分子生物學(xué)：第四章 DNA復(fù)制

第四章DNA復(fù)制

(DNAReplication)第一節(jié)基本概念第二節(jié)復(fù)制概況第三節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)

第四節(jié)DNA復(fù)制的半不連續(xù)性第五節(jié)原核生物DNA復(fù)制（E.coli）

第六節(jié)真核生物DNA復(fù)制

第一節(jié)基本概念

(BasicConcept)DNA復(fù)制

親代雙鏈DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分別以各單鏈DNA分子為模板，聚合與自身堿基可以互補(bǔ)配對的游離的dNTP,

合成出兩條與親代DNA分子完全相同的子代DNA分子的過程?！?/p>

復(fù)制子（Replicon）；又稱復(fù)制單位或復(fù)制元AunitofthegenomeinwhichDNAcontainaregionfromorigintoterminator

DNA中含有一定復(fù)制起點和復(fù)制終點的復(fù)制單位

1.3萬～90萬不等●復(fù)制體（Replisome）Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNA復(fù)制叉處的許多酶和蛋白組成的復(fù)合體，協(xié)同動作合成DNADNA復(fù)制在細(xì)胞周期的S期E.coli37℃0.5h105bp/minmammaliancell500-5000bp/min第二節(jié)復(fù)制概況

(SurveysofReplication)一、DNA的半保留復(fù)制

（Semi-ConservationReplication）1958Meselson-stahl

設(shè)計的CsCl超離心試驗證實了

DNA復(fù)制的這一特性概念：復(fù)制過程中各以雙螺旋DNA的其中一條鏈為模

板合成其互補(bǔ)鏈，新生的互補(bǔ)鏈與母鏈構(gòu)成子

代DNA分子15N標(biāo)記實驗·細(xì)胞生長在15N標(biāo)記培養(yǎng)基中·轉(zhuǎn)入正常N源培養(yǎng)基中·分離各代DNA·分析各代DNA的浮力密度15N標(biāo)記DNA未標(biāo)記DNA

CsCL密度梯度離心浮力密度

N15－DNA1.742g/mlN15－N14－DNA1.717g/mlN14－DNA1.710g/ml

二、復(fù)制起點、方式和方向1、復(fù)制起點（originori或o復(fù)制原點）復(fù)制開始處DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：單復(fù)制起點即－－整個染色體只有一個復(fù)制單位

真核生物（Eukaryote）:多復(fù)制起點即－－一個genome中有多個復(fù)制單位Replicationfork

復(fù)制叉（Replicationfork）：染色體中參與復(fù)制的活性區(qū)域，即復(fù)制正在發(fā)生的位點

2、復(fù)制方向（復(fù)制過程的順序性）

復(fù)制眼（replicationeye）：電子顯微鏡下觀察正在復(fù)制的DNA，復(fù)制的區(qū)域形如一只眼睛真核生物的多復(fù)制子多個復(fù)制眼

（1）單雙向復(fù)制取決于起點處有一個還是兩個復(fù)制叉

單向復(fù)制

雙向復(fù)制（2）

復(fù)制的多模式單起點、單方向（原核）多起點、單方向（真核）單起點、雙方向（原核）多起點、雙方向（真核）3、復(fù)制方式大多數(shù)以對稱方式進(jìn)行－－即兩條鏈同時復(fù)制也有一定時期內(nèi)DNA只復(fù)制一條鏈的情況

（1）θ

復(fù)制或從新起始（denovoinitiation

）或復(fù)制叉式（replicationfork

）

雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制眼可以形成一種θ結(jié)構(gòu)，形狀像希臘字母θ，因而叫….

AreplicationeyeformsathetastructureincircularDNA.

單、雙向θ

復(fù)制模式圖單向復(fù)制雙向復(fù)制

（2）D環(huán)復(fù)制（Displacementform

）

又稱置換式

線粒體和葉綠體

DNA的復(fù)制方式（3）σ復(fù)制或滾環(huán)式復(fù)制（rollingcirclereplication）或共價延伸方式（covalenceelongation）

由于復(fù)制時產(chǎn)生的滾環(huán)結(jié)構(gòu)形狀象σ，稱σ復(fù)制

病毒、細(xì)菌因子，如含有單鏈環(huán)狀DNA的φX174、G4、M13F質(zhì)粒的共價整合圖不是σ復(fù)制(4)線性DNA雙鏈的復(fù)制單一起點、單向，如：腺病毒單一起點、雙向，如：T7噬菌體多個起點、雙向第三節(jié)

DNA復(fù)制的酶學(xué)

(EnzymologyofDNAReplication)

一、DNA聚合反應(yīng)和聚合酶1957ArthurKornberg首次發(fā)現(xiàn)DNApolⅠ

DNApol

Ⅱ

DNApol

Ⅲ

（E.coli）

聚合反應(yīng)：底物－－dNTPPoly(核苷酸)n－3’-OH＋dNTP

→

Poly(核苷酸)n+1－3’-OH

＋

2Pi

二、三種DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)和功能

其中DNApolⅢ

全酶有十種共22個亞基β二聚體－－滑動鉗DNApolⅢ全酶的非對稱二聚體

DNApolⅠ和DNApolⅢ的主要特性和功能

1、DNA聚合酶活性：兩者都有條件－－模板、引物

DNApolⅠ－－主要用于DNA

的修復(fù)和RNA引物的替換

DNApolⅢ－－DNA鏈的延長聚合方向：5’－3’

2、3’－5’外切核酸酶活性（兩酶都具有）

校對功能(proofreading)

3、5’－3’外切核酸酶活性

DNApolⅠ的5’－3’外切活性有以下三個特點：

?必須有5’－磷酸末端?被除去的核苷酸必須是已經(jīng)配對的

?被除去的可以是脫氧核糖核苷酸，也可以是核糖核苷酸（切刻平移）4、子鏈DNA延伸方向只能是5’－3’已知的DNA聚合酶只能使鏈按5’－3’方向生長5’OHTCATCAC5’OH3’ppp

OH

C++

ppi

如果DNA的延伸方向是3’→5’

ATCG

+

5’pppOH3’G

pppOHGATCG

5’pppOH3’ATCG

+

5’pppOH3’G

pppOH

G

5’

pppa、因能量的需要，

DNA的5’端必須帶有PPP游離dNTP具有ppppppOH3’ATCG

在0.2MNacl

的生理環(huán)境中，使dNTP難以聚合到DNA的5’端

需要其他機(jī)制以解脫

b、堿基發(fā)生錯配后的校正……費(fèi)時、費(fèi)能、增加加磷酸的能量消耗

ATCG

pppOH+

pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH

三、DNA連接酶（DNALigase）

所需條件：

a、

切刻的3’－OH和5’－P相鄰

b、

切刻各自堿基處于配對狀態(tài)

c、需要能量原核（ATP、NAD）

真核（ATP）

用途：復(fù)制過程中，5’端RNA引物被置換后切刻的連接修復(fù)、重組

四、與DNA幾何學(xué)性質(zhì)相關(guān)的酶1、解螺旋酶（helicase）:又稱解旋酶單鏈結(jié)合蛋白（SSBsingle-strandbindingprotein2、

DNA旋轉(zhuǎn)酶：消除復(fù)制叉前進(jìn)過程中產(chǎn)生的正超螺旋，產(chǎn)生負(fù)超螺旋第四節(jié)

DNA復(fù)制的半不連續(xù)性（Semi-DiscontinuousReplication）

3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘

一、DNA復(fù)制的半不連續(xù)性

事實上沒有發(fā)現(xiàn)DNA能按3‘→5’合成的證據(jù)先導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制后隨鏈按Okazaki片段不連續(xù)復(fù)制

先導(dǎo)鏈（leadingstrand）：DNA復(fù)制時，與復(fù)制叉向前移動的方向一致，以3’→5’鏈為模板，按

5’→3’方向連續(xù)合成的一條鏈

后隨鏈（laggingstrand）：岡崎片段(Okazakifragment):DNA復(fù)制不連續(xù)合成鏈中形成的短DNA片段

原因－－后隨鏈的片段合成需要一個周期性的起始信號

二、引物（Primer）和引發(fā)酶（Primase）

DNApolymerase

只能使DNA從引物的3’端延伸

DNA復(fù)制如何起始？？？

RNA可能提供了DNA復(fù)制的3’端1、實驗證據(jù)：M13phage的DNA復(fù)制顯示出對轉(zhuǎn)錄抑制劑

的敏感性E.coli[Rifs][RifS]+M13E.coliM13+S.S.DNAvirus+RF無M13RFRifampicinM13Rifampicin有M13RF

Rifampicin

是E.coliRNApolymerase

的抑制劑

M13RF的形成需要RNApolymerase發(fā)動合成一段RNA分子作為引物（RNA提供復(fù)制的3‘端）

RF啟動后，Rifalmpin

的抑制無效結(jié)論（Conclusion）：

2、后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)：

?細(xì)菌中先導(dǎo)鏈的合成受Rifalmpin

的抑制

?后隨鏈的合成不受Rifalmpin限制原因：

?先導(dǎo)鏈的起始需要RNApol的轉(zhuǎn)錄激活

?而后隨鏈的起始由引發(fā)酶合成引物，而引發(fā)酶不受Rifalmpin的抑制

DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活

(transcriptionalactivation）：

DNA復(fù)制起始時通過RNApolymerse的轉(zhuǎn)錄過程而解開局部的雙鏈

轉(zhuǎn)錄激活時產(chǎn)生的RNA能否作為引物目前尚未得出普遍結(jié)論質(zhì)粒ColE1的DNA復(fù)制起始引物RNA為RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄（經(jīng)過剪切）

該RNA與起始區(qū)域DNA緊密結(jié)合3.引發(fā)酶：合成RNA引物的酶。引發(fā)體：引發(fā)酶單獨(dú)存在時不具有酶活性，只有與有關(guān)的蛋白質(zhì)相互結(jié)合成為一個復(fù)合體時才有活性，這種復(fù)合體….（1）

RNApol(RNApolymerase)[RifS]（2）

dnaG(primase)[RifR]

組裝成引發(fā)體

完成對后隨鏈（先導(dǎo)鏈）引物的合成

（3）完成引物合成后

DNApo

lII

進(jìn)行DNA鏈的延伸

DNApolⅠ

Ligase

主要實現(xiàn)DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活起始較先導(dǎo)鏈的啟動落后一個Okazaki片斷4、總結(jié)：復(fù)制叉如何誕生？有機(jī)體選擇RNA作為引物的可能原因

最終避免由于最初幾個核苷酸的復(fù)制錯誤導(dǎo)致的致死突變!!a、采用RNA引物作為過渡形式，減少發(fā)生錯誤的機(jī)會

從模板拷貝的最初幾個核苷酸對的堿基堆積力弱,氫鍵結(jié)合力也弱，因此發(fā)生錯誤的幾率大；且還沒有形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，DNA的聚合酶的3’－5’校對功能很難發(fā)揮b、RNA的過渡形式在不需要時容易被剔除

,容易被DNApol

Ш識別而停止聚合,且便于DNApol

?進(jìn)行切刻平移,由于DNApol

?具有5’－3’校對功能,所以發(fā)生錯誤的幾率很小后隨鏈上所包含的事件？

三、后隨鏈的合成及前體片段的連接

引發(fā)體（包括引發(fā)酶）pppRNA引物DNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligaseRNAprimedDNAreplicationRemovalofRNAprimersandfillingofgaps第五節(jié)原核生物DNA復(fù)制

(DNAreplicationinProkaryote)

一、DNA復(fù)制機(jī)構(gòu)的研究

利用突變表型來考察基因的功能

但只能利用條件型突變溫度敏感突變體

材料:E.coli

或噬菌體

二、DNA復(fù)制大腸桿菌的DNA復(fù)制噬菌體?×174的復(fù)制腺病毒的復(fù)制4.線性DNA的末端復(fù)制的問題5、復(fù)制忠實性的保證（1）OriCinE.colichromosomalDNA

1、大腸桿菌的DNA復(fù)制?四個9bp的重復(fù)序列

dnaA結(jié)合位點?三個13bp的重復(fù)序列若干GATC位點（2）簡單復(fù)制過程

a、涉及主要酶系：

DnaA、RNApol是必不可少的，此外涉及到

DnaB（解旋酶）、DnaC、Hu、Gyrase、

SSB、

DnaG、Top?和DNApol

Ш全酶

b、簡單步驟：

*

轉(zhuǎn)錄激活

*DnaA

識別并結(jié)合復(fù)制起點，DnaB－DnaC六聚體與oriC

形成預(yù)引發(fā)體

*

DnaG加入形成引發(fā)體（oriC引發(fā)體），合成引物RNA*引物合成后，DNApol

組裝到引發(fā)的RNA上，完成復(fù)制體的組裝DnaASSB13bprepeats涉及轉(zhuǎn)錄激活一分子的DNApolIII.協(xié)同合成前導(dǎo)鏈和后隨鏈

（3）復(fù)制終止a、終止序列

E.coli

有兩個終止區(qū)域，分別結(jié)合專一性的終止蛋白

序列一：terE

terD

terA

序列二：terF

terB

terC

每個區(qū)域只對一個方向的復(fù)制叉起作用

b、專一性終止蛋白

E.coli

中由tusgene

編碼

（terminusutilizationsubstance）通過抑制DNA螺旋酶而發(fā)揮終止作用每次復(fù)制時只使用一個終止位點ter（4）細(xì)菌(E.coli)DNA每個細(xì)胞周期只復(fù)制一次每個細(xì)胞周期復(fù)制一次可能受OriC甲基化的控制11copiesinOriC（5）E.coli細(xì)胞加倍時間與復(fù)制起始加倍時間37℃<20min～10h復(fù)制時間：40min左右（850核苷酸／秒）分裂過程中其它事件約需20min（組分、隔膜）因此－－加倍時間少于60min的細(xì)胞兩輪復(fù)制有共用時間

（1）Φx174phage復(fù)制起始Φx型引發(fā)體的組裝以PriA識別引發(fā)體組裝位點（primosomeassemblysitepas）開始，首先形成預(yù)引發(fā)體其中－－引發(fā)體組裝位點唯一，但引發(fā)位點是不唯一的

Φx型引發(fā)體或其部分組分可沿單鏈

DNA移動到每一個岡崎片段的起點PriA提供引發(fā)體移動的動力2、ФX174的復(fù)制

（2）

Φx174DNA的復(fù)制

a、SS→RFⅠ

Φx型引發(fā)體起始后，由DNApolⅢ、Ⅰ和連接酶等協(xié)同合成

（后隨鏈的起始過程）

b、多拷貝RF的合成

（滾環(huán)復(fù)制）

（先導(dǎo)鏈的合成過程、后隨鏈合成）

c、后代單鏈（SS）DNA的合成（DNA復(fù)制過程是上一過程的一部分先導(dǎo)鏈）

A蛋白（gpA）：

?

Φx174基因A的產(chǎn)物

?結(jié)合到RFⅠDNA的復(fù)制原點的結(jié)合位點（引發(fā)體的幫助）

?誘導(dǎo)相鄰的識別位點的熔解(負(fù)超螺旋、富含A/T)

?其核酸內(nèi)切酶活力切割（＋）鏈的4305與4306堿基的酯鍵，并共價連接于5’端（A），另一端為自由的

3’－OH（G）

Rep蛋白－－解旋酶

SS→RFⅠ單鏈（+）DNA的合成

3、腺病毒（Adnovirus-2）DNA的復(fù)制

IR:包括50bp的復(fù)制原點、富含A/T、有一個高度保守的G／C對pTP:末端蛋白的前體

80kd

→TP55kdSSB:單鏈DNA結(jié)合蛋白

72kd

Ad2DNApolymerase;140kd

TP:可以共價結(jié)合到5’末端上的末端蛋白

腺病毒DNA復(fù)制起始G復(fù)制起始復(fù)合體引發(fā)復(fù)制（不需引物）

避免5’-endshortent

pTP-Ser-dCMP

CG●過程

SSB+ATPDNA末端解鏈

TP

pTP-Ser+

dCTP

pTP-Ser-dCMP

3‘OHIRIR長的發(fā)夾結(jié)構(gòu)

4、線性DNA的末端復(fù)制的問題（1）線狀DNA的復(fù)制5’末端短縮的解決模式

a、從開始就采取環(huán)化的形式

－－－λ噬菌體

b、象T7噬菌體一樣采取連環(huán)分子的形式

利用自身線性DNA末端的重復(fù)序列－－通過末端互補(bǔ)形成連環(huán)分子

c、最直接的辦法－－－引入蛋白質(zhì)直接從末端起始復(fù)制

如－－－腺病毒－2、phageΦ29、脊髓灰質(zhì)炎病毒

d、痘病病毒的末端由發(fā)夾結(jié)構(gòu)連接

復(fù)制完成后錯切連接a.環(huán)化??二聚體3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OHb.T7噬菌體的末端復(fù)制專一性核酸內(nèi)切酶痘病毒d.末端形成發(fā)夾復(fù)制從內(nèi)部起始點開始復(fù)制使發(fā)夾結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成雙鏈分子內(nèi)部交錯切割分子重排末端回折痘病毒

5、復(fù)制忠實性的保證

1、DNApol的3’5’外切酶活性

(exonucleaseactivity)

2、DNApol只能從引物的3’

端延伸DNA

（需要RNA引物）

a、堿基配對協(xié)同性導(dǎo)致最初幾個堿基錯配率高，且不易校正

b、RNA引物最終被降解而避免錯誤

3、后隨鏈的不連續(xù)合成

因其有利于錯配堿基的校正

3.6.真核生物DNA的復(fù)制(DNAreplicationinEukaryote)

1、復(fù)制概況

a、多個復(fù)制元（multiplereplicon

），雙向復(fù)制

b、復(fù)制元相對較小(13-900kb),

復(fù)制速度較慢,大約

500~5000bp/min

（3000bp/min）岡崎片段100～200NTc、復(fù)制終止通過復(fù)制叉的相遇而終止multiplereplicon

例；果蠅3500replicons

平均40Kb

酵母500replicons

哺乳動物平均100Kb

2、真核生物的DNA聚合酶

α、β、δ、ε、γ五種

位置

核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)核內(nèi)

線粒體

合成

與引發(fā)

修復(fù)合成合成,修復(fù)復(fù)制功能酶結(jié)合前導(dǎo)鏈

后隨鏈3’－5’校NONOYesYes

Yes正活性

α

β

δ

ε

γ

3.真核生物DNA復(fù)制的引發(fā)酶

●DNApolα+primase形成緊密的復(fù)合物

6-9NtRNAasprimer

●引發(fā)酶（primase）：50-60kd

●作用方式為陣發(fā)性的，每次作用拷貝6～15個核苷酸

●既能利用NTP，又能利用dNTP

●SV40體外DNA復(fù)制情況分析

ε

δ

4、真核生物的復(fù)制起始受許可因子的控制

5、真核生物染色體DNA末端補(bǔ)齊模式

(1)端粒DNA(Telomer)

TTGGGG(T2G4)序列高度重復(fù)的末端

5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(富含

G鏈)

3’AACCCC

AACCCCAACCCC5’(富含C鏈)

（2）端粒酶（

Telomerase）1985.CarolGreider&Blackburn,1986.Gottchling

四膜蟲端粒酶（telomerase）將T2G4

末端重復(fù)延伸

Telomerase

=RNACAAAACCCC

鏈+

末端結(jié)合蛋白（TBP）端粒酶－－－逆轉(zhuǎn)錄酶a、核蛋白（ribonucleoproteinRNP）b、含約長150NT的RNA，其中含1～5拷貝的CxAy重復(fù)序列，是合成端粒T2G4的模板c、延長的3’-T2G4端（一段cDNA）作為5’-端DNA合成的模板（3）補(bǔ)齊過程

通過TG鏈的回折形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（G·G氫鍵）－－－尺蠖模型

→→實現(xiàn)端粒酶位置的調(diào)整GGhoogsteen

氫鍵

G鏈–T2G4-----TTGGGG

TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4-----G鏈–T2G4-----TTGGGG

ttggggttgC鏈--A2C4-----AACCCCAAggggttgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNApolorG鏈–T2G4-----TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG

C鏈--A2C4-----實驗表明－－人體細(xì)胞通過監(jiān)測失去的端粒的重復(fù)數(shù)而計數(shù)細(xì)胞分裂次數(shù)，當(dāng)端粒長度下降到某一臨界值時，細(xì)胞終止分裂－－－衰老、死亡“多莉”的衰老

研究端粒丟失的速率，預(yù)測人類的壽命

＞XXXYwhy?研究推測端粒酶與腫瘤的關(guān)系

6、真核生物復(fù)制過程中的核小體結(jié)構(gòu)

（1）組蛋白的合成在細(xì)胞核中與DNA復(fù)制同步進(jìn)行（2）且組蛋白H3、H4的四聚體在DNA復(fù)制時隨機(jī)分配給某一子DNA鏈（3）H2A,H2B解離參與競爭，從新組裝

（4）組蛋白修飾，調(diào)控基因表達(dá)a、復(fù)制子的大?。⊿izesofreplicon）:Yeastorfly 平均40kbMammals 平均100kbProkaryoticDNA: >1000kbb、岡崎片段(Okazakifragments):ProkaryoticDNA: 1000-2000ntEukaryoticDNA: 100-200ntc、復(fù)制速度（Rateofreplication）:EukaryoticDNA: ca.3,000bp/min(50/sec)ProkaryoticDNA: 50,000bp/min(900/sec)原核生物和真核生物DNA復(fù)制的比較1.Semi-conservativereplication2.Semi-discontinuousrepliction3.DNAhelicase,Ssb4.RNApriming5.校正閱讀（Proofreading）1.復(fù)制起點（單、多）2.復(fù)制子（大小、多少）3.復(fù)制起始的許可因子的控制（復(fù)制周期的重疊與否）4.復(fù)制叉移動的速度(900/50nt/S)5.岡崎片段的大小6.端粒和端粒酶7.DNA聚合酶Polymerases相同點：不同點：名詞解釋復(fù)制復(fù)制體半保留復(fù)制崗崎片段復(fù)制單位θ復(fù)制先導(dǎo)鏈后隨鏈DNA復(fù)制的轉(zhuǎn)錄激活DNA復(fù)制的半不連續(xù)性簡答題1、圖示說明DNA半保留復(fù)制的機(jī)制證明。2、DNA復(fù)制方向為5’→3’，請說明復(fù)制為什么不能從3’→5’。3、為什么崗崎證明DNA半不連續(xù)性復(fù)制的實驗中出現(xiàn)兩條鏈都是不連續(xù)的假象。4、DNA復(fù)制為何選擇RNA作為引物？5、復(fù)制叉誕生的過程如何，后隨鏈上都包含哪些事件（涉及的酶的情況）6、E.coli的DNA復(fù)制終止機(jī)制7、原核生物線性DNA復(fù)制5’末端短縮的解決辦法有哪幾種。8、真核生物端粒末端及端粒酶在DNA末端復(fù)制過程中的作用機(jī)制9、真核生物DNA復(fù)制過程中核小體復(fù)制和保留機(jī)制。10、保證復(fù)制忠實性的主要機(jī)制11、真核與原核復(fù)制起始調(diào)控的差別12、真核與原核復(fù)制的比較內(nèi)容回顧1：1、基本概念

DNA復(fù)制復(fù)制子復(fù)制體復(fù)制時期2、半保留復(fù)制3、復(fù)制起點結(jié)構(gòu)特征復(fù)制方向：復(fù)制叉復(fù)制眼單雙向復(fù)制的決定條件復(fù)制的多模式復(fù)制方式：復(fù)制叉式（從頭起始）