豬傳染性胃腸炎病毒膠體金免疫層析試紙條的研制的開題報告

豬傳染性胃腸炎病毒膠體金免疫層析試紙條的研制的開題報告一、研究背景及意義豬傳染性胃腸炎（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）是一種由豬傳染性胃腸炎病毒引起的急性胃腸炎癥，導(dǎo)致豬嶄瀉、嘔吐、消瘦，尤其是對幼豬的危害更為嚴重，經(jīng)常造成大量的豬只死亡。2013年至2014年P(guān)ED在中國迅速傳播，給我國畜牧業(yè)和經(jīng)濟帶來了嚴重的損失。因此，如何及早發(fā)現(xiàn)PED的感染情況，對于保障養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)、實現(xiàn)養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前，PED的診斷主要以病原學(xué)檢測為基礎(chǔ)，包括病毒抗體檢測和核酸檢測。PCR、實時熒光PCR、細胞培養(yǎng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗等被廣泛用于PED的檢測，但由于這些方法需要高昂的設(shè)備和專業(yè)人員，不利于現(xiàn)場快速診斷，因此需要開發(fā)一種簡便、快速、經(jīng)濟、敏感和特異性較好的PED檢測方法。現(xiàn)有的研究表明，利用膠體金技術(shù)和免疫層析技術(shù)結(jié)合，可以制備出一種簡便、快速、經(jīng)濟、敏感和特異性較好的PED檢測方法，包括PED膠體金免疫層析試紙條。這種試紙條不需要顯微鏡觀察，只需要通過肉眼觀察檢測結(jié)果即可，能夠滿足現(xiàn)場檢測的需求。因此，本研究擬開發(fā)PED膠體金免疫層析試紙條，以期提高PED的診斷水平，為養(yǎng)豬業(yè)提供更好的保障。二、研究內(nèi)容及方法1.PED病毒抗原的克隆和表達：通過PCR擴增PED病毒N基因，并將其克隆到表達載體pET28a(+)中，利用大腸桿菌表達PED病毒N基因。采用親和層析和SDS等方法提取純化重組蛋白；2.PED膠體金免疫層析試紙條的研制：將制備的PED病毒N蛋白標記在膠體金顆粒表面，制備PED膠體金。將制備的PED膠體金涂覆在膜的測試線位，根據(jù)PED病毒N蛋白的特異性，將抗PED病毒的單克隆抗體固定在紙條的測試線位上。同時，將抗雞IgG的單克隆抗體固定在控制線位上。制備PED膠體金免疫層析試紙條。3.PED膠體金免疫層析試紙條的性能評價：測量PED膠體金免疫層析試紙條的檢測限、特異性和靈敏度；通過實驗比較PED膠體金免疫層析試紙條和PCR、實時熒光PCR等方法的檢測結(jié)果并進行統(tǒng)計學(xué)分析，評價PED膠體金免疫層析試紙條的準確度、去假陽性率和去假陰性率等。三、預(yù)期結(jié)果1.成功克隆和表達PED病毒N基因，制備出PED病毒N蛋白；2.研發(fā)出PED膠體金免疫層析試紙條，在性能評價中取得較好的檢測限、特異性和靈敏度；3.通過與PCR、實時熒光PCR等方法比較，證明PED膠體金免疫層析試紙條具有較好的準確度、去假陽性率和去假陰性率；4.為PED的快速診斷提供了一種簡便、快速、經(jīng)濟、敏感和特異性較好的檢測方法，為我國的養(yǎng)豬業(yè)提供更好的保障。四、研究經(jīng)費本研究的經(jīng)費主要用于病毒抗原克隆和表達、試紙制備、試紙性能評價以及試紙在PED檢測中的應(yīng)用等方面，總經(jīng)費預(yù)計為XX萬元。五、研究時間本研究的預(yù)計時間為XX個月。六、研究人員及分工1.分子生物學(xué)實驗：X、X、X等；2.免疫學(xué)實驗：X、X、X等；3.測定和數(shù)據(jù)分析：X、X等。七、研究進度計劃1.第1-6個月：病毒抗原克隆和表達，制備出PED病毒N蛋白，并制備出PED膠體金；2.第7-10個月：試紙制備，制備出PED膠體金免疫層析試紙條；3.第11-14個月：性能評價，通過實驗證明PED膠體金免