33單元八 微生物的常規(guī)檢驗技術(shù) 項目一 微生物的常規(guī)檢驗技術(shù)（三、霉菌、酵母菌菌數(shù)的測定）

微生物學(xué)基礎(chǔ)單元十一微生物的常規(guī)檢驗技術(shù)

１霉菌、酵母菌菌數(shù)測定的概念和意義三、霉菌、酵母菌菌數(shù)的測定

項目一微生物的常規(guī)檢驗技術(shù)霉菌、酵母菌菌數(shù)測定的概念：霉菌和酵母菌分布廣泛,在食品和藥物上可作為正常菌群的一部分,或隨空氣傳播，在消毒不適當(dāng)?shù)脑O(shè)備上發(fā)現(xiàn)，故可測定出霉菌、酵母菌的菌數(shù)；霉菌、酵母菌菌數(shù)測定的衛(wèi)生學(xué)意義:食品和藥物若遭受霉菌和酵母菌的侵染,則發(fā)生霉壞變質(zhì)，而引起急性和慢性中毒；因此,對食品和藥物中的霉菌和酵母菌進(jìn)行檢測,具有重要的衛(wèi)生學(xué)意義。

２霉菌、酵母菌菌數(shù)測定的目的要求和基本原理三、霉菌、酵母菌菌數(shù)的測定

目的要求：掌握霉菌和酵母菌總數(shù)的測定方法；基本原理:霉菌和酵母菌菌數(shù)是指食品（藥物）檢樣經(jīng)過處理,在一定條件下培養(yǎng)后，所得

1g或1mL檢樣中所含的霉菌和酵母菌菌落數(shù)。霉菌和酵母菌菌數(shù)主要作為食品、藥物被真菌污染的標(biāo)志，以便對被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評價時提供依據(jù)。

３實訓(xùn)用品三、霉菌、酵母菌菌數(shù)的測定

培養(yǎng)基和試劑：馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基、盂加拉紅培養(yǎng)基；儀器和材料:恒溫培養(yǎng)箱(28℃±1℃)、冰箱(2℃~5℃)、恒溫水浴箱(46℃±1℃)、天平(感量

為0.1g)、均質(zhì)器、振蕩器、顯微鏡(10×~100×)；

吸管(1mL和10ml)、錐形瓶(容量250mL、500ml)、廣口瓶(500mL)、培養(yǎng)皿(直徑

90mm)、試管(10mm×75mm)、牛皮紙袋、塑料袋。

4檢驗程序三、霉菌、酵母菌菌數(shù)的測定

5操作步驟--樣品的稀釋三、霉菌、酵母菌菌數(shù)的測定

樣品稀釋步驟：第一步：固體和半固體樣品：稱取25g樣品置于盛有225mL滅菌蒸餾水的錐形瓶中，充分振搖，制成1:10的樣品勻液；第二步：液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置于盛有225mL滅菌蒸餾水的錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻,制成1:10的樣品勻液；第三步：取1mL1:10稀釋液注入含有9ml無菌水的試管中，另換一支1mL無菌吸管反復(fù)吹吸，此液為1:100稀釋液；第四步：按上項操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管；第五步：根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2-3個適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時，每個稀釋度分別吸取1mL樣品勻液于2個無菌平皿內(nèi)。同時分別取1ml樣品稀釋液加人2個無菌平皿作空白對照；第六步：及時將15-20mL冷卻至46℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂或孟加拉紅培養(yǎng)基(可放置于46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混勻。

5操作步驟--培養(yǎng)、菌落計數(shù)三、霉菌、酵母菌菌數(shù)的測定

培養(yǎng)：待瓊脂凝固后，將平板倒置，28℃±1℃培養(yǎng)５d,觀察并記錄；菌落計數(shù)：

?肉眼觀察，必要時可用放大鏡，記錄各稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的霉菌和酵母數(shù)，以菌落形成單位(cfu)表示；

?選取菌落數(shù)在10~150cfu的平板，根據(jù)菌落形態(tài)分別計數(shù)霉菌和酵母數(shù)；霉菌蔓延生長覆蓋整個平板的可記錄為多不可計。菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。

６結(jié)果與報告三、霉菌、酵母菌菌數(shù)的測定

結(jié)果計算方法：計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)計算；

?若所有平板上菌落數(shù)均大于150cfu,，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù)，其他平板可記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算；

?若所有平板上菌落數(shù)均小于10cfu,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算；

?若所有稀釋度平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算；如為原液，則以小于1計數(shù)；結(jié)果報告方法：

?菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字報告；

?菌落數(shù)大于或等于100時，前3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來表示結(jié)果；也可用10的指數(shù)形式來表示，此時也按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字；

?稱重取樣以cfu/g為單位報告，體積取樣以cfu/mL為單位報告，報告或分別報告霉菌和/或酵母數(shù)。

７實訓(xùn)結(jié)果三、霉菌、酵母菌菌數(shù)的測定

將各稀釋度的霉菌和酵母菌菌落數(shù)填入下表：培養(yǎng)皿號稀釋度培養(yǎng)皿１培養(yǎng)皿２平均數(shù)該樣品的霉菌和酵母菌總數(shù)是：___________cfu/g（mL）。

８霉菌直接鏡檢計數(shù)法（郝氏霉菌計測法)cfu/g(mL)三、霉菌、酵母菌菌數(shù)的測定

儀器與材料：折光儀、顯微鏡、郝氏計測玻片(具有標(biāo)準(zhǔn)計測室的特制玻片)、蓋玻片、測微器(具標(biāo)準(zhǔn)刻度的玻片)；操作步驟：第一步：檢樣的制備：取定量檢樣。加蒸餾水稀釋至折光指數(shù)為1.3447~1.3460(即濃度為7.9%~8.89%),備用；第二步：顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)視野的校正：將顯微鏡按放大率90~125倍調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)視野,使其直徑為1.382mm；第三步：涂片：洗凈郝氏計測玻片，將制好的標(biāo)準(zhǔn)液，用玻璃棒均勻地攤布于計測室,以備觀察；第四步：觀測：將制好的載玻片放于顯微鏡標(biāo)準(zhǔn)視野下進(jìn)行霉菌觀測，一般每一檢樣觀察50個視野,同一檢樣應(yīng)由兩人進(jìn)行觀察；第五步：結(jié)果與計算：在標(biāo)準(zhǔn)視野下,發(fā)現(xiàn)有霉菌菌絲其長度超過標(biāo)準(zhǔn)視野(1.382mm)的1/6或三根菌絲總長度超過標(biāo)準(zhǔn)視野的I/6（即測微器的一格)時即為陽性（+），否則為陰性（-），按100個視野計，其中發(fā)現(xiàn)有霉菌菌絲體存在的視野數(shù)，即為霉菌的視野百分?jǐn)?shù)。

９注意事項三、霉菌、酵母菌菌數(shù)的測定

目前國外測定霉菌和酵母菌數(shù)常用的培養(yǎng)基有酸性馬鈴薯葡葡糖瓊脂、平板計數(shù)瓊脂、嗜真菌性瓊脂和麥芽汁瓊脂等，測定霉菌和酵母菌數(shù)的效果一致。在嗜真菌性瓊脂上，霉菌生長迅速易使菌落連在一起，因此采用此培養(yǎng)基計數(shù)時，必須在2d之內(nèi)開始計數(shù)；本方法兩種計數(shù)培養(yǎng)基加入的抗生素，可以抑制細(xì)菌的生長，有利于霉菌和酵母菌的計數(shù),但對某此霉菌的