紫外可見分光光度法快速確定細(xì)菌菌液的濃度

紫外可見分光光度法快速確定細(xì)菌菌液的濃度一、本文概述細(xì)菌濃度的快速準(zhǔn)確測定在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測和食品工業(yè)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法，如平板菌落計(jì)數(shù)法，雖然準(zhǔn)確，但耗時(shí)較長，不利于快速響應(yīng)和在線監(jiān)測。近年來，紫外可見分光光度法因其操作簡便、快速且成本較低等優(yōu)點(diǎn)，逐漸受到研究者的關(guān)注。本文旨在探討紫外可見分光光度法在快速確定細(xì)菌菌液濃度中的應(yīng)用，分析該方法的原理、操作步驟、影響因素及實(shí)際應(yīng)用，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究和實(shí)踐提供有益的參考。本文首先介紹了紫外可見分光光度法的基本原理及其在細(xì)菌濃度測定中的應(yīng)用背景。隨后，詳細(xì)闡述了實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)步驟的操作以及數(shù)據(jù)處理和分析方法。在此基礎(chǔ)上，通過實(shí)例分析，探討了影響紫外可見分光光度法測定細(xì)菌濃度的主要因素，如菌液類型、波長選擇、測定時(shí)間等。結(jié)合實(shí)際應(yīng)用案例，展示了該方法在細(xì)菌濃度快速測定中的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。本文旨在為讀者提供一個(gè)全面、系統(tǒng)的紫外可見分光光度法快速確定細(xì)菌菌液濃度的理論和實(shí)踐指南，以期為相關(guān)領(lǐng)域的研究和實(shí)踐提供有益的參考和借鑒。二、紫外可見分光光度法基本原理紫外可見分光光度法是一種基于物質(zhì)對紫外和可見光區(qū)域特定波長光的吸收性質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。該方法主要依賴于物質(zhì)內(nèi)部的分子或離子在受到紫外和可見光照射時(shí)，會(huì)吸收一定波長的光能量，導(dǎo)致光的強(qiáng)度減弱。這種光吸收現(xiàn)象與物質(zhì)的濃度之間存在一定的關(guān)系，即比爾-朗伯定律（Beer-LambertLaw），該定律指出，當(dāng)一束單色光通過一均勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí)，其吸光度（A）與吸光物質(zhì)的濃度（c）及吸收層厚度（b）成正比。在細(xì)菌菌液濃度測定中，紫外可見分光光度法主要利用細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)某些成分（如核酸、蛋白質(zhì)等）對特定波長的紫外光具有吸收作用。隨著菌液濃度的增加，這些成分的含量也相應(yīng)增加，從而導(dǎo)致對紫外光的吸收增強(qiáng)。因此，通過測量菌液在不同波長下的吸光度，可以間接推斷出菌液的濃度。需要注意的是，紫外可見分光光度法測定的菌液濃度是一個(gè)相對值，而非絕對濃度。由于不同種類的細(xì)菌其細(xì)胞成分和結(jié)構(gòu)可能存在差異，因此在實(shí)際應(yīng)用中可能需要根據(jù)具體菌種選擇合適的波長進(jìn)行測定，并結(jié)合其他方法進(jìn)行綜合判斷。紫外可見分光光度法以其快速、簡便、靈敏的特點(diǎn)，在細(xì)菌菌液濃度測定中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。通過合理選擇和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，可以獲得較為準(zhǔn)確的結(jié)果，為后續(xù)的細(xì)菌學(xué)研究和應(yīng)用提供有力支持。三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟取一定體積的細(xì)菌菌液，用蒸餾水或生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)稀釋，以確保菌液在分光光度計(jì)的檢測范圍內(nèi)。根據(jù)細(xì)菌菌液的光學(xué)特性，選擇合適的波長進(jìn)行測定。通常，600nm是常用的波長，因?yàn)樗梢苑从炒蠖鄶?shù)細(xì)菌的密度。在紫外可見分光光度計(jì)上，使用蒸餾水或生理鹽水作為空白對照，調(diào)整儀器至零位。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件和菌液的稀釋倍數(shù)，將吸光度值轉(zhuǎn)換為菌液濃度。這通常涉及到一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，該曲線描述了吸光度與菌液濃度的關(guān)系。如有條件，還可以使用其他方法（如菌落計(jì)數(shù)法）來驗(yàn)證紫外可見分光光度法的結(jié)果。通過以上實(shí)驗(yàn)方法與步驟，我們可以快速、準(zhǔn)確地確定細(xì)菌菌液的濃度，為后續(xù)的生物學(xué)研究或?qū)嶋H應(yīng)用提供有力支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析本實(shí)驗(yàn)旨在利用紫外可見分光光度法快速確定細(xì)菌菌液的濃度。通過對不同濃度的細(xì)菌菌液進(jìn)行吸光度測定，并對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，我們得到了以下結(jié)果。我們觀察到隨著細(xì)菌菌液濃度的增加，其在特定波長下的吸光度值也相應(yīng)增加。這一趨勢呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，表明紫外可見分光光度法可以用于細(xì)菌菌液濃度的快速測定。通過對比實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線，我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)測得的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線上的對應(yīng)點(diǎn)非常接近。這進(jìn)一步驗(yàn)證了紫外可見分光光度法在細(xì)菌菌液濃度測定中的準(zhǔn)確性和可靠性。我們還發(fā)現(xiàn)該方法的測量范圍較廣，可以適用于不同濃度的細(xì)菌菌液。同時(shí)，該方法具有操作簡便、快速高效、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，為細(xì)菌菌液濃度的快速測定提供了一種有效的手段。然而，需要注意的是，紫外可見分光光度法雖然具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)際應(yīng)用中仍需注意一些潛在的影響因素。例如，菌液中的雜質(zhì)、細(xì)胞形態(tài)和大小等因素可能會(huì)對測定結(jié)果產(chǎn)生一定影響。因此，在使用該方法進(jìn)行細(xì)菌菌液濃度測定時(shí)，應(yīng)盡可能選擇純度高、形態(tài)一致的菌液樣品，以提高測定的準(zhǔn)確性。紫外可見分光光度法是一種快速、簡便、有效的細(xì)菌菌液濃度測定方法。通過本實(shí)驗(yàn)的研究和分析，我們驗(yàn)證了該方法的準(zhǔn)確性和可靠性，為實(shí)際應(yīng)用提供了有力支持。我們也指出了該方法在實(shí)際應(yīng)用中需要注意的問題，為今后的研究提供了有益的參考。五、討論與結(jié)論通過本研究，我們成功地利用紫外可見分光光度法快速確定了細(xì)菌菌液的濃度。這種方法基于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的特定成分（如蛋白質(zhì)、核酸等）在紫外可見光區(qū)域的吸收特性，通過測量吸光度值與濃度的線性關(guān)系，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌濃度的快速、準(zhǔn)確測定。討論部分，我們發(fā)現(xiàn)紫外可見分光光度法與傳統(tǒng)的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法相比，具有更高的效率和準(zhǔn)確性。該方法還具有操作簡便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，我們也注意到該方法可能受到一些因素的干擾，如細(xì)菌的種類、生長狀態(tài)、培養(yǎng)基成分等。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，我們需要根據(jù)具體情況對方法進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和優(yōu)化。結(jié)論部分，我們認(rèn)為紫外可見分光光度法是一種快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的細(xì)菌濃度測定方法，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。未來，我們將繼續(xù)探索該方法的優(yōu)化和改進(jìn)，以進(jìn)一步提高其準(zhǔn)確性和可靠性，為細(xì)菌學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)提供更加便捷、高效的技術(shù)支持。我們也希望該方法能夠在更多領(lǐng)域得到應(yīng)用和推廣，為科學(xué)研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。參考資料：在微生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，準(zhǔn)確測定細(xì)菌菌液的濃度是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟。傳統(tǒng)的菌液濃度測定方法，如肉眼觀察和顯微計(jì)數(shù)，既耗時(shí)又易受主觀因素影響。近年來，紫外可見分光光度法因其快速、準(zhǔn)確和自動(dòng)化的優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為一種廣泛應(yīng)用的替代方法。本文將介紹如何使用紫外可見分光光度法快速確定細(xì)菌菌液的濃度。紫外可見分光光度法是一種基于物質(zhì)對紫外-可見光的吸收特性來進(jìn)行定量分析的方法。當(dāng)光通過溶液時(shí)，某些波長的光會(huì)被吸收，其吸收強(qiáng)度與溶液中分子的濃度和性質(zhì)有關(guān)。通過測量溶液對不同波長光的吸收情況，可以確定溶液中物質(zhì)的濃度。對于細(xì)菌菌液，這種方法可以用來測量細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、核酸等）的吸光度，從而間接反映菌液的濃度。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：制備一系列已知濃度的細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)溶液，測量其在特定波長（如600nm）下的吸光度，繪制吸光度與濃度之間的關(guān)系曲線。測量未知菌液：將未知濃度的細(xì)菌菌液在相同波長下測量吸光度，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其濃度。計(jì)算：通過比較未知菌液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出未知菌液的濃度。波長的選擇：選擇合適的測量波長是關(guān)鍵，通常選擇最大吸收峰附近的波長以提高測量的靈敏度和準(zhǔn)確性。避免渾濁和顆粒物的影響：如果菌液中含有大量的顆粒物或渾濁物，可能會(huì)影響吸光度的測量，需要預(yù)先過濾或離心處理。菌液的生長階段：盡量在菌液的對數(shù)生長期進(jìn)行測量，因?yàn)檫@個(gè)階段的細(xì)菌細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的含量相對穩(wěn)定。校正背景吸光度：在測量未知菌液之前，需要先測量空白溶液（如生理鹽水或培養(yǎng)基）的吸光度，以校正背景干擾。紫外可見分光光度法是一種快速、準(zhǔn)確測定細(xì)菌菌液濃度的有效方法。通過制備標(biāo)準(zhǔn)曲線和測量未知菌液的吸光度，可以快速確定細(xì)菌菌液的濃度。這種方法不僅提高了實(shí)驗(yàn)效率，而且減少了人為誤差和主觀因素的影響。在微生物學(xué)、生物技術(shù)和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域中，紫外可見分光光度法已成為測定細(xì)菌菌液濃度的常用手段，有助于推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域的研究和發(fā)展。紫外-可見分光光度法是在190～800nm波長范圍內(nèi)測定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測定的方法。當(dāng)光穿過被測物質(zhì)溶液時(shí)，物質(zhì)對光的吸收程度隨光的波長不同而變化。因此，通過測定物質(zhì)在不同波長處的吸光度，并繪制其吸光度與波長的關(guān)系圖即得被測物質(zhì)的吸收光譜。從吸收光譜中，可以確定最大吸收波長λmax和最小吸收波長λmin。物質(zhì)的吸收光譜具有與其結(jié)構(gòu)相關(guān)的特征性。因此，可以通過特定波長范圍內(nèi)樣品的光譜與對照光譜或?qū)φ掌饭庾V的比較，或通過確定最大吸收波長，或通過測量兩個(gè)特定波長處的吸收比值而鑒別物質(zhì)。用于定量時(shí)，在最大吸收波長處測量一定濃度樣品溶液的吸光度，并與一定濃度的對照溶液的吸光度進(jìn)行比較或采用吸收系數(shù)法求算出樣品溶液的濃度。光譜法（spectrometry）是基于物質(zhì)與電磁輻射作用時(shí)，測量由物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化的能級之間的躍遷而產(chǎn)生的發(fā)射、吸收或散射輻射的波長和強(qiáng)度進(jìn)行分析的方法。光譜法可分為發(fā)射光譜法、吸收光譜法、散射光譜法；或分為原子光譜法和分子光譜法；或分為能級譜，電子、振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)光譜，電子自旋及核自旋譜等。分光光度法是光譜法的重要組成部分，是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的吸光度或發(fā)光強(qiáng)度，對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。常用的技術(shù)包括紫外-可見分光光度法、紅外分光光度法、熒光分光光度法和原子吸收分光光度法等。紫外-可見分光光度法是在190～800nm波長范圍內(nèi)測定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測定的方法。單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時(shí)，在一定的濃度范圍內(nèi)被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關(guān)系可以用朗伯-比爾定律表述如下：E為吸收系數(shù)，常用的表示方法，其物理意義為當(dāng)溶液濃度為1%（g/ml）,液層厚度為1cm時(shí)的吸光度數(shù)值；c為100ml溶液中所含物質(zhì)的重量（按干燥品或無水物計(jì)算），g；上述公式中吸收系數(shù)也可以摩爾吸收系數(shù)ε來表示，其物理意義為溶液濃度c為1mol/L和液層厚度為1cm時(shí)的吸光度數(shù)值。在最大吸收波長處摩爾吸收系數(shù)表示為εmax。物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。在一定條件下，物質(zhì)的吸收系數(shù)是恒定的，且與入射光的強(qiáng)度、吸收池厚度及樣品濃度無關(guān)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后，可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸光度，即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收，但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定，故又稱之為比色分析。紫外-可見分光光度計(jì)由5個(gè)部件組成：①輻射源。必須具有穩(wěn)定的、有足夠輸出功率的、能提供儀器使用波段的連續(xù)光譜，如鎢燈、鹵鎢燈（波長范圍350～2500納米），氘燈或氫燈（180～460納米），或可調(diào)諧染料激光光源等。②單色器。它由入射、出射狹縫、透鏡系統(tǒng)和色散元件（棱鏡或光柵）組成，是用以產(chǎn)生高純度單色光束的裝置，其功能包括將光源產(chǎn)生的復(fù)合光分解為單色光和分出所需的單色光束。③試樣容器，又稱吸收池。供盛放試液進(jìn)行吸光度測量之用，分為石英池和玻璃池兩種，前者適用于紫外到可見區(qū)，后者只適用于可見區(qū)。容器的光程一般為5～10厘米。④檢測器，又稱光電轉(zhuǎn)換器。常用的有光電管或光電倍增管，后者較前者更靈敏，特別適用于檢測較弱的輻射。近年來還使用光導(dǎo)攝像管或光電二極管矩陣作檢測器，具有快速掃描的特點(diǎn)。⑤顯示裝置。這部分裝置發(fā)展較快。較高級的光度計(jì)，常備有微處理機(jī)、熒光屏顯示和記錄儀等，可將圖譜、數(shù)據(jù)和操作條件都顯示出來。儀器類型則有：單波長單光束直讀式分光光度計(jì)，單波長雙光束自動(dòng)記錄式分光光度計(jì)和雙波長雙光束分光光度計(jì)。應(yīng)用范圍包括：①定量分析，廣泛用于各種物料中微量、超微量和常量的無機(jī)和有機(jī)物質(zhì)的測定。②定性和結(jié)構(gòu)分析，紫外吸收光譜還可用于推斷空間阻礙效應(yīng)、氫鍵的強(qiáng)度、互變異構(gòu)、幾何異構(gòu)現(xiàn)象等。③反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，即研究反應(yīng)物濃度隨時(shí)間而變化的函數(shù)關(guān)系，測定反應(yīng)速度和反應(yīng)級數(shù)，探討反應(yīng)機(jī)理。④研究溶液平衡，如測定絡(luò)合物的組成，穩(wěn)定常數(shù)、酸堿離解常數(shù)等。由于環(huán)境因素對機(jī)械部分的影響，儀器的波長經(jīng)常會(huì)略有變動(dòng)，因此除應(yīng)定期對所用的儀器進(jìn)行全面校正檢定外，還應(yīng)于測定前校正測定波長。常用汞燈中的較強(qiáng)譜線83nm，65nm，28nm，73nm，16nm，15nm，02nm，66nm，83nm，07nm與96nm；或用儀器中氘燈的02nm與10nm譜線進(jìn)行校正；鈥玻璃在波長4nm，5nm，7nm，9nm，5nm，0nm，5nm，2nm與5nm處有尖銳吸收峰，也可作波長校正用，但因來源不同或隨著時(shí)間的推移會(huì)有微小的變化，使用時(shí)應(yīng)注意；近年來，常使用高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器，以10%高氯酸溶液為溶劑，配制含氧化鈥（Ho203）4%的溶液，該溶液的吸收峰波長為13nm，10nm，18nm，44nm，47nm，31nm，28nm，30nm，29nm，64nm和52nm。儀器波長的允許誤差為：紫外光區(qū)±1nm，500nm附近±2nm?？捎弥劂t酸鉀的硫酸溶液檢定。取在120℃干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀約60mg，精密稱定，用005mol/L硫酸溶液溶解并稀釋至1000ml，在規(guī)定的波長處測定并計(jì)算其吸收系數(shù)，并與規(guī)定的吸收系數(shù)比較，應(yīng)符合表中的規(guī)定。中未顯示公式吸收系數(shù)?？砂聪卤硭械脑噭┖蜐舛?，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在規(guī)定的波長處測定透光率，應(yīng)符合表中的規(guī)定。含有雜原子的有機(jī)溶劑，通常均具有很強(qiáng)的末端吸收。因此，當(dāng)作溶劑使用時(shí)，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長。例如甲醇、乙醇的截止使用波長為205nm。另外，當(dāng)溶劑不純時(shí)，也可能增加干擾吸收。因此，在測定供試品前，應(yīng)先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近是否符合要求，即將溶劑置1cm石英吸收池中，以空氣為空白（即空白光路中不置任何物質(zhì)）測定其吸光度。溶劑和吸收池的吸光度，在220～240nm范圍內(nèi)不得超過40，在241～250nm范圍內(nèi)不得超過20，在251～300nm范圍內(nèi)不得超過10，在300nm以上時(shí)不得超過05。測定時(shí)，除另有規(guī)定外，應(yīng)以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰波長±2nm以內(nèi)測試幾個(gè)點(diǎn)的吸光度，或由儀器在規(guī)定波長附近自動(dòng)掃描測定，以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確，除另有規(guī)定外，吸收峰波長應(yīng)在該品種項(xiàng)下規(guī)定的波長±2nm以內(nèi)，并以吸光度最大的波長作為測定波長。一般供試品溶液的吸收度讀數(shù)，以在3～7之間為宜。儀器的狹縫波帶寬度宜小于供試品吸收帶的半寬度的十分之一，否則測得的吸光度會(huì)偏低；狹縫寬度的選擇，應(yīng)以減小狹縫寬度時(shí)供試品的吸收度不再增大為準(zhǔn)，由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸光度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，或由儀器自動(dòng)扣除空白讀數(shù)后再計(jì)算含量。當(dāng)溶液的pH值對測定結(jié)果有影響時(shí)，應(yīng)將供試品溶液的pH值和對照品溶液的pH值調(diào)成一致。按各品種項(xiàng)下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應(yīng)為供試品溶液中被測成分規(guī)定量的100%±10%，所用溶劑也應(yīng)完全一致，在規(guī)定的波長測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度后，按下式計(jì)算供試品中被測溶液的濃度∶按各品種項(xiàng)下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計(jì)算含量。用本法測定時(shí)，吸收系數(shù)通常應(yīng)大于100，并注意儀器的校正和檢定。計(jì)算分光光度法有多種，使用時(shí)應(yīng)按各品種項(xiàng)下規(guī)定的方法進(jìn)行。當(dāng)吸光度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定時(shí)，波長的微小變化可能對測定結(jié)果造成顯著影響，故對照品和供試品的測試條件應(yīng)盡可能一致。計(jì)算分光光度法一般不宜用作含量測定。供試品本身在紫外-可見光區(qū)沒有強(qiáng)吸收，或在紫外光區(qū)雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當(dāng)?shù)娘@色劑，使反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收移至可見光區(qū)，這種測定方法稱為比色法。用比色法測定時(shí)，應(yīng)取數(shù)份梯度量的對照品溶液，用溶劑補(bǔ)充至同一體積，顯色后，以相應(yīng)試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長處測定各份溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)供試品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得其相應(yīng)的濃度，并求出其含量。也可取對照品溶液與供試品溶液同時(shí)操作，顯色后，以相應(yīng)的試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長處測定對照品和供試品溶液的吸光度，按上述（1）法計(jì)算供試品溶液的濃度。除另有規(guī)定外，比色法所用空白系指用同體積溶劑代替對照品或供試品溶液，然后依次加入等量的相應(yīng)試劑，并用同樣方法處理制得。紫外-可見分光光度法是在190～800nm波長范圍內(nèi)測定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測定的方法。當(dāng)光穿過被測物質(zhì)溶液時(shí)，物質(zhì)對光的吸收程度隨光的波長不同而變化。因此，通過測定物質(zhì)在不同波長處的吸光度，并繪制其吸光度與波長的關(guān)系圖即得被測物質(zhì)的吸收光譜。從吸收光譜中，可以確定最大吸收波長λmax和最小吸收波長λmin。物質(zhì)的吸收光譜具有與其結(jié)構(gòu)相關(guān)的特征性。因此，可以通過特定波長范圍內(nèi)樣品的光譜與對照光譜或?qū)φ掌饭庾V的比較，或通過確定最大吸收波長，或通過測量兩個(gè)特定波長處的吸收比值而鑒別物質(zhì)。用于定量時(shí)，在最大吸收波長處測量一定濃度樣品溶液的吸光度，并與一定濃度的對照溶液的吸光度進(jìn)行比較或采用吸收系數(shù)法求算出樣品溶液的濃度。光譜法（spectrometry）是基于物質(zhì)與電磁輻射作用時(shí)，測量由物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化的能級之間的躍遷而產(chǎn)生的發(fā)射、吸收或散射輻射的波長和強(qiáng)度進(jìn)行分析的方法。光譜法可分為發(fā)射光譜法、吸收光譜法、散射光譜法；或分為原子光譜法和分子光譜法；或分為能級譜，電子、振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)光譜，電子自旋及核自旋譜等。分光光度法是光譜法的重要組成部分，是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的吸光度或發(fā)光強(qiáng)度，對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。常用的技術(shù)包括紫外-可見分光光度法、紅外分光光度法、熒光分光光度法和原子吸收分光光度法等。紫外-可見分光光度法是在190～800nm波長范圍內(nèi)測定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測定的方法。單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時(shí)，在一定的濃度范圍內(nèi)被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關(guān)系可以用朗伯-比爾定律表述如下：E為吸收系數(shù)，常用的表示方法，其物理意義為當(dāng)溶液濃度為1%（g/ml）,液層厚度為1cm時(shí)的吸光度數(shù)值；c為100ml溶液中所含物質(zhì)的重量（按干燥品或無水物計(jì)算），g；上述公式中吸收系數(shù)也可以摩爾吸收系數(shù)ε來表示，其物理意義為溶液濃度c為1mol/L和液層厚度為1cm時(shí)的吸光度數(shù)值。在最大吸收波長處摩爾吸收系數(shù)表示為εmax。物質(zhì)對光的選擇性吸收波長，以及相應(yīng)的吸收系數(shù)是該物質(zhì)的物理常數(shù)。在一定條件下，物質(zhì)的吸收系數(shù)是恒定的，且與入射光的強(qiáng)度、吸收池厚度及樣品濃度無關(guān)。當(dāng)已知某純物質(zhì)在一定條件下的吸收系數(shù)后，可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸光度，即可由上式計(jì)算出供試品中該物質(zhì)的含量。在可見光區(qū)，除某些物質(zhì)對光有吸收外，很多物質(zhì)本身并沒有吸收，但可在一定條件下加入顯色試劑或經(jīng)過處理使其顯色后再測定，故又稱之為比色分析。紫外-可見分光光度計(jì)由5個(gè)部件組成：①輻射源。必須具有穩(wěn)定的、有足夠輸出功率的、能提供儀器使用波段的連續(xù)光譜，如鎢燈、鹵鎢燈（波長范圍350～2500納米），氘燈或氫燈（180～460納米），或可調(diào)諧染料激光光源等。②單色器。它由入射、出射狹縫、透鏡系統(tǒng)和色散元件（棱鏡或光柵）組成，是用以產(chǎn)生高純度單色光束的裝置，其功能包括將光源產(chǎn)生的復(fù)合光分解為單色光和分出所需的單色光束。③試樣容器，又稱吸收池。供盛放試液進(jìn)行吸光度測量之用，分為石英池和玻璃池兩種，前者適用于紫外到可見區(qū)，后者只適用于可見區(qū)。容器的光程一般為5～10厘米。④檢測器，又稱光電轉(zhuǎn)換器。常用的有光電管或光電倍增管，后者較前者更靈敏，特別適用于檢測較弱的輻射。近年來還使用光導(dǎo)攝像管或光電二極管矩陣作檢測器，具有快速掃描的特點(diǎn)。⑤顯示裝置。這部分裝置發(fā)展較快。較高級的光度計(jì)，常備有微處理機(jī)、熒光屏顯示和記錄儀等，可將圖譜、數(shù)據(jù)和操作條件都顯示出來。儀器類型則有：單波長單光束直讀式分光光度計(jì)，單波長雙光束自動(dòng)記錄式分光光度計(jì)和雙波長雙光束分光光度計(jì)。應(yīng)用范圍包括：①定量分析，廣泛用于各種物料中微量、超微量和常量的無機(jī)和有機(jī)物質(zhì)的測定。②定性和結(jié)構(gòu)分析，紫外吸收光譜還可用于推斷空間阻礙效應(yīng)、氫鍵的強(qiáng)度、互變異構(gòu)、幾何異構(gòu)現(xiàn)象等。③反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，即研究反應(yīng)物濃度隨時(shí)間而變化的函數(shù)關(guān)系，測定反應(yīng)速度和反應(yīng)級數(shù)，探討反應(yīng)機(jī)理。④研究溶液平衡，如測定絡(luò)合物的組成，穩(wěn)定常數(shù)、酸堿離解常數(shù)等。由于環(huán)境因素對機(jī)械部分的影響，儀器的波長經(jīng)常會(huì)略有變動(dòng)，因此除應(yīng)定期對所用的儀器進(jìn)行全面校正檢定外，還應(yīng)于測定前校正測定波長。常用汞燈中的較強(qiáng)譜線83nm，65nm，28nm，73nm，16nm，15nm，02nm，66nm，83nm，07nm與96nm；或用儀器中氘燈的02nm與10nm譜線進(jìn)行校正；鈥玻璃在波長4nm，5nm，7nm，9nm，5nm，0nm，5nm，2nm與5nm處有尖銳吸收峰，也可作波長校正用，但因來源不同或隨著時(shí)間的推移會(huì)有微小的變化，使用時(shí)應(yīng)注意；近年來，常使用高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器，以10%高氯酸溶液為溶劑，配制含氧化鈥（Ho203）4%的溶液，該溶液的吸收峰波長為13nm，10nm，18nm，44nm，47nm，31nm，28nm，30nm，29nm，64nm和52nm。儀器波長的允許誤差為：紫外光區(qū)±1nm，500nm附近±2nm。可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。取在120℃干燥至恒重的基準(zhǔn)重鉻酸鉀約60mg，精密稱定，用005mol/L硫酸溶液溶解并稀釋至1000ml，在規(guī)定的波長處測定并計(jì)算其吸收系數(shù)，并與規(guī)定的吸收系數(shù)比較，應(yīng)符合表中的規(guī)定。中未顯示公式吸收系數(shù)?？砂聪卤硭械脑噭┖蜐舛龋渲瞥伤芤?，置1cm石英吸收池中，在規(guī)定的波長處測定透光率，應(yīng)符合表中的規(guī)定。含有雜原子的有機(jī)溶劑，通常均具有很強(qiáng)的末端吸收。因此，當(dāng)作溶劑使用時(shí)，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長。例如甲醇、乙醇的截止使用波長為205nm。另外，當(dāng)溶劑不純時(shí)，也可能增加干擾吸收。因此，在測定供試品前，應(yīng)先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近是否符合要求，即將溶劑置1cm石英吸收池中，以空氣為空白（即空白光路中不置任何物質(zhì)）測定其吸光度。溶劑和吸收池的吸光度，在220～240nm范圍內(nèi)不得超過40，在241～250nm范圍內(nèi)不得超過20，在251～300nm范圍內(nèi)不得超過10，在300nm以上時(shí)不得超過05。測定時(shí)，除另有規(guī)定外，應(yīng)以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰波長±2nm以內(nèi)測試幾個(gè)點(diǎn)的吸光度，或由儀器在規(guī)定波長附近自動(dòng)掃描測定，以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確，除另有規(guī)定外，吸收峰波長應(yīng)在該品種項(xiàng)下規(guī)定的波長±2nm以內(nèi)，并以吸光度最大的波長作為測定波長。一般供試品溶液的吸收度讀數(shù)，以在3～7之間為宜。儀器的狹縫波帶寬度宜小于供試品吸收帶的半寬度的十分之一，否則測得的吸光度會(huì)偏低；狹縫寬度的選擇，應(yīng)以減小狹縫寬度時(shí)供試品的吸收度不再增大為準(zhǔn)，由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸光度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，或由儀器自動(dòng)扣除空白讀數(shù)后再計(jì)算含量。當(dāng)溶液的pH值對測定結(jié)果有影響時(shí)，應(yīng)將供試品溶液的pH值和對照品溶液的pH值調(diào)成一致。按各品種項(xiàng)下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應(yīng)為供試品