手輪，使載物臺上升，物鏡逐漸接近玻片。需要注意，不能使物鏡觸及玻片，然后，通過目鏡觀察，并轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦手輪，使載物臺慢慢下降，直到看清物像。如果像偏離視野，可慢慢調(diào)節(jié)載物臺移動手柄。瞳距調(diào)節(jié)：左右推拉目鏡，使兩目鏡距離與自己兩眼距離相等。屈光度調(diào)節(jié)高倍物鏡觀察：把物像中需要放大觀察的部分移至視野中央。將高倍物鏡轉(zhuǎn)入光路（一般具有正常功能的顯微鏡，低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦，在用低倍物鏡觀察清晰時，換高倍物鏡應(yīng)可以見到物像，但物像不一定很清晰），微動調(diào)焦手輪進行調(diào)節(jié)。根據(jù)需要調(diào)節(jié)孔徑光闌的大小或聚光器的高低，使光線符合要求（一般將低倍物鏡換成高倍物鏡觀察時，視野要稍變暗一些，所以需要調(diào)節(jié)光線強弱）。觀察完畢，應(yīng)先將物鏡鏡頭從通光孔處移開，并檢查物鏡是否沾水沾油，檢查處理完畢后即可裝箱。瞳距調(diào)節(jié)屈光度調(diào)節(jié)

6.光學(xué)顯微分析在材料科學(xué)中的應(yīng)用光學(xué)顯微分析是利用可見光觀察物體的表面形貌和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，鑒定晶體的光學(xué)性質(zhì)。利用偏光顯微鏡和金相顯微鏡進行晶體光學(xué)鑒定，是研究材料的重要方法之一。透明晶體的觀察可利用透射顯微鏡，如偏光顯微鏡。不透明物體只能使用反射式顯微鏡，即金相顯微鏡。（不采用蓋玻片，照明光束從上面照射非透明物體）偏光顯微鏡偏光顯微鏡的構(gòu)成XPT-7型偏光顯微鏡利用偏光顯微鏡的各部件可以組合成單偏光、正交偏光、錐光等光學(xué)分析系統(tǒng)→鑒定透明晶體光學(xué)性質(zhì)。1—目鏡， 2—鏡筒，3—勃氏鏡， 4—粗動手輪，5—微調(diào)手輪， 6—鏡臂，7—鏡座， 8—上偏光鏡，9—試板孔， 10—物鏡，11—載物臺， 12—聚光鏡，13—鎖光圈， 14—下偏光鏡，15—反光鏡透射光顯微鏡（偏光顯微鏡）的應(yīng)用（無機材料）研究玻璃材料：鑒定玻璃結(jié)石的種類和成因在陶瓷、水泥、耐火材料中：如陶瓷巖相分析在高分子材料上：高分子結(jié)晶針狀、棒狀鱗石英雪花狀鱗石英

管柱狀鱗石英

鱗石英的矛頭雙晶

偏光顯微鏡-PHB（聚-β-羥丁酸）在不同溫度下的結(jié)晶形態(tài)（μm級）

500C700C750C

800C1100C1300C

方法：偏光顯微鏡（250倍），熔融壓片。

純PP未處理（6phr）處理(6phr)

方法：偏光顯微鏡（250倍），熔融壓片。

結(jié)論：納米無機粒子的加入，使體系球晶尺寸變小，經(jīng)表面處理后情況更明顯。偏光顯微鏡-納米CaCO3對PP聚丙烯球晶尺寸的影響（μm級）光學(xué)金相顯微鏡—PP/納米TiO2

（表面紫外光老化后結(jié)構(gòu)變化）反光顯微鏡反光顯微鏡在材料科學(xué)中的應(yīng)用（金屬、無機非金屬）水泥熟料的研究研究不透明晶體（薄片厚度在0.03mm時）的光學(xué)性質(zhì)。反光顯微鏡的構(gòu)造：鏡座、鏡臂、鏡筒、載物臺、物鏡、目鏡、調(diào)焦手輪、光源、視場光闌、孔徑光闌。金相顯微鏡金相顯微鏡垂直照明器構(gòu)成：反射器、前偏光鏡、孔徑光闌、視場光闌等部件組成作用：把從光源來的入射光通過物鏡垂直投射到光片表面，再把光片表面反射回來的光投射到目鏡焦平面內(nèi)。A礦的六角板狀結(jié)構(gòu)B礦的圓形結(jié)構(gòu)玻璃配合料高溫熔融過程光學(xué)顯微分析樣品的制備合格光片樣品的條件：能代表所要研究的對象；光片的檢測面平整光滑；能顯示所要研究的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)。光片的制作的一般過程：

取樣：鋸、車、刨、砂輪切割；避免局部過熱或變形鑲嵌：機械夾持法、塑料鑲嵌法、低熔點鑲嵌法磨光：去除取樣時引入樣品表面的損傷拋光：去除細磨痕和變形層，以獲得平整無疵的鏡面（機械拋光、電解拋光、化學(xué)拋光）浸蝕：清晰顯示材料的內(nèi)部組織，并去除拋光引起的變形層（化學(xué)浸蝕、電解浸蝕、物理蝕刻法