【生物】動(dòng)物細(xì)胞工程第2課時(shí) 2023-2024學(xué)年高二生物同步備課課件（人教版2019選擇性必修3）

聚焦學(xué)習(xí)目標(biāo)：

1.動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)2.單克隆抗體及其應(yīng)用

第2節(jié)動(dòng)物細(xì)胞工程第2課時(shí)

動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體病原體（如流感病毒）B細(xì)胞抗原呈遞細(xì)胞輔助性T細(xì)胞B細(xì)胞記憶B細(xì)胞漿細(xì)胞抗體1一些病原體可以和B細(xì)胞接觸，這為激活B細(xì)胞提供了第一個(gè)信號(hào)。1抗原呈遞細(xì)胞將抗原處理后呈遞在細(xì)胞表面，然后傳遞給輔助性T細(xì)胞。3一些病原體被樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞攝取。223456

輔助性T細(xì)胞表面的特定分子發(fā)生變化并與B細(xì)胞結(jié)合，這是激活B細(xì)胞的第二個(gè)信號(hào)；輔助性T細(xì)胞開(kāi)始分裂、分化，并分泌細(xì)胞因子。4一.動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)實(shí)例：1970年，科學(xué)家用發(fā)綠色熒光的染料標(biāo)記小鼠細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)分子，用發(fā)紅色熒光的染料標(biāo)記人細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)分子，將小鼠細(xì)胞和人細(xì)胞融合。這兩種細(xì)胞剛?cè)诤蠒r(shí)，融合細(xì)胞的一半發(fā)綠色熒光，另一半發(fā)紅色熒光。在37℃下經(jīng)過(guò)40min，兩種顏色的熒光均勻分布。小鼠細(xì)胞人細(xì)胞細(xì)胞融合37℃,40min正常融合的細(xì)胞融合細(xì)胞紅色熒光染料標(biāo)記的膜蛋白綠色熒光染料標(biāo)記的膜蛋白熒光標(biāo)記的小鼠細(xì)胞和人細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)示意圖1.概念指兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性。物理法：電融合法化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）融合法生物法：滅活病毒誘導(dǎo)法2.原理3.誘導(dǎo)方式思考：19世紀(jì)30年代，科學(xué)家曾在肺結(jié)核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中觀察到多核細(xì)胞。如何解釋這一現(xiàn)象？病人體內(nèi)病毒等誘導(dǎo)多個(gè)體細(xì)胞融合形成了多核細(xì)胞。滅活病毒誘導(dǎo)法①滅活：是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)。動(dòng)物細(xì)胞融合特有的誘導(dǎo)方法仙臺(tái)病毒紫外線滅活喪失感染活性（不感染細(xì)胞）保留融合活性（能誘導(dǎo)細(xì)胞融合）②原理：病毒表面的糖蛋白和一些酶與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開(kāi)，細(xì)胞發(fā)生融合。4.過(guò)程細(xì)胞膜融合細(xì)胞核融合細(xì)胞質(zhì)融合形成雜交細(xì)胞滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合過(guò)程5.意義：突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。6.應(yīng)用：1)細(xì)胞融合技術(shù)已經(jīng)成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。2)利用動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展起來(lái)的雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開(kāi)辟了新途徑。至今，種間、屬間、科間，甚至動(dòng)植物之間融合都已獲得了成功。資料

2016年，《ACSSyntheticBiology》雜志上報(bào)道了一個(gè)日本科學(xué)家團(tuán)隊(duì)，他們將擬南芥細(xì)胞與人類(lèi)HT1080細(xì)胞融合，雜交細(xì)胞中產(chǎn)生出了人類(lèi)/植物融合染色體，同時(shí)還能穩(wěn)定存活、增殖，進(jìn)行基因表達(dá)的案例。植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合成功的標(biāo)志主要用途意義細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性、植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性用果膠酶和纖維素酶去除細(xì)胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞電融合法、離心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細(xì)胞壁細(xì)胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能7.植物體細(xì)胞雜交和動(dòng)物細(xì)胞融合比較體液免疫抗體抗體的分布：血清（主要）每個(gè)（已經(jīng)免疫的）B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性的抗體抗體是機(jī)體受抗原刺激后產(chǎn)生的、并能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的具有免疫功能的免疫球蛋白二.單克隆抗體及其應(yīng)用不能無(wú)限增殖產(chǎn)生大量抗體動(dòng)物體內(nèi)抗原刺激多種漿細(xì)胞多種抗體篩選單一B細(xì)胞增殖分化抗原不純抗體不純產(chǎn)量低、純度低，且抗體的特異性差、靈敏度低。缺陷：如何解決這個(gè)問(wèn)題呢？抗原免疫傳統(tǒng)抗血清所有抗體混合1.傳統(tǒng)抗體制備方法及缺陷一個(gè)極富創(chuàng)造力的方案動(dòng)物細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)單克隆抗體骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無(wú)限增殖一個(gè)B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生專(zhuān)一抗體1975年，米爾斯坦和柯勒1984年，諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)米爾斯坦【英國(guó)】科勒【德國(guó)】注射特定抗原從患骨髓瘤的小鼠體內(nèi)取骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)多種已免疫B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合小鼠的脾臟中獲取多種雜交細(xì)胞2.制備過(guò)程1)獲得融合細(xì)胞資料分析：HAT培養(yǎng)基資料1：DNA的合成有D途徑和S途徑兩種途徑，其中D途徑是在葉酸的輔助下，由氨基酸等小分子合成核苷酸；S途徑是利用酶，催化次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶脫氧核苷（T）生成相應(yīng)的核苷酸。資料2：已知氨基蝶呤（A）是葉酸的拮抗物；免疫的B淋巴細(xì)胞有這兩種途徑，骨髓瘤細(xì)胞缺乏S途徑中的酶。培養(yǎng)基中加入氨基喋呤活動(dòng)：請(qǐng)根據(jù)以上信息，設(shè)計(jì)從培養(yǎng)液中篩選出雜交瘤細(xì)胞的方案。細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基喋呤阻斷。人淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D途徑，沒(méi)有S途徑。B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞（A）合成DNAD途徑S途徑D途徑氨基喋呤A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB302雜交瘤細(xì)胞（多種）置于選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)第一次篩選融合的細(xì)胞B細(xì)胞自身融合未融合的B淋巴細(xì)胞B瘤骨髓瘤細(xì)胞自身融合未融合的骨髓瘤細(xì)胞B瘤B瘤第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會(huì)死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長(zhǎng)。2)篩選雜交瘤細(xì)胞①篩選雜交瘤細(xì)胞，一般用HAT培養(yǎng)基，由次黃嘌呤（H）、氨基蝶呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T），3種關(guān)鍵成分配制而成。②哺乳動(dòng)物細(xì)胞中合成DNA途徑有兩條：一條是從頭合成途徑（簡(jiǎn)稱(chēng)D途徑），氨基蝶呤可以阻斷細(xì)胞利用D途徑合成DNA；一條是補(bǔ)救途徑（簡(jiǎn)稱(chēng)S途徑），該途徑需要次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），這兩種酶可以催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷用來(lái)合成DNA。③骨髓瘤細(xì)胞是經(jīng)過(guò)人工篩選的基因缺陷型細(xì)胞，缺乏HGPRT、TK。當(dāng)它處于HAT培養(yǎng)基中，合成DNA的D途徑被氨基蝶呤阻斷。同時(shí)，它由于缺乏HGPRT和TK，所以不能利用S途徑合成DNA，會(huì)很快死亡。④雜交瘤細(xì)胞從B淋巴細(xì)胞中獲得了HGPRT和TK，可以利用S途徑來(lái)合成DNA。第一次篩選獲得雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑B淋巴細(xì)胞及同型融合細(xì)胞不能無(wú)限增殖，死亡骨髓瘤細(xì)胞及同型融合細(xì)胞不能合成DNA，死亡雜交瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖，生長(zhǎng)B淋巴細(xì)胞合成DNAS途徑D途徑不能分裂增殖骨髓瘤細(xì)胞合成DNAD途徑能無(wú)限增殖一般用HAT培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，其中氨基喋呤阻斷D途徑。第一次篩選獲得雜交瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞是經(jīng)過(guò)人工篩選的基因缺陷型細(xì)胞，缺乏HGPRT、TK。克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)★有限稀釋法每一個(gè)孔中盡量只接種一個(gè)雜交瘤細(xì)胞側(cè)面模擬圖克隆化培養(yǎng)一段時(shí)間取上清液進(jìn)行抗體檢測(cè)抗原和抗體能夠特異性結(jié)合抗體檢測(cè)的原理是什么？(分子水平的鑒定）3)篩選分泌專(zhuān)一抗體的雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞（多種）第二次篩選獲得產(chǎn)生專(zhuān)一抗體的雜交瘤細(xì)胞使用96孔板培養(yǎng)和篩選雜交瘤細(xì)胞，每一個(gè)孔盡量只接種一個(gè)雜交瘤細(xì)胞，即將單個(gè)雜交瘤細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，通過(guò)克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)，即可獲得大量能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞?？贵w檢測(cè)呈陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)單克隆抗體體內(nèi)或體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔4)特異雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的方法比較項(xiàng)目腹腔培養(yǎng)體外培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)易于控制培養(yǎng)條件（如無(wú)需提供無(wú)菌環(huán)境等），操作簡(jiǎn)單，成本較低規(guī)模小，產(chǎn)量少可大規(guī)模培養(yǎng)，大量生產(chǎn)需要人為控制培養(yǎng)條件，成本相對(duì)較高應(yīng)用到的技術(shù)？原理？細(xì)胞膜的流動(dòng)性多種雜交細(xì)胞及未融合的細(xì)胞誘導(dǎo)

融合小鼠骨髓瘤細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞給小鼠注射特定抗原提取雜交瘤細(xì)胞第一次篩選用特定的選擇性培養(yǎng)基第二次篩選足夠數(shù)量的能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔大量單克隆抗體克隆化培養(yǎng)、抗體檢測(cè)（既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體）（能產(chǎn)生抗體）（能無(wú)限增殖）從腹腔液中提取從培養(yǎng)液中提?。ㄟM(jìn)行多次）動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞增殖單克隆抗體制備過(guò)程單克隆抗體制備過(guò)程中兩次篩選的比較項(xiàng)目第一次篩選第二次篩選篩選原因篩選目的篩選出？

篩選出

的雜交瘤細(xì)胞篩選方法用特定的選擇培養(yǎng)基篩選：未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會(huì)

，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能

。

用96孔板培養(yǎng)，在每一個(gè)孔中盡量只接種一個(gè)雜交瘤細(xì)胞的情況下進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和

，經(jīng)多次篩選得到足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞能分泌所需抗體死亡抗體檢測(cè)生長(zhǎng)誘導(dǎo)融合后得到多種融合細(xì)胞，還有未融合的細(xì)胞等由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經(jīng)選擇培養(yǎng)獲得的雜交瘤細(xì)胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：準(zhǔn)確、高效、簡(jiǎn)易、快速。3.單克隆抗體的應(yīng)用1)作為診斷試劑——最廣泛應(yīng)用利用同位素或熒光標(biāo)記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術(shù)，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。艾滋病檢測(cè)試劑結(jié)合同位素的單抗

血型檢測(cè)試劑結(jié)合熒光標(biāo)記的單克隆抗體藥物

乙肝測(cè)定試劑ADC通常由抗體、接頭和藥物（如細(xì)胞毒素）三部分組成，它的作用機(jī)制如下圖所示。2)運(yùn)載藥物（生物導(dǎo)彈）優(yōu)點(diǎn)：位置準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高。3)治療疾?。褐饕糜诎┌Y治療,如PD-1抗體或PD-L1抗體。

優(yōu)點(diǎn)：位置準(zhǔn)確、療效高、毒副作用小。1.概念檢測(cè)(1)與植物原生質(zhì)體融合相比，動(dòng)物細(xì)胞融合特有的誘導(dǎo)因素有聚乙二醇(PEG)、滅活的病毒(

)(2)滅活的含義是用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)(

)(3)二倍體動(dòng)物細(xì)胞融合后的雜交細(xì)胞仍然是二倍體細(xì)胞(

)(4)B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后，得到的都是雜交瘤細(xì)胞(

)(5)單克隆抗體制備過(guò)程中兩次篩選的目的相同(

)(6)ADC的抗體具靶向運(yùn)輸作用、藥物具有治療作用(

)2.如圖為單克隆抗體的制備流程示意圖。下列敘述正確的是(

)A.甲是從已免疫的小鼠脾臟中獲得的致敏T淋巴細(xì)胞B.①表示將骨髓瘤細(xì)胞去核后進(jìn)行細(xì)胞融合C.乙為融合細(xì)胞,同時(shí)具有細(xì)胞甲和骨髓瘤細(xì)胞的特性D.②表示篩選能產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞判斷正誤3.下列有關(guān)動(dòng)物細(xì)胞融合與植物體細(xì)胞雜交比較的敘述，錯(cuò)誤的是（

）

A.它們的原理都涉及細(xì)胞膜的流動(dòng)性