第五講基因定點誘變技術

第五講基因定點誘變技術第1頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月M.Smith（加拿大生物化學家）1993年諾貝爾化學獎，1978年發(fā)明了寡核苷酸定點誘變技術。利用寡核苷酸定點誘變技術，可以認為地通過基因的改變來修飾、改造某一已知的蛋白質，從而可以研究蛋白質的結構及其與功能的關系、蛋白質之間的相互作用。寡核苷酸定點誘變技術第2頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月基因誘變的應用1結構和功能2基因的注釋3代謝途徑-分子育種4蛋白質的修飾5分子設計-分子進化工程第3頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月缺失誘變1簡單缺失通過對DNA片段中具有的相應的酶切位點進行切割，而后用T4連接酶進行連接。2系統(tǒng)缺失核酸外切酶III、S1核酸酶、Klenow大片段第4頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月插入突變1人工合成片段2Transposoninsertion（Tn5）3同源重組4PCR第5頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月基因的體外誘變第6頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月Kunkel法或稱”U”法

dut-：dUTP酶（dUTPase）缺陷，細胞不能把dUTP轉化為dUMP,因此細胞內dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下有“T”占據的位置。

ung-：UDG酶缺陷，UDG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）可除去DNA中的尿嘧啶第7頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月E.Coli（dut-，ung-）合成的DNA中含有尿嘧啶，M13噬菌體DNA中將含有20-30個尿嘧啶堿基。CJ236(dut-，ung-，F+

)第8頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月ssDNA制備載體1單鏈噬菌體載體M132phagemid載體-輔助噬菌體第9頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月所用酶類T4噬菌體聚合酶：誘變幾率65%T7噬菌體聚合酶：3‘-5’外切活性強，持續(xù)合成DNA的能力強，遇到引物時會停止。誘變幾率83%KlenowDNA聚合酶：前端有引物或雙鏈時，可能會替換。誘變幾率36%第10頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月影響因素1引物：熱動力學（配對），突變堿基的左右8-10bp2T4連接酶35’端磷酸化4單鏈結合蛋白：解決頸環(huán)結構第11頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月基因擴增（geneamplification）

主要內容：1.體外擴增2.通過體外重組和轉化，將目的基因在宿主細胞進行擴增3.在環(huán)境作用下，生物體內相關基因的擴增。4.程序基因擴增5.進化過程中的基因擴增第12頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術在1983年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的科學家K.B.Mullis發(fā)明的。PCR是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，有稱之為體外擴增法。第13頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補鏈引物1互補鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補鏈引物2互補鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈式反應示意圖(e)(f)(g)第14頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應的溫度循環(huán)周期PCR反應的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應延伸三個步驟完成的。圖中設定的反應參數是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復始，重復進行，直至擴增產物的數量滿足實驗需求為止。第15頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月ReactionConditionforaTypicalPCRAssay第16頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月TypicalPCRThermalProfile*ThiscycleisnormallyincludedinaPCRassayinordertoallowany“unfinished”productfrompreviousamplificationtoachieveitsfulllength第17頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月SomeDNAPolymerasesUsedinPCR第18頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月CharacteristicsofTaqPolymerase

第19頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR引物：與待擴增的靶DNA區(qū)段兩端序列互補的人工合成的寡核苷酸片斷。1.其長度通常在15~30個核苷酸之間。2.簡并引物atggctant…3.嵌套引物PCR擴增的長度：<2kb第20頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術的應用：1.基因組克隆突變體的鑒定和在PCR過程中有目的的添加核算序列。第21頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月第22頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月反相PCR(reversePCR)與染色體步移第23頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月不對稱PCR(asymmertricPCR)用來制備單