核桃殼中黃嘌呤氧化酶抑制活性物質(zhì)的分離鑒定及構(gòu)效關(guān)系的研究

核桃殼中黃嘌呤氧化酶抑制活性物質(zhì)的分離鑒定及構(gòu)效關(guān)系的研究高尿酸血癥是人類常見的代謝疾病,會導(dǎo)致關(guān)節(jié)和腎臟形成尿酸鹽結(jié)晶,同時會增加患痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、尿酸腎石病、心血管疾病和高血壓等的風(fēng)險。黃嘌呤氧化酶是嘌呤代謝的關(guān)鍵酶,該酶可以催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為黃嘌呤,進而將黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸,與高尿酸血癥的形成息息相關(guān)。因而服用黃嘌呤氧化酶抑制劑是治療高尿酸血癥的非常有效的方法之一。但是,目前廣泛使用的臨床藥物別嘌呤醇會導(dǎo)致一系列副作用,例如過敏反應(yīng)、Steven-Johnson癥狀和腎臟毒性等,因此治療高尿酸血癥需要更加安全有效的黃嘌呤氧化酶抑制劑。文獻報道表明植物中的天然活性物質(zhì)既是潛在的黃嘌呤氧化酶抑制劑,同時又是良好的抗氧化劑。核桃屬于胡桃科胡桃屬植物,廣泛的分布于世界各地,核桃殼質(zhì)量約占核桃質(zhì)量的30%,核桃加工后會產(chǎn)生大量的核桃殼。本論文研究了核桃殼的提取物的體內(nèi)降尿酸活性,并期望從中尋找出新型的黃嘌呤氧化酶抑制劑,現(xiàn)將主要研究結(jié)果歸納如下:(1)優(yōu)化了評定樣品黃嘌呤氧化酶抑制活性的催化反應(yīng)條件,將測定酚類物質(zhì)的黃嘌呤氧化酶抑制活性的高效液相色譜法和分光光度法進行了對比研究。優(yōu)化后的催化反應(yīng)條件為:底物濃度0.24mM、酶濃度0.01U/mL、催化反應(yīng)溫度25oC、pH值7.5、催化反應(yīng)時間30min和終止反應(yīng)用HCl溶液(1.0M)的體積80μL。兩種方法在尿酸的檢測濃度范圍內(nèi)都具有較好的線性關(guān)系和較高的日內(nèi)精密度,但高效液相色譜法的檢出限和定量限比分光光度法大約低了一個數(shù)量級,靈敏度較高。分光光度法在檢測活性較弱的物質(zhì)或在292nm處有強吸收的酚類物質(zhì)的黃嘌呤氧化酶抑制活性時結(jié)果會偏高。相比之下測定黃嘌呤氧化酶抑制活性的高效液相色譜法消除了干擾,并可以在不控溫的情況下21h內(nèi)檢測有效,每個樣品檢測只需8min,可用于樣品的高通量篩選。同時高效液相法的日間精密度在0.10-1.50%的范圍內(nèi),說明該法具有較高的日間精密度。(2)為了從核桃果實及其副產(chǎn)物中篩選出合適的原料,對核桃果實(青皮、殼和仁)、莖和葉提取物的抗氧化活性和黃嘌呤氧化酶抑制活性進行了對比研究。核桃殼提取率較低(提取率為2.80%),但其提取物的總酚含量(14.81±0.50GAEg/100g,GAE沒食子酸當(dāng)量)最高,抗氧化活性(ORAC3423.44±142.52μmolTE/g,TE為Trolox當(dāng)量,還原力115.86±2.05μg/mL)最優(yōu),黃嘌呤氧化酶抑制活性僅次于核桃青皮提取物(核桃殼和青皮提取物抑制黃嘌呤氧化酶的半數(shù)抑制濃度分別為988.36±31.31μg/mL和616.86±17.84μg/mL),在保健食品工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價值。同時,通過高效液相分析譜圖發(fā)現(xiàn)核桃果實不同部分(青皮、殼和脫脂核桃仁)、莖和葉提取物組成存在著一定的差異,但均具有相同的特征峰,說明這些樣品的主要成分比較接近。(3)探討了核桃殼提取物在高尿酸大鼠體內(nèi)的降尿酸活性,并在體外進行了以黃嘌呤氧化酶抑制活性為導(dǎo)向的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定。按照166mg/kg核桃殼提取物的劑量灌胃大鼠30d,發(fā)現(xiàn)灌胃核桃殼提取物不會影響大鼠的體重;灌胃20d時該組大鼠的血尿酸含量明顯低于模型組大鼠(核桃殼提取物組vs模型組,p<0.05),在30d時血尿酸含量降低到模型組的76.41%(核桃殼提取物組vs模型組,p<0.05),同時大鼠血清中的尿素氮和肌酐含量(核桃殼提取物組vs模型組;尿素氮p<0.01,肌酐p<0.05)明顯降低,說明核桃殼提取物具有體內(nèi)降尿酸活性和腎臟保護作用。以黃嘌呤氧化酶抑制活性為導(dǎo)向進行分離純化,鑒定出了對香豆醛、β-D-胡蘿卜苷、對羥基苯甲醛和氫化胡桃醌這四種物質(zhì)。其中對香豆醛的黃嘌呤氧化酶抑制活性最強,為混合性抑制劑,與別嘌呤醇具有協(xié)同增效作用。核桃殼提取物和對香豆醛可以作為預(yù)防和治療高尿酸血癥及痛風(fēng)的活性物質(zhì)。(4)基于對香豆醛及其結(jié)構(gòu)類似物,探討了黃嘌呤氧化酶抑制活性的構(gòu)效關(guān)系,并對對香豆醛抑制黃嘌呤氧化酶的機制進行了探討。體外的黃嘌呤氧化酶抑制活性和分子對接結(jié)果表明對香豆醛的醛基、雙鍵和羥基對其黃嘌呤氧化酶抑制活性具有重要貢獻。對香豆醛與黃嘌呤氧化酶之間相互作用主要包括對香豆醛與苯丙氨酸-914和苯丙氨酸-1009之間的苯環(huán)與苯環(huán)的相互作用,羥基與谷氨酸-1261和精氨酸-880之間的兩個氫鍵,醛基與蘇氨酸-1010和纈氨酸-1011之間的兩個氫鍵。通過改變對香豆醛本身基團的位置和增加基團進一步探討了對香豆醛及其衍生物抑制黃嘌呤氧化酶的構(gòu)效關(guān)系,結(jié)果表明在對香豆