第三章 普通光學(xué)顯微鏡的原理與使用

顯微鏡的發(fā)展顯微鏡的光學(xué)原理顯微鏡的幾個(gè)基本概念顯微鏡的結(jié)構(gòu)顯微鏡的使用顯微鏡的維護(hù)普通光學(xué)顯微鏡原理與使用要知道的幾個(gè)重要的分辨率人眼：0.2mm光學(xué)顯微鏡：0.2um電子顯微鏡：0.2nm1.顯微鏡的發(fā)展1.1人眼：人眼觀察物體的能力是有限的。一般的情況下，在25cm的明視距離內(nèi)，人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的兩個(gè)物體。也就是說，當(dāng)兩個(gè)物體相距不到0.1mm的時(shí)候，人眼就會把它們看成是一個(gè)物體了。這個(gè)極限便稱為人眼的分辨本領(lǐng)。1.2放大鏡：約在四百年前眼鏡片工匠們開始磨制放大鏡。當(dāng)時(shí)的放大鏡的放大倍數(shù)只有3—5x

1.3顯微鏡：1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者造出類似顯微鏡的放大儀器。1673～1677年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡19世紀(jì)70年代，德國人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎(chǔ)。1850年出現(xiàn)了偏光顯微術(shù)；1893年出現(xiàn)了干涉顯微術(shù)；1935年荷蘭物理學(xué)家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術(shù)，羅伯特·虎克制造的顯微鏡（1665）放大倍數(shù)：140倍

列文虎克和他的顯微鏡（約1680）2顯微鏡的光學(xué)原理2.1折射和折射率

光線在均勻的各向同性介質(zhì)中，兩點(diǎn)之間以直線傳播，當(dāng)通過不同密度介質(zhì)的透明物體時(shí)，則發(fā)生折射現(xiàn)象，這是由于光在不同介質(zhì)的傳播速度不同造成的。2.2凸透鏡的五種成象規(guī)律

(1)當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以外時(shí)，則在象方二倍焦距以內(nèi)、焦點(diǎn)以外形成縮小的倒立實(shí)象；(2)當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距上時(shí)，則在象方二倍焦距上形成同樣大小的倒立實(shí)象；(3)當(dāng)物體位于透鏡物方二倍焦距以內(nèi)，焦點(diǎn)以外時(shí)，則在象方二倍焦距以外形成放大的倒立實(shí)象；(4)當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)上時(shí)，則象方不能成象；(5)當(dāng)物體位于透鏡物方焦點(diǎn)以內(nèi)時(shí)，則象方也無象的形成，而在透鏡物方的同側(cè)比物體遠(yuǎn)的位置形成放大的直立虛象。2.3顯微鏡的成像原理

顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的微小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。物體位于物鏡前方，離開物鏡的距離大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所以，它經(jīng)物鏡以后，必然形成一個(gè)倒立的放大的實(shí)像A'B'。A'B'靠近F2的位置上。再經(jīng)目鏡放大為虛像A''B''后供眼睛觀察。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身，而是物體被物鏡所成的已經(jīng)放大了一次的像。

觀察者顯微鏡光路示意圖3顯微鏡的幾個(gè)基本概念3.1光源：能發(fā)射光波的物體。可見光頻率范圍：7.5×1014-3.9×1014

Hz。

真空中對應(yīng)的波長范圍：390nm–760nm

相應(yīng)光色：紫、藍(lán)、青、綠、黃、橙、紅3.2分辨率(鑒別距離)：顯微鏡能分辨的最小距離，用D表示。顯微鏡的鑒別距離越小，分辨率越高。D=0.61λ/nsin

D：分辨率λ:光波的波長n:介質(zhì)折射率α:物鏡鏡口角普通光線的波長為400~700nm，因此顯微鏡分辨力數(shù)值0.2μm左右，人眼的在明視距離分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設(shè)計(jì)的最大放大倍數(shù)通常為1000X.介質(zhì)空氣水香柏油α溴萘折射率11.331.5151.663.3孔徑角：由標(biāo)本上一點(diǎn)發(fā)出的進(jìn)入物鏡最邊緣光線L和進(jìn)入物鏡中心光線OA之間的夾角

稱為孔徑角。3.4數(shù)值孔徑：令N·A=nsin

,叫物鏡的數(shù)值孔徑。數(shù)值孔徑與顯微鏡的分辨率有密切關(guān)系，越短，NA越大，分辨率越高。3.5放大率在顯微鏡下所看到的物像和實(shí)際物體之間的大小比例叫顯微鏡的放大率或放大倍數(shù)。顯微鏡下物像的放大主要由物鏡、鏡筒長度、目鏡所決定。適合的放大倍數(shù)決定于物鏡的數(shù)值孔徑，一船應(yīng)為數(shù)值孔徑的500――1000倍。色差:光的波長不同，所以在通過透鏡時(shí)的折射率也不同，這樣物方一個(gè)點(diǎn)，在像方則可能形成一個(gè)色斑。光學(xué)系統(tǒng)最主要的功能就是消色差.單色光不產(chǎn)生色差。3.6透鏡像差球差：球差是軸上點(diǎn)的單色相差，是由于透鏡的球形表面造成的。球差造成的結(jié)果是，一個(gè)點(diǎn)成像后，不再是個(gè)亮點(diǎn)，而是一個(gè)中間亮邊緣逐漸模糊的亮斑，從而影響成像質(zhì)量。像散：由于發(fā)光物點(diǎn)不在光學(xué)系統(tǒng)的光軸上，它所發(fā)出的光束與光軸有一傾斜角。該光束經(jīng)透鏡折射后，光束不能聚焦于一點(diǎn)，成像不清晰，故產(chǎn)生像散。明晰圓弧矢焦線子午焦線3.7焦點(diǎn)深度

在顯微鏡的光軸上有一段距離范圍內(nèi)物體被看得清晰。超出這段距離的物體就模糊不清。這段距離位于顯微鏡焦點(diǎn)的上下很小的范圍之內(nèi)。這段距離的上下限叫焦點(diǎn)深度。3.8視場數(shù)

觀察顯微鏡時(shí)，所看到的明亮的圓形范圍叫視場。

視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內(nèi)所能容納被檢物體的實(shí)際范圍。視場直徑愈大，愈便于觀察。

蔡司視場數(shù)是23mm，用100X的物鏡，其視場數(shù)是23mm/100＝0.23mm，就是說把一個(gè)0.23mm的線段放在顯微鏡下觀察，線段兩端正好在視野邊緣。顯微鏡的總放大率小的時(shí)候所能看到的標(biāo)本的范圍大，而總放大率愈大所能看到的標(biāo)本的局部愈小。所以說視野與顯微鏡的總放大率成反比。3.9工作距離工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時(shí)，被檢物體應(yīng)處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此，它與焦距是兩個(gè)概念，平時(shí)習(xí)慣所說的調(diào)焦，實(shí)際上是調(diào)節(jié)工作距離。在物鏡數(shù)值孔徑一定的情況下，工作距離短孔徑角則大。數(shù)值孔徑大的高倍物鏡，其工作距離小。顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)也包括蓋玻片在內(nèi)。對蓋玻片厚度有一定的要求。國際上規(guī)定，蓋玻片的標(biāo)準(zhǔn)厚度為0.17mm，許可范圍在0.16-0.18mm，在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計(jì)算在內(nèi)。物鏡外殼上標(biāo)的0.17，即表明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。提高顯微鏡分辨率的方法：（1）增大物鏡的數(shù)值孔徑在物鏡和蓋玻片之間充以n較大的油，如香柏油n=1.52,不僅使n增大，而且孔徑角

也增大。（2）用短波長的光照射如紫外光顯微鏡，電子顯微鏡。4顯微鏡的結(jié)構(gòu)

組成光學(xué)放大系統(tǒng)照明系統(tǒng)機(jī)械和支架系統(tǒng)物鏡光源折光鏡聚光鏡濾光片目鏡

4.1物鏡物鏡是光學(xué)顯微鏡成像系統(tǒng)中決定其分辨率或叫分辨本領(lǐng)的最關(guān)鍵部件。(1)消色差物鏡

色差校正使可見光中紅光和藍(lán)光聚焦于一點(diǎn)，而黃綠光則聚焦于另一點(diǎn)。能夠消除光譜中紅光和藍(lán)光所形成的色差。這種物鏡與目鏡配用時(shí)可達(dá)到消色差物鏡所要求的光學(xué)性能。(2)復(fù)消色差物鏡

能消除可視光中黃、紅、藍(lán)即包括幾乎所有譜線在成像過程中所造成的色差，是性能最高的物鏡。(3)平象物鏡它們所成的影象基本上是平的，對目視觀察及顯微攝影都極為方便，在同樣放大倍數(shù)下它成的影象比用一般物鏡要大一點(diǎn)。在平象物鏡的金屬外框上，刻有Flanachr、

planapo、

plan

等字樣。

4.2目鏡目鏡的作用是把物鏡放大的實(shí)象再放大一級，并把物象映入觀察者的眼中，實(shí)質(zhì)上目鏡就是一個(gè)放大鏡。顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數(shù)值孔徑所決定的，而目鏡只是起放大作用。對于物鏡不能分辨出的結(jié)構(gòu)，目鏡放的再大，也仍然不能分辨出。4.3聚光鏡聚光鏡裝在載物臺的下方。小型的顯微鏡往往無聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40以上的物鏡時(shí)，則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補(bǔ)光量的不足和適當(dāng)改變從光源射來的光的性質(zhì)，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。5光學(xué)顯微鏡的使用實(shí)驗(yàn)時(shí)要把顯微鏡放在座前桌面上稍偏左的位置，鏡座應(yīng)距桌沿6～7cm左右。打開光源開關(guān)，調(diào)節(jié)光強(qiáng)到合適大小。轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使低倍鏡頭正對載物臺上的通光孔。

將所要觀察的玻片放在載物臺上，使玻片中被觀察的部分位于通光孔的正中央。先用低倍鏡觀察（4X）。觀察之前，先轉(zhuǎn)動粗動調(diào)焦手輪，使載物臺上升，物鏡逐漸接近玻片。需要注意，不能使物鏡觸及玻片，然后，通過目鏡觀察，并轉(zhuǎn)動粗調(diào)焦手輪，使載物臺慢慢下降，直到看清物像。如果像偏離視野，可慢慢調(diào)節(jié)載物臺移動手柄。瞳距調(diào)節(jié)：左右推拉目鏡，使兩目鏡距離與自己兩眼距離相等。屈光度調(diào)節(jié)高倍物鏡觀察：把物像中需要放大觀察的部分移至視野中央。將高倍物鏡轉(zhuǎn)入光路（一般具有正常功能的顯微鏡，低倍物鏡和高倍物鏡基本齊焦，在用低倍物鏡觀察清晰時(shí)，換高倍物鏡應(yīng)可以見到物像，但物像不一定很清晰），微動調(diào)焦手輪進(jìn)行調(diào)節(jié)。根據(jù)需要調(diào)節(jié)孔徑光闌的大小或聚光器的高低，使光線符合要求（一般將低倍物鏡換成高倍物鏡觀察時(shí)，視野要稍變暗一些，所以需要調(diào)節(jié)光線強(qiáng)弱）。觀察完畢，應(yīng)先將物鏡鏡頭從通光孔處移開，并檢查物鏡是否沾水沾油，檢查處理完畢后即可裝箱。瞳距調(diào)節(jié)屈光度調(diào)節(jié)

6.光學(xué)顯微分析在材料科學(xué)中的應(yīng)用光學(xué)顯微分析是利用可見光觀察物體的表面形貌和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，鑒定晶體的光學(xué)性質(zhì)。利用偏光顯微鏡和金相顯微鏡進(jìn)行晶體光學(xué)鑒定，是研究材料的重要方法之一。透明晶體的觀察可利用透射顯微鏡，如偏光顯微鏡。不透明物體只能使用反射式顯微鏡，即金相顯微鏡。（不采用蓋玻片，照明光束從上面照射非透明物體）偏光顯微鏡偏光顯微鏡的構(gòu)成XPT-7型偏光顯微鏡利用偏光顯微鏡的各部件可以組合成單偏光、正交偏光、錐光等光學(xué)分析系統(tǒng)→鑒定透明晶體光學(xué)性質(zhì)。1—目鏡， 2—鏡筒，3—勃氏鏡， 4—粗動手輪，5—微調(diào)手輪， 6—鏡臂，7—鏡座， 8—上偏光鏡，9—試板孔， 10—物鏡，11—載物臺， 12—聚光鏡，13—鎖光圈， 14—下偏光鏡，15—反光鏡透射光顯微鏡（偏光顯微鏡）的應(yīng)用（無機(jī)材料）研究玻璃材料：鑒定玻璃結(jié)石的種類和成因在陶瓷、水泥、耐火材料中：如陶瓷巖相分析在高分子材料上：高分子結(jié)晶針狀、棒狀鱗石英雪花狀鱗石英

管柱狀鱗石英

鱗石英的矛頭雙晶

偏光顯微鏡-PHB（聚-β-羥丁酸）在不同溫度下的結(jié)晶形態(tài)（μm級）

500C700C750C

800C1100C1300C

方法：偏光顯微鏡（250倍），熔融壓片。

純PP未處理（6phr）處理(6phr)

方法：偏光顯微鏡（250倍），熔融壓片。

結(jié)論：納米無機(jī)粒子的加入，使體系球晶尺寸變小，經(jīng)表面處理后情況更明顯。偏光顯微鏡-納米CaCO3對PP聚丙烯球晶尺寸的影響（μm級）光學(xué)金相顯微鏡—PP/納米TiO2

（表面紫外光老化后結(jié)構(gòu)變化）反光顯微鏡反光顯微鏡在材料科學(xué)中的應(yīng)用（金屬、無機(jī)非金屬）水泥熟料的研究研究不透明晶體（薄片厚度在0.03mm時(shí)）的光學(xué)性質(zhì)。反光顯微鏡的構(gòu)造：鏡座、鏡臂、鏡筒、載物臺、物鏡、目鏡、調(diào)焦手輪、光源、視場光闌、孔徑光闌。金相顯微鏡金相顯微鏡垂直照明器構(gòu)成：反射器、前偏光鏡、孔徑光闌、視場光闌等部件組成作用：把從光源來的入射光通過物鏡垂直投射到光片表面，再把光片表面反射回來的光投射到目鏡焦平面內(nèi)。A礦的六角板狀結(jié)構(gòu)B礦的圓形結(jié)構(gòu)玻璃配合料高溫熔融過程光學(xué)顯微分析樣品的制備合格光片樣品的條件：能代表所要研究的對象；光片的檢測面平整光滑；能顯示所要研究的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)。光片的制作的一般過程：

取樣：鋸、車、刨、砂輪切割；避免局部過熱或變形鑲嵌：機(jī)械夾持法、塑料鑲嵌法、低熔點(diǎn)鑲嵌法磨光：去除取樣時(shí)引入樣品表面的損傷拋光：去除細(xì)磨痕和變形層，以獲得平整無疵的鏡面（機(jī)械拋光、電解拋光、化學(xué)拋光）浸蝕：清晰顯示材料的內(nèi)部組織，并去除拋光引起的變形層（化學(xué)浸蝕、電解浸蝕、物理蝕刻法