《生物制品》課件

第18章生物制品1編輯ppt第18章生物制品1編輯ppt第一節(jié)概述2編輯ppt第一節(jié)概述2編輯ppt歷史的災(zāi)難：傳染病/戰(zhàn)爭傳染病黑熱?。ǜ构蓽狭馨徒Y(jié)炎性鼠疫）：公園前543~548年在康士坦丁堡，僅僅4個(gè)月就奪去20萬人的生命。在1346年，近1/3的歐洲人死于這次大流行，20世紀(jì)初，黑死病大流行奪走了印度超過100萬生命流感：1918.3-1919.1的10個(gè)月內(nèi)，有5000萬人死亡，人數(shù)多于第1次世界大戰(zhàn)戰(zhàn)亡人數(shù)（900萬軍人死亡、2000萬人受傷、1000萬人餓死病死）。戰(zhàn)爭一戰(zhàn)：動(dòng)員兵力7340萬余人，參戰(zhàn)部隊(duì)2900萬人，死于戰(zhàn)場的約

1000萬人，受傷約2000萬人。二戰(zhàn)：共有5700萬人死亡。3編輯ppt歷史的災(zāi)難：傳染病/戰(zhàn)爭傳染病3編輯ppt4編輯ppt4編輯ppt一免疫學(xué)發(fā)展簡史

分3個(gè)階段：經(jīng)驗(yàn)免疫學(xué)時(shí)期（公元10世紀(jì)起—19世紀(jì)）科學(xué)免疫學(xué)時(shí)期（19世紀(jì)末—20世紀(jì)中葉）獨(dú)立學(xué)科形成時(shí)期—《免疫學(xué)》誕生（20世紀(jì)60年代）—《現(xiàn)代免疫學(xué)》（20世紀(jì)90年代）

5編輯ppt一免疫學(xué)發(fā)展簡史分3個(gè)階段：5編輯ppt

圖1-1鼠疫流行的歷史記載Fig1-1HistoricalReviewofthePlagueEpidemic6編輯ppt圖1-1鼠疫流行的歷史記載6編輯ppt經(jīng)驗(yàn)免疫學(xué)階段（16-19世紀(jì)）人痘苗——中國人16-17世紀(jì)1796年，英國人EdwardJenner發(fā)明牛痘苗預(yù)防天花（cowpoxvaccine）中國古代種痘圖Variolation7編輯ppt經(jīng)驗(yàn)免疫學(xué)階段（16-19世紀(jì)）中國古代種痘圖Variol天花病毒（Poxvirus）8編輯ppt天花病毒（Poxvirus）8編輯ppt人們對疫苗的恐懼9編輯ppt人們對疫苗的恐懼9編輯ppt寶貝，接種疫苗啦！10編輯ppt寶貝，接種疫苗啦！10編輯ppt科學(xué)免疫學(xué)時(shí)期

（19世紀(jì)末-20世紀(jì)中葉）人工主動(dòng)免疫（Artificalactiveimmunity）1880年，法國的LouisPasteur減毒活疫苗技術(shù)（Live-attenuatedvaccine）雞霍亂弧菌減毒疫苗預(yù)防炭疽、狂犬病的減毒疫苗。進(jìn)入科學(xué)王國的最完美無缺的人11編輯ppt科學(xué)免疫學(xué)時(shí)期

（19世紀(jì)末-20世紀(jì)中葉）人工主動(dòng)免疫進(jìn)入12編輯ppt12編輯ppt13編輯ppt13編輯ppt人工被動(dòng)免疫（passiveimmunity）1888年，Roux和Yersin—白喉的致病機(jī)制是由白喉?xiàng)U菌外毒素所致1890年，德國學(xué)者Behring和日本學(xué)者北里(Kitasato）

—用白喉?xiàng)U菌外毒素免疫馬，然后用這種免疫血清，即抗毒素來治療白喉，首先在人體獲得成功

14編輯ppt人工被動(dòng)免疫（passiveimmunity）14編輯pp（2）免疫應(yīng)答機(jī)制的研究細(xì)胞免疫（cellularimmunity）—俄國科學(xué)家梅契尼柯夫機(jī)體的免疫機(jī)制，主要就是以增強(qiáng)了吞噬功能的白細(xì)胞所發(fā)揮的吞噬作用體液免疫（humoralimmunity）—Ehrlich等體液中產(chǎn)生了針對各種病原微生物的相應(yīng)抗體,并發(fā)現(xiàn)在試管中這些抗體能與相應(yīng)的病原體微生物發(fā)生凝集和沉淀等現(xiàn)象1903年，Wright及Douglas把細(xì)胞學(xué)說與體液學(xué)說統(tǒng)一起來

1903年Wright及Douglas仔細(xì)觀察了Metchnikoff提出的吞噬作用(phagocytosis)，并證明相應(yīng)的抗體能增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對相應(yīng)細(xì)菌的吞噬，這種抗體被稱為調(diào)理素(opsonin)，從此把細(xì)胞學(xué)說與體液學(xué)說統(tǒng)一起來

15編輯ppt（2）免疫應(yīng)答機(jī)制的研究15編輯ppt(3)抗體形成機(jī)制側(cè)鏈假說（sidechainpostulate）為了說明抗毒素產(chǎn)生的機(jī)理，Ehrlich于1908年提出了側(cè)鏈學(xué)說(sidechaintheory)。這個(gè)學(xué)說的基本含義是：機(jī)體細(xì)胞表面具有多種不同的側(cè)鏈(受體)，細(xì)菌毒素可與相應(yīng)的側(cè)鏈結(jié)合，對細(xì)胞起到某種刺激作用，促使與該毒素相結(jié)合的側(cè)鏈過剩產(chǎn)生。過剩產(chǎn)生的側(cè)鏈(即抗體)釋放到體液中，由于它能與毒素結(jié)合，而妨礙了毒素與細(xì)胞的結(jié)合，發(fā)揮抗毒素的作用如以現(xiàn)代免疫應(yīng)答的概念來說明這一問題，即只有特異性的抗原，才能識(shí)別產(chǎn)生特異性抗體的細(xì)胞，才能刺激這樣的細(xì)胞產(chǎn)生抗體。所以說，側(cè)鏈學(xué)說為后來提出的選擇學(xué)說提供了理論依據(jù)。

它和現(xiàn)在的知識(shí)有許多的一致之處。如，抗體的作用是在細(xì)胞外中和毒素，抗體是細(xì)胞產(chǎn)生的，抗體本身就是細(xì)胞的受體等等，與現(xiàn)在的知識(shí)完全吻合。

16編輯ppt(3)抗體形成機(jī)制16編輯pptBurnet克隆選擇學(xué)說1960，F(xiàn).M.Burnet體內(nèi)存在著無數(shù)抗原特異性（TCR、BCR）淋巴細(xì)胞克隆。胚胎期與自身成分反應(yīng)的T、B淋巴細(xì)胞被“禁忌”，形成免疫耐受。出生后淋巴細(xì)胞遇到相應(yīng)抗原而被選擇發(fā)生特異應(yīng)答，產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并形成記憶（Tm、Bm）?！敖伞奔?xì)胞突變，可導(dǎo)致自身免疫。(3)抗體形成機(jī)制17編輯pptBurnet克隆選擇學(xué)說1960，F(xiàn).M.Burnet體內(nèi)存18編輯ppt18編輯ppt(4)免疫病理概念的形成免疫病理:指機(jī)體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織損害所引起的疾病。

過敏反應(yīng)（anaphylaxis）—20世紀(jì)初，Richet和Portier移植排斥（graftrejection）

19編輯ppt(4)免疫病理概念的形成19編輯ppt免疫學(xué)科形成與《現(xiàn)代免疫學(xué)》時(shí)期（1945年——至今）免疫系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)和確立（20世紀(jì)50以后)免疫器官：骨髓（腔上囊）/胸腺淋巴結(jié)免疫細(xì)胞：T細(xì)胞——細(xì)胞免疫B細(xì)胞——體液免疫淋巴細(xì)胞再循環(huán)免疫分子：抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子等20編輯ppt免疫學(xué)科形成與《現(xiàn)代免疫學(xué)》時(shí)期（1945年——至今）免疫系（1）抗原與抗原表位

antigen&Epitope（20紀(jì)，KarLandsteiner)（2)抗體的研究抗體與丙種球蛋白：1938年，Tiselius等抗體是由漿細(xì)胞產(chǎn)生：1949年，Astrid等抗體的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)：20世紀(jì)50年代，Porter和Edelman抗體的基因結(jié)構(gòu)：20世紀(jì)70年代，利根川進(jìn)21編輯ppt（1）抗原與抗原表位21編輯ppt(3)免疫遺傳學(xué)研究MHC（主要組織相容性復(fù)合體）抗體多樣性抗體多樣性遺傳控制(geneticcontrolofantibodydiversity)1978年，Tonegawa:克隆了Ig的V、C區(qū)基因，使免疫學(xué)進(jìn)入分子免疫學(xué)（molecularimmunology）

22編輯ppt(3)免疫遺傳學(xué)研究22編輯ppt(4)免疫學(xué)理論體系的形成①克隆選擇學(xué)說（clonalselectiontheory）②免疫耐受機(jī)制研究(researchofimmunetolerancemechanisms)③免疫應(yīng)答機(jī)制研究(researchofimmuneresponsemechanisms)④早期的細(xì)胞免疫與體液免疫學(xué)說(cellularimmunityandhumoralimmunitytheoryatearlystage)⑤免疫應(yīng)答分子機(jī)制的闡明（elucidationofmolecularmechanismsofimmuneresponse）23編輯ppt(4)免疫學(xué)理論體系的形成①克隆選擇學(xué)說23編輯ppt生物制品（biologicalproducts）從微生物（包括細(xì)菌、噬菌體、立克次體、病毒等）及其代謝產(chǎn)物、原蟲、動(dòng)物毒素、人或動(dòng)物的血液或組織等直接加工制成，或用現(xiàn)代生物技術(shù)方法制成，作為預(yù)防、治療、診斷特定傳染病或其他有關(guān)疾病的免疫制劑統(tǒng)稱為生物制品。包括各種疫苗、抗血清、抗毒素、類毒素、免疫調(diào)節(jié)劑（如胸腺肽、免疫核酸等）、診斷試劑等。二、生物制品的基本概念24編輯ppt生物制品（biologicalproducts）從微生物（根據(jù)用途又可將生物制品分為預(yù)防類、治療類和診斷類三大類制品。預(yù)防類治療類制品診斷類制品三、生物制品的分類25編輯ppt根據(jù)用途又可將生物制品分為預(yù)防類、治療類和診斷類三大類制品。1、預(yù)防類制品此類制品主要用于感染性疾病的預(yù)防。常用的有如下幾種疫苗類毒素

由有關(guān)細(xì)菌產(chǎn)生的外毒素經(jīng)脫毒后制成的。常用的有白喉、破傷風(fēng)、肉毒類毒素及葡萄球菌類毒素等混合制劑常用的混合制劑的有以下幾種。聯(lián)合細(xì)菌傷寒、副傷寒甲、乙聯(lián)合菌苗，霍亂、傷寒、副傷寒甲、乙聯(lián)合菌苗。聯(lián)合病毒麻疹、牛痘苗聯(lián)合疫苗，麻疹、風(fēng)疹聯(lián)合疫苗，風(fēng)疹、腮腺炎聯(lián)合疫苗，麻疹、腮腺炎風(fēng)疹聯(lián)合疫苗。細(xì)菌和類毒素混合制劑白喉毒素類、百日咳菌苗和破傷風(fēng)類毒素混合制劑26編輯ppt1、預(yù)防類制品此類制品主要用于感染性疾病的預(yù)防。常用的有如下2.治療類制品抗血清與抗毒素用特定抗原免疫馬、?；蜓?，經(jīng)采血、分離血漿或血清，精制而成?？辜?xì)菌和病毒的稱抗血清；抗蛇毒和其他毒液的稱抗毒血清，抗微生物毒素的稱抗毒素。血液制品人血白蛋白，人免疫球蛋白，人凝血因子，紅細(xì)胞濃縮物等噬菌體

用于裂解宿主菌，以治療由宿主菌所引起的疾病，如痢疾桿菌噬菌體和綠膿桿菌噬菌體，可分別用于治療菌痢和綠膿桿菌感染癥，但其療效尚難肯定。27編輯ppt2.治療類制品抗血清與抗毒素用特定抗原免疫馬、?；蜓蛞呙缫倚透窝字委熞呙纾粏渭儼捳畈《疽呙?；麻風(fēng)病治療疫苗；其他治療疫苗?？贵w抗乙型肝炎表面抗原單克隆抗體，單克隆抗體靶向制劑等。細(xì)胞因子干擾素,白介素，集落刺激因子，紅細(xì)胞生成素重組DNA產(chǎn)品28編輯ppt疫苗乙型肝炎治療疫苗；單純皰疹病毒疫苗；麻風(fēng)病治療疫苗細(xì)胞因子許多細(xì)胞因子也具有明顯的免疫佐劑效用，能增強(qiáng)特異抗原的免疫原性或增強(qiáng)機(jī)體對抗原的反應(yīng)性，這些細(xì)胞因子包括IL-1、IL-2、IFN-7、IL-6等。作用主要表現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：增強(qiáng)機(jī)體的抗感染能力，增強(qiáng)疫苗的保護(hù)效應(yīng)，研究表明，在注射抗原的同時(shí)或預(yù)先注射細(xì)胞因子，可明顯增強(qiáng)針對該抗原的免疫應(yīng)答能力。29編輯ppt細(xì)胞因子許多細(xì)胞因子也具有明顯的免疫佐劑效用，能增強(qiáng)特異抗原3.診斷類制品體內(nèi)診斷用品用于皮內(nèi)接種，以判斷個(gè)體對病原的易感性或免疫狀態(tài)。如錫克毒素和結(jié)核菌素等。體外診斷用品生物制品除體外診斷用品外，其他均直接應(yīng)用于人體，故各國及世界衛(wèi)生組織對其質(zhì)量均有嚴(yán)格要求。30編輯ppt3.診斷類制品體內(nèi)診斷用品用于皮內(nèi)接種，以判斷個(gè)體對四、生物制品的免疫學(xué)基礎(chǔ)1、機(jī)體的抗感染免疫機(jī)體的抗感染免疫傳統(tǒng)上分為先天性免疫和獲得性免疫兩大類。免疫類型作用途徑實(shí)例先天性（非特異性免疫）主動(dòng)免疫體表屏障，血腦屏障，血肽屏障，細(xì)胞吞噬作用，正常體液和組織中抗菌物質(zhì)獲得性（特異性）免疫主動(dòng)免疫自然（形成）：感染人工（誘導(dǎo)）：類毒素、死或活菌（疫）前注射自然：母體抗體通過胎盤（IgG）或初乳（IgA）輸給被動(dòng)免疫嬰兒人工：同種或異種抗體注射31編輯ppt四、生物制品的免疫學(xué)基礎(chǔ)1、機(jī)體的抗感染免疫免疫類型作用途徑2、人工免疫人為地給機(jī)體輸入抗原以調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，或直接輸入免疫血清，使其獲得某種特殊抵抗力，用以預(yù)防或治療某些疾病者，稱為人工免疫（ariticialimmunization）。人工免疫用于預(yù)防傳染病時(shí)，常稱預(yù)防接種，它是增強(qiáng)人體特異免疫力的重要方法。32編輯ppt2、人工免疫人為地給機(jī)體輸入抗原以調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)（1）人工主動(dòng)免疫

人工自動(dòng)免疫（artificialactiveimmunization）是給機(jī)體輸入抗原物質(zhì)，使免疫系統(tǒng)因抗原刺激而產(chǎn)生類似感染時(shí)所發(fā)生的免疫過程，從而產(chǎn)生特異性免疫力。這種免疫力出現(xiàn)較慢，常有1-4周誘導(dǎo)期，但維持較久，可從半年到數(shù)年。用于人工自動(dòng)免疫的抗原性制劑，大部分由病原微生物直接制成，稱為疫苗；取微生物毒素去毒而制成，稱為類毒素。33編輯ppt（1）人工主動(dòng)免疫人工自動(dòng)免疫（artificial（2）人工被動(dòng)免疫

人工被動(dòng)免疫(artificialpassiveimmunization)是人為將抗毒素、正常人免疫球蛋白等現(xiàn)成免疫效應(yīng)物質(zhì)輸入機(jī)體，使機(jī)體立即獲得特異性免疫力以達(dá)到某些疾病防治的目的。維持時(shí)間常較短暫（2~3周），多用于治療或緊急預(yù)防傳染病。34編輯ppt（2）人工被動(dòng)免疫人工被動(dòng)免疫(artificial3.機(jī)體免疫的機(jī)制人類免疫系統(tǒng)主要分為兩大類，即體液免疫和細(xì)胞免疫體液免疫也就是通過形成抗體而產(chǎn)生的免疫能力；抗體是由血液和體液中的B細(xì)胞產(chǎn)生，主要存在于體液中，它可與入侵的外來抗原物質(zhì)相結(jié)合，使其失活。細(xì)胞免疫是指主要由各種淋巴細(xì)胞來執(zhí)行的免疫功能。35編輯ppt3.機(jī)體免疫的機(jī)制人類免疫系統(tǒng)主要分為兩大類，即體液抗原抗原肽細(xì)胞表面復(fù)合物活化的B細(xì)胞(漿細(xì)胞)淋巴因子活化的T細(xì)胞抗體殺滅抗原分子抗原顯示細(xì)胞(如樹狀細(xì)胞)吞噬、分解MHC蛋白質(zhì)(組織匹配性抗原)識(shí)別、激活殺傷性T細(xì)胞分泌激活釋放激活釋放圖10-1人體免疫系統(tǒng)工作機(jī)制示意圖36編輯ppt抗原抗原肽細(xì)胞表面復(fù)合物活化的B細(xì)胞(漿細(xì)胞)淋巴因子活化的37編輯ppt37編輯ppt第二節(jié)疫苗一、疫苗的定義一切通過注射或黏膜途徑接種，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對特定致病原的特異性抗體或細(xì)胞免疫，從而使機(jī)體獲得保護(hù)或消滅該致病原能力的生物制品統(tǒng)稱為疫苗，包括蛋白質(zhì)，多糖，核酸，活載體或感染因子。分為細(xì)菌類及其類毒素類疫苗，病毒類疫苗，蛋白疫苗及核酸疫苗。38編輯ppt第二節(jié)疫苗一、疫苗的定義38編輯ppt第一代疫苗滅活疫苗（也稱死疫苗）指的是用物理或化學(xué)方法將病原微生物殺死或滅活后制備的生物制品，如霍亂菌苗和百日咳菌苗等。必須多次接種，且注射量較大減毒活疫苗是用人工篩選或誘導(dǎo)變異的方法制備的使毒力高度減弱或基本無毒的活生物制品，如結(jié)核菌苗和痢疾活菌苗等。注射量少，維持時(shí)間長，只需接種一次。39編輯ppt第一代疫苗滅活疫苗（也稱死疫苗）指的是用物理或化學(xué)方法將病原第二代疫苗亞單位疫苗指的是提取病原微生物體內(nèi)能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的有效抗原成分制備的疫苗合成肽疫苗依據(jù)有效免疫原性肽段的氨基酸序列設(shè)計(jì)與合成免疫原性多肽基因工程疫苗將編碼免疫原的基因進(jìn)行克隆，修飾和改造并借助載體轉(zhuǎn)移至另一生物體基因組中，使之表達(dá)并產(chǎn)生所需抗原肽而制成的疫苗這類疫苗以其成分單一、效果明確、無致病作用為特點(diǎn)、但其工藝復(fù)雜、價(jià)格昂貴等問題限制了應(yīng)用的范圍。40編輯ppt第二代疫苗亞單位疫苗指的是提取病原微生物體內(nèi)能刺激機(jī)體產(chǎn)生亞基疫苗（subunitvaccine）概念：利用病原體的某一部分通過基因工程克隆而制得的疫苗稱為亞基疫苗。原理：對于致病性病毒而言，單純的外殼結(jié)合蛋白即可在受體內(nèi)激發(fā)生成足夠多的抗體。優(yōu)點(diǎn)：避免了直接使用病原物而使接受者可能致病的危險(xiǎn)亞基疫苗和用純的蛋白質(zhì)作為免疫原，可以避免由于外源蛋白、核酸的混雜而造成的種種副作用，使得這種疫苗具有更高的安全性有時(shí)因單獨(dú)使用特異蛋白能增強(qiáng)疫苗的效果41編輯ppt亞基疫苗（subunitvaccine）概念：利用病原體的某局限性：純化單一蛋白成本很高純化后的蛋白的構(gòu)象與在病原體體內(nèi)時(shí)可能不同，從而導(dǎo)致抗原性發(fā)生變化。由于亞基疫苗一般不具有感染性，很難激活殺傷性T細(xì)胞，即只能激活機(jī)體的體液免疫，因不能同時(shí)調(diào)動(dòng)細(xì)胞免疫，激活的免疫反應(yīng)一般較弱。42編輯ppt局限性：42編輯ppt活體重組疫苗通過基因工程的方法，對非致病性微生物（細(xì)菌和病毒）進(jìn)行改造，使之?dāng)y帶并表達(dá)某種特定病原體的抗原決定簇基因，產(chǎn)生免疫原性；或通過基因工程的方法修飾或刪除致病性微生物的毒性基因，使之仍保持免疫原性所制成的疫苗。在這種疫苗中抗原決定簇的構(gòu)象與致病性病原體的抗原的構(gòu)象相同或非常相似，克服了亞基疫苗在純化時(shí)，因蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變而導(dǎo)致的抗原的變化和單一抗原只能誘發(fā)較弱的免疫應(yīng)答的缺點(diǎn)。43編輯ppt活體重組疫苗通過基因工程的方法，對非致病性微生物（細(xì)菌和病毒44編輯ppt44編輯ppt第三代疫苗DNA疫苗（也稱基因疫苗或核酸疫苗），是用編碼有效免疫原的基因重組體，直接接種，使機(jī)體表達(dá)保護(hù)性抗原，并建立特異性免疫。如流感病毒核蛋白DNA疫苗近年發(fā)展起來的用表達(dá)特定抗原蛋白的核酸制成的核酸疫苗，因具有高效、持久、廣譜、簡便、穩(wěn)定、廉價(jià)、無致病性等特點(diǎn)發(fā)展得十分迅速、在短短幾年時(shí)間，就有7種核酸疫苗（HIV、HBV、單純保證病毒、流感病毒、結(jié)核病毒、瘧原蟲、T細(xì)胞淋巴瘤）經(jīng)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。45編輯ppt第三代疫苗DNA疫苗（也稱基因疫苗或核酸疫苗），是用編碼有效核酸疫苗核酸疫苗就是把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組的質(zhì)粒DNA直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因的在生物體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引發(fā)免疫反應(yīng)。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗46編輯ppt核酸疫苗核酸疫苗就是把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后優(yōu)勢誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答（體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)），其保護(hù)性免疫應(yīng)答對不同亞型的病原體具有交叉抵御作用；無潛在致病作用，具有可靠地安全性；能表達(dá)經(jīng)修飾的天然抗原，具有與天然抗原相同的構(gòu)象和抗原性穩(wěn)定性好、易純化、易保藏、可大規(guī)模生產(chǎn)、成本低；可將編碼不同抗原的基因構(gòu)建在同一個(gè)質(zhì)粒中，或?qū)⒉煌乖虻亩喾N重組質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用，制備多價(jià)核酸疫苗；既有預(yù)防作用也有治療作用。47編輯ppt優(yōu)勢誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生全面的免疫應(yīng)答（體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)），二、病毒類疫苗制造方法不同疫苗的制備工藝各異，但主要程序相似，圖為一般疫苗的制備流程。48編輯ppt二、病毒類疫苗制造方法48編輯ppt毒株毒種純化病毒懸液原苗原料感染動(dòng)物已感染組織滅活疫苗含病毒懸液動(dòng)物或胚胎健康動(dòng)物(或胚胎)組織生長細(xì)胞細(xì)胞懸液原苗活疫苗配制培養(yǎng)基滅活原苗滅活疫苗檢定稀釋檢定研磨懸浮解剖感染接種稀釋檢定稀釋檢定剪碎消化培養(yǎng)洗滌培養(yǎng)收獲滅活檢疫圖10-2病毒類疫苗的一般制備工藝流程49編輯ppt毒株毒種純化病毒懸液原苗原料感染動(dòng)物已感染組織滅活疫苗含病毒1.毒種的選擇和減毒毒種必須有特異的抗原性，能使機(jī)體誘發(fā)特定的免疫力，這種免疫力足以阻止有關(guān)的病原體的侵入和防止機(jī)體發(fā)生相應(yīng)的疾病。毒種應(yīng)有典型的形態(tài)和感染特定組織的特性，并在傳代的過程中，能長期保持生物學(xué)特性毒種易在特定的組織中大量繁殖50編輯ppt1.毒種的選擇和減毒毒種必須有特異的抗原性，能使機(jī)體誘發(fā)特毒種在人工繁殖的過程中，不應(yīng)產(chǎn)生神經(jīng)毒素或能引起機(jī)體損害的其他毒素。如為制備活疫苗，毒種在人工繁殖的過程中應(yīng)無恢復(fù)原致病力的現(xiàn)象，以免在疫苗的使用時(shí)，機(jī)體發(fā)生相應(yīng)的疾病毒株在分離時(shí)和形成毒種的全過程中應(yīng)不被其他病毒所污染，并需要保持歷史記錄51編輯ppt毒種在人工繁殖的過程中，不應(yīng)產(chǎn)生神經(jīng)毒素或能引起機(jī)體損害的其用于制備活疫苗的毒種，往往需要在特定的條件下將毒株經(jīng)過長達(dá)數(shù)十次或上百次傳代，降低其毒力，直至無臨床致病性，才能用于生產(chǎn)。52編輯ppt用于制備活疫苗的毒種，往往需要在特定的條件下將毒株經(jīng)過長達(dá)數(shù)2.病毒的繁殖所有動(dòng)物病毒，只能在活細(xì)胞中繁殖?；铙w動(dòng)物培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)53編輯ppt2.病毒的繁殖所有動(dòng)物病毒，只能在活細(xì)胞中繁殖。53編輯p活體動(dòng)物培養(yǎng)（在生產(chǎn)中已逐漸被淘汰）將病毒接種動(dòng)物的鼻腔，腹腔，腦腔或皮下，使之在相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)繁殖。缺點(diǎn)：是動(dòng)物飼養(yǎng)管理麻煩和具有潛在病毒傳播的危險(xiǎn)54編輯ppt活體動(dòng)物培養(yǎng)（在生產(chǎn)中已逐漸被淘汰）將病毒接種動(dòng)物的鼻腔，腹雞胚培養(yǎng)將病毒接種到7~14日齡雞胚和尿囊腔、卵黃囊或絨毛尿囊膜等處，接種的部分亦因病毒種類的不同各異。成本大，不宜于大規(guī)模使用黏病毒（如流感病毒、麻疹病毒等）和痘病毒（如牛痘病毒等）外，其他病毒已很少用雞胚進(jìn)行培養(yǎng)。55編輯ppt雞胚培養(yǎng)將病毒接種到7~14日齡雞胚和尿囊腔、卵黃囊或絨毛尿組織培養(yǎng)（廣泛用于病毒培養(yǎng)）目前，差不多所有人類和動(dòng)物的組織都能在試管中培養(yǎng)?；痉椒ㄈ缦拢簾o菌操作取出目的組織，以培養(yǎng)液漂洗。以鋒利無菌刀具割舍多余部分，將該組織分切成1~2mm小塊，移入培養(yǎng)瓶。加入合適的培養(yǎng)基浸潤組織。小心地將培養(yǎng)瓶平翻180°，擱置15~30min，以利組織塊的貼壁生長。翻回培養(yǎng)瓶，平臥靜置37℃培養(yǎng)。56編輯ppt組織培養(yǎng)（廣泛用于病毒培養(yǎng)）目前，差不多所有人類和動(dòng)物的組織細(xì)胞培養(yǎng)用于疫苗生產(chǎn)的主要有原代細(xì)胞培養(yǎng)（將動(dòng)物組織進(jìn)行一次培養(yǎng)而不再傳代）和傳代細(xì)胞培養(yǎng)（長期傳代的細(xì)胞株）兩種方法57編輯ppt細(xì)胞培養(yǎng)用于疫苗生產(chǎn)的主要有原代細(xì)胞培養(yǎng)（將動(dòng)物組織進(jìn)行一次細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的一般步驟：無菌取出目的細(xì)胞所在組織，以培養(yǎng)液漂洗干凈。以鋒利無菌刀具割舍多余部分，切成小組織塊。將小組織塊置解離液離散細(xì)胞。解離液含蛋白酶類，無鈣離子和鎂離子低速離心洗滌細(xì)胞后，將目的細(xì)胞吸移培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。大量培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞步驟：（1）微導(dǎo)管培養(yǎng)法（2）微載體培養(yǎng)法（3）微膠囊培養(yǎng)法58編輯ppt細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的一般步驟：58編輯ppt細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)主要控制以下內(nèi)容：1.常用的維持液和生長液2.培養(yǎng)條件的控制：pH值的控制7.0±0.2，培養(yǎng)基中的磷酸鹽和碳酸氫鈉有助于保持pH值的穩(wěn)定。CO2的提供CO2分壓保持在5%左右氧的提供用通氣、搖瓶或轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的方法培養(yǎng)容器內(nèi)壁潔凈度的控制合成洗滌劑可以用來取代硫酸——鉻酸混合液細(xì)菌污染的控制滅菌、抗生素培養(yǎng)溫度和時(shí)間的控制37℃、一般為2~4天，大多為3天59編輯ppt細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)主要控制以下內(nèi)容：1.常用的維持液和生長液59編輯滅活組織細(xì)胞懸液消化病毒稀釋液生長細(xì)胞原苗健康動(dòng)物滅活原苗稀釋鑒定分裝稀釋鑒定分裝活疫苗滅活疫苗軋蓋貼標(biāo)簽質(zhì)檢60編輯ppt滅活組織細(xì)胞懸液消化病毒稀釋液生長細(xì)胞原苗健康動(dòng)物滅活原苗稀3.疫苗的滅活不同的疫苗，其滅活的方法不同，有的用甲醛溶液（如乙型腦炎疫苗,脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗和斑疹傷寒疫苗等），有的則用酚溶液（如狂犬疫苗）所用滅活劑濃度則與疫苗中所含的動(dòng)物組織量有關(guān)。滅活溫度和時(shí)間，需視病毒的生物學(xué)性質(zhì)和熱穩(wěn)定性質(zhì)而定。有的可于37度滅活12d（如脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗），有的僅需18～20度下滅活3d（如斑疹傷寒疫苗）61編輯ppt3.疫苗的滅活不同的疫苗，其滅活的方法不同，有的用甲醛溶液4.疫苗的純化疫苗純化的目的，是去除存在的動(dòng)物組織，降低疫苗接種后可能引起的不良反應(yīng)。用細(xì)胞培養(yǎng)所獲得的疫苗，動(dòng)物組織量少，一般不需要特殊的純化。但在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，需用換液的方法除去培養(yǎng)基中的牛血清（無血清培養(yǎng)液的使用）62編輯ppt4.疫苗的純化疫苗純化的目的，是去除存在的動(dòng)物組織，降低疫5.凍干疫苗的穩(wěn)定性較差，一般在2～8℃下能保存12個(gè)月，但當(dāng)溫度升高后，效力很快降低。凍干的要點(diǎn)是：先將疫苗冷凍至共融點(diǎn)以下，在真空狀態(tài)下降水分直接由固態(tài)升華為氣態(tài)，然后緩慢升溫，不使疫苗在任何時(shí)間下有融解情況發(fā)生，直至完全干燥，凍干的疫苗在真空或充氮后密封保存，使其殘余水分保持3%以下。這樣的疫苗將能保持良好的穩(wěn)定性。63編輯ppt5.凍干疫苗的穩(wěn)定性較差，一般在2～8℃下能保存12個(gè)月，三、細(xì)菌類疫苗和類毒素類的一般制造方法一般細(xì)菌類疫苗和類毒素制備的工藝流程如圖64編輯ppt三、細(xì)菌類疫苗和類毒素類的一般制造方法一般細(xì)菌類疫苗和類毒減毒菌種病原菌菌株培養(yǎng)基菌種蛋白胨、肉浸液等原料培養(yǎng)毒素活疫苗菌苗原液菌液分離吸附精制類毒素精制類毒素類毒素稀釋檢定死菌菌苗死菌原液稀釋檢定殺菌過濾配制滅菌減毒檢定Al(OH)3吸附檢定純化脫毒圖10-3菌苗和類毒素的一般制備工藝流程65編輯ppt減毒菌種病原菌菌株培養(yǎng)基菌種蛋白胨、肉浸液等原料培養(yǎng)毒素活疫1.菌種的選擇用于菌苗的菌種，一般須具備以下幾個(gè)條件菌種必須持有特定的抗原性，能使機(jī)體誘發(fā)特定的免疫力，阻止有關(guān)病原體的入侵或防止機(jī)體發(fā)生相應(yīng)的疾病。菌種應(yīng)具有典型的形態(tài)，培養(yǎng)特性和生化特性，并在傳代的過程中，能長期保持這些特性。菌種應(yīng)易于在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)。如系制備死菌苗，菌種在培養(yǎng)過程中應(yīng)產(chǎn)生較小的毒性。如系制備活菌苗，菌種在培養(yǎng)過程中應(yīng)無恢復(fù)原毒性的現(xiàn)象，以免在使用時(shí)，機(jī)體發(fā)生相應(yīng)的疾病如系制備毒素，則菌種在培養(yǎng)的過程中應(yīng)能產(chǎn)生大量的典型毒素。66編輯ppt1.菌種的選擇用于菌苗的菌種，一般須具備以下幾個(gè)條件66編2.培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求除碳源，氮源和各種無機(jī)鹽類等培養(yǎng)微生物所需要的一般營養(yǎng)要素外，由于某些微生物生理上的特殊性，往往需要某些特殊營養(yǎng)物(如生長因子，某種氨基酸等)才能生長。67編輯ppt2.培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求除碳源，氮源和各種無機(jī)鹽類等培養(yǎng)微生物3.培養(yǎng)條件的控制（1）氧分壓各種細(xì)菌（需氧菌，厭氧菌和兼性厭氧菌）在生長時(shí)對氧量的要求不同。（2）溫度最適培養(yǎng)溫度，大都接近人體正常溫度（35～37℃）（3）pH值pH值不同，細(xì)菌的代謝可能不同，這是由于抑制或增進(jìn)了細(xì)菌的某些酶的活性引起（4）光培養(yǎng)不應(yīng)在陽光或X射線下進(jìn)行，以防止核糖核酸分子的變異，從而改變細(xì)菌的生物學(xué)特性（5）滲透壓一般細(xì)菌的細(xì)胞壁較堅(jiān)固，能在低滲環(huán)境下生存，在高滲透壓環(huán)境下細(xì)菌收縮而死亡。68編輯ppt3.培養(yǎng)條件的控制（1）氧分壓各種細(xì)菌（需氧菌，厭4.殺菌只有死菌疫苗制劑在制成原液后需要用物理或化學(xué)方法殺菌，而活菌苗不必經(jīng)過此步驟。各種菌苗所用的殺菌方法不相同，但殺菌的總目標(biāo)是徹底殺死細(xì)菌而又不影響菌苗的防病效力以傷寒菌苗為例，可用加熱殺菌法，甲醛溶液殺菌，丙酮?dú)⒕确椒⑺纻畻U菌69編輯ppt4.殺菌只有死菌疫苗制劑在制成原液后需要用物理或化學(xué)方法殺5稀釋，分裝和凍干經(jīng)殺菌的菌液，一般用含防腐劑的緩沖生理鹽水稀釋至所需的濃度,然后在無菌條件下分裝于適當(dāng)?shù)娜萜?。封口后?～10℃保存，直至使用。有些菌苗，特別是活菌苗，亦可于分裝后冷凍干燥，以延長它們的有效期。70編輯ppt5稀釋，分裝和凍干經(jīng)殺菌的菌液，一般用含防腐劑的緩沖生理鹽5.稀釋，分裝和凍干經(jīng)殺菌的菌液含防腐劑的緩沖生理鹽水稀釋濃度無菌條件下分裝封口活菌苗，亦可于分裝后冷凍干燥（2～10℃保存）71編輯ppt5.稀釋，分裝和凍干經(jīng)殺菌的菌液含防腐劑的緩沖生理鹽水稀釋第三節(jié)生物制品質(zhì)量要求與檢定一、生物制品的質(zhì)量要求生物制品必須具備兩個(gè)重要條件，即安全和有效。（WHO）要求各國生產(chǎn)的制品必須有專門檢定機(jī)構(gòu)負(fù)責(zé)成品的質(zhì)量檢定，并規(guī)定檢定部門要有熟練的高級技術(shù)人員，精良的設(shè)備條件，以保證檢定工作的質(zhì)量。未經(jīng)指定檢定部門正式發(fā)給檢定合格證的制品，不準(zhǔn)出廠使用。72編輯ppt第三節(jié)生物制品質(zhì)量要求與檢定一、生物制品的質(zhì)量要求72編輯生物制品的質(zhì)量檢定包括安全性和效力檢定兩方面。安全性包括毒性試驗(yàn)，防腐劑試驗(yàn)，熱原質(zhì)試驗(yàn)，安全試驗(yàn)，有關(guān)安全性的特殊試驗(yàn)等5項(xiàng)；效力檢定包括濃度測定（含菌數(shù)或純化抗原量），活菌率或病毒滴度測定，動(dòng)物保護(hù)率試驗(yàn)，免疫抗體滴度測定，穩(wěn)定性試驗(yàn)等5項(xiàng)73編輯ppt生物制品的質(zhì)量檢定包括安全性和效力檢定兩方面。73編輯二、生物制品的質(zhì)量檢定（一）理化性質(zhì)檢定（二）安全試驗(yàn)（三）效力試驗(yàn)74編輯ppt二、生物制品的質(zhì)量檢定（一）理化性質(zhì)檢定74編輯ppt（一）理化性質(zhì)檢定物理性狀的檢查（1）外觀（2）真空度及溶解速度（3）裝量蛋白質(zhì)含量測定純度檢查及鑒定試驗(yàn)相對分子質(zhì)量或分子大小測定防腐劑含量測定75編輯ppt（一）理化性質(zhì)檢定75編輯ppt1.物理性狀的檢查（1）外觀

通過特定的人工光源進(jìn)行目測，對外觀類型不同的制品，有不同的要求標(biāo)準(zhǔn)。（2）真空度及溶解速度真空封口的凍干制品，應(yīng)通過高頻火花真空測定器測定真空度，瓶內(nèi)應(yīng)出現(xiàn)藍(lán)紫色輝光。另外，取一定量凍干制品，按規(guī)程要求，加適量溶劑，其溶解速度應(yīng)在規(guī)定時(shí)限以下。（3）裝量各種裝量規(guī)格的制品，應(yīng)通過容量法測試，其實(shí)際裝量不得少于標(biāo)示量（粘瓶量除外）76編輯ppt1.物理性狀的檢查76編輯ppt2.蛋白質(zhì)含量測定目的：檢查其有效成分或蛋白雜志是否符合規(guī)程要求。根據(jù)蛋白質(zhì)含量，還可以計(jì)算出抗毒素的純度（U/g蛋白）方法：凱氏定氮法，雙縮脲法，酚試劑法（Lowry法），紫外吸收法77編輯ppt2.蛋白質(zhì)含量測定目的：檢查其有效成分或蛋白雜志是否符合規(guī)3.純度檢查及鑒別試驗(yàn)血液制品，抗毒素和類毒素等制品，需要進(jìn)行純度檢查或做鑒別試驗(yàn).方法；區(qū)帶電泳，免疫電泳，凝膠層析，超速離心等技術(shù)進(jìn)行分析78編輯ppt3.純度檢查及鑒別試驗(yàn)血液制品，抗毒素和類毒素等制品，需要4.相對分子質(zhì)量或分子大小測定對提純的蛋白質(zhì)制品如白蛋白，丙種球蛋白或抗毒素，在必要時(shí)需測定其單體，聚合體或裂解片段的相對分子質(zhì)量及分子的大??；提純的多糖體疫苗需測定多糖體的分子大小及相對含量。方法：凝膠層析法；SDS法；超速離心分析法79編輯ppt4.相對分子質(zhì)量或分子大小測定對提純的蛋白質(zhì)制品如白蛋白，5.防腐劑含量測定生物制品在制造過程中，為了脫毒，滅活或防止雜菌污染，常加入苯酚，甲醛，氯仿，硫柳汞等試劑作為防腐劑或滅活劑。防腐劑的含量過高能引起制品有效成分的破壞，注射時(shí)也易引起疼痛等不良反應(yīng)。各種防腐劑的含量都要求按《生物制品質(zhì)量檢定規(guī)程》控制在一定的限度以下80編輯ppt5.防腐劑含量測定生物制品在制造過程中，為了脫毒，滅活或防（二）安全試驗(yàn)一、毒種或主要原材料的檢查用于菌疫苗生產(chǎn)的菌毒種，除按有關(guān)規(guī)定嚴(yán)格管理外，投產(chǎn)前必須按《中國藥典》的規(guī)定，進(jìn)行毒力，特異性，培養(yǎng)特性等安全性試驗(yàn)；保證投產(chǎn)的血液制品不含病源物質(zhì)二、半成品（包括原液）的檢查檢查對活菌，活毒或毒素的處理，如殺菌，滅活和脫毒是否完善，是否有污染，滅活劑和防腐劑是否過量等81編輯ppt（二）安全試驗(yàn)一、毒種或主要原材料的檢查81編輯ppt三、成品檢查制品在分裝或凍干后，必須進(jìn)行出廠前的最后安全檢查。按制品的各項(xiàng)不同要求，進(jìn)行無菌試驗(yàn)，純菌試驗(yàn)，毒性試驗(yàn)，過敏性試驗(yàn)，熱原質(zhì)試驗(yàn)及安全試驗(yàn)（指某制品的單項(xiàng)試驗(yàn)）等82編輯ppt三、成品檢查82編輯ppt安全試驗(yàn)包括以下四個(gè)方面的內(nèi)容1.外源性污染的檢查除無菌與純菌試驗(yàn)外，還需進(jìn)行以下項(xiàng)目的檢查。（1）野毒檢查可能通過培養(yǎng)病毒的細(xì)胞（如雞胚細(xì)胞，地鼠腎細(xì)胞和猴腎細(xì)胞等）帶入有害的潛在病毒，這種外來病毒亦可在培養(yǎng)過程中繁殖，使制品污染，故應(yīng)進(jìn)行野毒檢查。83編輯ppt安全試驗(yàn)包括以下四個(gè)方面的內(nèi)容1.外源性污染的檢查83編輯（2）熱原質(zhì)試驗(yàn)血液制品，抗毒素，多糖菌苗等制品，其原材料或在制造過程中，有可能被細(xì)菌或其他物質(zhì)污染并帶入制品，引起機(jī)體的致熱反應(yīng)。以家兔試驗(yàn)法作為檢查熱原的基準(zhǔn)方法，對產(chǎn)品進(jìn)行熱原質(zhì)檢查。84編輯ppt（2）熱原質(zhì)試驗(yàn)84編輯ppt家兔法為各國藥典收載的方法，屬于體內(nèi)檢查法。該法檢查熱原的原理是基于家兔對熱原的反應(yīng)與人是相同的。系將一定劑量的供試品靜脈注入家兔體內(nèi)，然后在規(guī)定時(shí)間內(nèi)測定家兔體溫升高情況以判斷供試品所含熱原限度是否符合規(guī)定。具體方法及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參看《中國藥典》2000年版二部附錄。85編輯ppt家兔法為各國藥典收載的方法，屬于體內(nèi)檢查法。該法檢查熱原的鱟（hòu）試驗(yàn)法鑒于家兔法費(fèi)時(shí)較長，操作繁瑣，近年來發(fā)展了體外熱原試驗(yàn)法即鱟試驗(yàn)法，其原理是利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生的膠凝反應(yīng)來判斷細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定。鱟試劑來源于鱟（limuspolyphemus）血液的變形細(xì)胞溶解物(amebecytelysate)，其含有凝固酶原、凝固蛋白原及鈣離子。膠凝反應(yīng)如下：

86編輯ppt鱟（hòu）試驗(yàn)法鑒于家兔法費(fèi)時(shí)較長，操作繁瑣，近年來發(fā)展（3）乙型肝炎表面抗原（HBsAg）檢查血液制品除了對原材料（獻(xiàn)血員血液，胎盤血液）要嚴(yán)格進(jìn)行HBsAg檢查外，對成品亦應(yīng)進(jìn)行該項(xiàng)檢查87編輯ppt（3）乙型肝炎表面抗原（HBsAg）檢查血液制品除了對原2殺菌，滅活和脫毒檢查方法：常用甲醛溶液或苯酚作為殺菌劑或滅活劑（1）無菌試驗(yàn)基本與檢查外源性雜菌方法相同。目的主要是檢查有無生產(chǎn)菌（毒）種生長，先用液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋和增殖再進(jìn)行移種致適于本菌生長的培養(yǎng)基。88編輯ppt2殺菌，滅活和脫毒檢查方法：常用甲醛溶液或苯酚作為殺菌劑或（2）活毒檢查主要是檢查滅活疫苗。須用對原毒株敏感的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，一般多用小白鼠。（病毒，細(xì)菌（3）解毒試驗(yàn)主要用于檢查類毒素等需要脫毒的制品。須用敏感的動(dòng)物檢查。89編輯ppt（2）活毒檢查89編輯ppt3.殘余毒力和毒性物質(zhì)的檢查（1）殘余毒力檢查所謂殘余毒力是指生產(chǎn)這類制品的毒種本身是活的減毒（弱毒）株，允許有一定的輕微毒力存在，并能在接種動(dòng)物機(jī)體后反映出來。此項(xiàng)測定目的是控制活疫苗的殘余毒力在規(guī)定范圍。（2）無毒性檢查（一般安全試驗(yàn)）一般制品在沒有明確規(guī)定的動(dòng)物安全試驗(yàn)項(xiàng)目時(shí)，或不明了某制品是否會(huì)有何種不安全因素時(shí)，常采用較大劑量給小鼠或豚鼠作皮下或腹腔注射，觀察動(dòng)物有無不良反應(yīng)。90編輯ppt3.殘余毒力和毒性物質(zhì)的檢查（1）殘余毒力檢查所謂殘（3）毒性檢查死菌苗,組織培養(yǎng)疫苗或白蛋白等制品，經(jīng)殺菌，滅活，提純等制造工藝后，其本身所含的某種成分可能仍具有毒性，當(dāng)注射一定量時(shí)，可引起機(jī)體的有害反應(yīng)，嚴(yán)重的可使動(dòng)物死亡。故對此類制品的毒性反應(yīng)必須試驗(yàn)。（4）防腐劑檢查除活菌苗，活疫苗及輸注用血液制品外，其他凡加有一定量防腐劑的制品，除用化學(xué)方法作定量測定外，還應(yīng)作動(dòng)物試驗(yàn)。含有苯酚防腐劑者，采用小白鼠試驗(yàn)，觀察注射后的顫栗程度及局部反應(yīng)。以便控制產(chǎn)品中防腐劑的含量。91編輯ppt（3）毒性檢查死菌苗,組織培養(yǎng)疫苗或白蛋白等制品，經(jīng)4.過敏性物質(zhì)的檢查（1）過敏性試驗(yàn)（變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)）采用異體蛋白為原料制成的治療制劑如治療血清，代人血漿等，需檢查其中過敏原的去除是否達(dá)到允許限度。一般用豚鼠進(jìn)行試驗(yàn)。（2）牛血含量的測定主要用于檢查組織培養(yǎng)疫苗（如乙型腦炎疫苗，麻疹疫苗，狂犬病疫苗），要求其含量不超過1ug/ml。由于牛血清是一種異體蛋白，如制品中殘留量偏高，多次使用能引起機(jī)體變態(tài)反應(yīng)，故應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測。測定方法一般采用間接血球凝集抑制試驗(yàn)或反向血球凝集試驗(yàn)92編輯ppt4.過敏性物質(zhì)的檢查（1）過敏性試驗(yàn)（變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)）92編（3）血型物質(zhì)的檢測用人胎盤血或靜脈血制備的白蛋白和丙種球蛋白，常有少量的A或B血型物質(zhì)，可使受試者產(chǎn)生高滴度的抗A，抗B抗體，O型血孕婦使用后，可能引起新生兒溶血癥。因此，對這類制品應(yīng)檢測血型物質(zhì)，并應(yīng)規(guī)定其限量。（抗抗體：）93編輯ppt（3）血型物質(zhì)的檢測93編輯ppt（三）效力試驗(yàn)1.免疫力試驗(yàn)（1）定量免疫定量攻擊法（2）變量免疫定量攻擊法（3）定量免疫變量攻擊法2.活菌數(shù)和活病毒滴度測定（1）活菌數(shù)（率）測定（2）活病毒滴度測定3.類毒素和抗毒素的單位測定（1）絮狀單位（L1）測定（2）結(jié)合單位（BU）測（3）抗毒素單位測定94編輯ppt（三）效力試驗(yàn)1.免疫力試驗(yàn)94編輯ppt4.血清學(xué)試驗(yàn)5.其他有關(guān)效力的檢定和評價(jià)（1）鑒別試驗(yàn)（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)（3）人體效果觀察人體皮膚反應(yīng)觀察血清學(xué)效果觀察流行病學(xué)效果觀察95編輯ppt4.血清學(xué)試驗(yàn)95編輯ppt（三）效力試驗(yàn)生物制品的效力：1、指制品中有效成分的含量水平2、指制品在機(jī)體中建立自動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫后所引起的抗感染作用的能力診斷用品，其效力則表現(xiàn)在診斷試驗(yàn)的特異性和敏感性。96編輯ppt（三）效力試驗(yàn)生物制品的效力：96編輯ppt效力試驗(yàn)包括以下五個(gè)方面的內(nèi)容：1、免疫力試驗(yàn)將制品對動(dòng)物進(jìn)行自動(dòng)（或被動(dòng)）免疫后，用活菌、活毒或毒素攻擊，從而判定制品的保護(hù)力強(qiáng)弱。（1）定量免疫定量攻擊法用豚鼠或小鼠，先以定量制品（抗原）免疫2-5周后，再以相應(yīng)的定量[最小致死量（MLD）或最小感染量（MID）毒種或毒素攻擊，觀察動(dòng)物的存活數(shù)或不受感染的情況，以判定制品的效力]97編輯ppt效力試驗(yàn)包括以下五個(gè)方面的內(nèi)容：1、免疫力試驗(yàn)97編輯ppt（2）變量免疫定量攻擊法即50%有效免疫劑量（effectivedoseED50，infectiousdoseID50）測定法。疫苗經(jīng)系列稀釋，制成不同的免疫劑量，分別免疫各組動(dòng)物，間隔一定日期后，各免疫組均用同一劑量的毒種攻擊，觀察一定時(shí)間，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出能使50%的動(dòng)物獲得保護(hù)的免疫劑量。此法多用小白鼠進(jìn)行，其優(yōu)點(diǎn)是較為敏感和簡便。98編輯ppt（2）變量免疫定量攻擊法即50%有效免疫劑量（effe（3）定量免疫變量攻擊法即保護(hù)指數(shù)（免疫指數(shù)）測定法。動(dòng)物經(jīng)制品免疫后，其耐受毒種的攻擊量相當(dāng)于未免疫動(dòng)物耐受量的倍數(shù)，稱為保護(hù)指數(shù)。此法常用于死疫苗及滅活疫苗的效力檢定。99編輯ppt（3）定量免疫變量攻擊法99編輯ppt（4）被動(dòng)保護(hù)力測定先用其他免疫機(jī)體（如人體）獲得某制品的相應(yīng)抗血清，用以注射動(dòng)物，待一至數(shù)日后，用相應(yīng)的毒種攻擊，觀察血清抗體的被動(dòng)免疫所引起的保護(hù)作用100編輯ppt（4）被動(dòng)保護(hù)力測定100編輯ppt2、活菌數(shù)和活病毒滴度測定（1）活菌數(shù)（率）測定卡介苗、鼠疫活菌苗、布氏菌病活菌苗、炭疽活菌苗等多以制品中抗原菌的活存數(shù)（率）表示其效力。比濁法稀釋平板計(jì)數(shù)，10倍或2倍系列稀釋測定含菌濃度計(jì)算活菌率101編輯ppt2、活菌數(shù)和活病毒滴度測定10倍或2倍系列稀釋測定含菌濃度計(jì)（2）活病毒滴度測定活疫苗（如麻疹疫苗、流感活疫苗）多以病毒滴度表示其效力。病毒滴度也即病毒的毒力，或毒價(jià)，衡量病毒滴度的單位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MID)和半數(shù)致死量(LD50)，其中以LD50最常用。常用組織培養(yǎng)法或雞胚感染法測定102編輯ppt（2）活病毒滴度測定102編輯ppt3、類毒素和抗毒素的單位測定（1）絮狀單位（L1）測定能和一個(gè)單位抗毒素發(fā)生絮狀沉淀反應(yīng)的（類）毒素量，即為一個(gè)絮狀單位。此單位數(shù)常用以表示類毒素或毒素的效價(jià)。（2）結(jié)合單位（BU）測定能與0.01單位抗毒素中和的最小類毒素量稱為一個(gè)結(jié)合單位。常用以表示破傷風(fēng)類毒素的效價(jià)。用中和法通過小鼠測定。103編輯ppt3、類毒素和抗毒素的單位測定（1）絮狀單位（L1）測定103（3）抗毒素單位測定目前國際上都用“國際單位”（IU）代表抗毒素的效價(jià)概念：當(dāng)與一個(gè)致死限量的毒素作用后，再注射動(dòng)物（小白鼠、豚鼠或家兔），仍能使該動(dòng)物在一定時(shí)間內(nèi)（96h左右）死亡或呈現(xiàn)一定反應(yīng)所需要的最小抗毒素量，即為一個(gè)抗毒素國際單位。常用中和法測定。104編輯ppt（3）抗毒素單位測定104編輯ppt4、血清學(xué)試驗(yàn)主要用來測定抗體水平或抗原活性。預(yù)防制品接種機(jī)體后，可產(chǎn)生相應(yīng)抗體，并可保持較長時(shí)間。常用以血清學(xué)方法檢查抗體或抗原活性，并多在體外進(jìn)行試驗(yàn)。包括沉淀試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、間接血凝抑制試驗(yàn)、反向血凝試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)及中和試驗(yàn)等。105編輯ppt4、血清學(xué)試驗(yàn)105編輯ppt5、其他有關(guān)效力的檢定和評價(jià)（1）鑒別試驗(yàn)亦稱同質(zhì)性（identity）試驗(yàn)。一般采用已知特異血清（國家檢定機(jī)構(gòu)發(fā)給的標(biāo)準(zhǔn)血清或參考血清）和適宜方法對制品進(jìn)行特異性鑒別。（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)制品的質(zhì)量水平，不僅表現(xiàn)在出廠時(shí)效力檢定結(jié)果，而且還表現(xiàn)于效力穩(wěn)定性。因而需對產(chǎn)品進(jìn)行穩(wěn)定性測定和考察。一般方法是將制品放置不同溫度（2~10℃,25℃,37℃），觀察不同時(shí)間（1周，2周，3周….;1月，2月，3月….）的效力下降情況。106編輯ppt5、其他有關(guān)效力的檢定和評價(jià)（1）鑒別試驗(yàn)亦稱同質(zhì)性（（3）人體效果觀察有些用于人體的制品，特別是新制品，僅有實(shí)驗(yàn)室檢定結(jié)果是不夠的，必須進(jìn)行人體效果觀察，以考核和證實(shí)制品的實(shí)際質(zhì)量。觀察方法常有以下幾種。人體皮膚反應(yīng)觀察一般在接種制品的一定時(shí)間后（1月以上），再于皮內(nèi)注射反應(yīng)原，觀察24-48h的局部反應(yīng)，以出現(xiàn)紅腫、浸潤或硬結(jié)反應(yīng)為陽性，表示接種成功。陽轉(zhuǎn)率的高低反映制品的免疫效果，也是細(xì)胞免疫功能的表現(xiàn)。107編輯ppt（3）人體效果觀察107編輯ppt血清學(xué)效果觀察將制品接種人體后，定期采血檢測抗體水平，并可連續(xù)觀察抗體的動(dòng)態(tài)變化，以評價(jià)制品的免疫效果和持久性。它反映接種后的體液免疫狀況。流行病學(xué)效果觀察在傳染病流行期的疫區(qū)現(xiàn)場，考核制品接種后的流行病學(xué)效果；108編輯ppt血清學(xué)效果觀察將制品接種人體后，定期采血檢測抗體水平，三、生物制品檢定標(biāo)準(zhǔn)品由于試驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異，所用試劑或原材料的純度或敏感性不一致等原因，往往導(dǎo)致同一批制品的檢定結(jié)果也往往相互懸殊。用一已知效力的制品作為對照，由對照結(jié)果來校正檢定試驗(yàn)結(jié)果。這種用作對照的制品，就是生物標(biāo)準(zhǔn)，也就是通常所說的標(biāo)準(zhǔn)品或參考品109編輯ppt三、生物制品檢定標(biāo)準(zhǔn)品由于試驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異，所用試劑或生物制品的標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，必須由世界衛(wèi)生組織或國家檢定機(jī)構(gòu)審定分發(fā)。如果是由世界衛(wèi)生組織審定發(fā)出的，就稱為國際標(biāo)準(zhǔn)；如果是國家檢定機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)發(fā)出的，則稱為國家標(biāo)準(zhǔn)。1.生物制品標(biāo)準(zhǔn)品的要求：（1）要求準(zhǔn)確（2）要求凍干（3）要求熔封（4）要有瓶簽、說明書和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)110編輯ppt生物制品的標(biāo)準(zhǔn)品或參考品，必須由世界衛(wèi)生組織或國家檢定機(jī)構(gòu)審2.標(biāo)準(zhǔn)品的分級（1）國際生物標(biāo)準(zhǔn)（2）國際參考制品（3）國際生物參考試劑111編輯ppt2.標(biāo)準(zhǔn)品的分級111編輯ppt一、卡介苗疫苗病原菌是結(jié)合分歧桿菌?？ń槊缡荖ocard1902年從牛體分離的一株牛型結(jié)核桿菌。如果向培養(yǎng)這株結(jié)合桿菌的甘油土豆培養(yǎng)基中加入牛膽汁，則菌種逐步緩慢喪失其毒力。Calmette和Guerin二人從1906年開始采用這個(gè)方法，約每2~3星期傳代一次，前后共傳了231代，經(jīng)約13年時(shí)間，獲得一株穩(wěn)定的減毒株。第三節(jié)重要的疫苗制備工藝112編輯ppt一、卡介苗疫苗第三節(jié)重要的疫苗制備工藝112編輯ppt牛型結(jié)核桿菌減毒株改良的蘇通培養(yǎng)基37~39℃10~12天收集幼齡培養(yǎng)物菌膜盛有不銹鋼珠瓶內(nèi)適量稀釋液低溫下研磨原液稀釋分裝菌苗卡介苗表面培養(yǎng)流程圖113編輯ppt牛型結(jié)核桿菌減毒株改良的蘇通培養(yǎng)基37~39℃1蘇通培養(yǎng)基在100ml蒸餾水中加入：

天門冬素-0.4g

枸櫞酸鹽-0.2g

磷酸氫二鉀-0.05g

MgSO4.7H2O-0.05g

枸櫞酸鐵銨-0.05g

甘油-6ml

補(bǔ)加蒸餾水到100ml

用氨水調(diào)節(jié)pH7.27.4114編輯ppt蘇通培養(yǎng)基在100ml蒸餾水中加入：

天門冬素-0.4g

枸二、白喉疫苗1923年Romon向白喉毒素內(nèi)加入0.3%~0.4%甲醛，放置38℃,4周后，其毒性消失，但能使動(dòng)物產(chǎn)生免疫力，從而制得白喉毒素的類毒素。115編輯ppt二、白喉疫苗115編輯ppt干燥菌種全培養(yǎng)液產(chǎn)毒培養(yǎng)液沉淀精制毒素濾液精制類毒素吸附精制類毒素種子傳代保浦氏培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基34-35℃，48-54h培養(yǎng)0.15%甲醛(NH4)2SO4二段沉淀法分離精制保浦氏培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基34-35℃，50h左右脫毒0.2%甲醛，室溫2-3d0.3%甲醛，36-37℃，35dAlPO4或Al(OH3)吸附溶解，透析，除菌過濾圖10-4吸附精制白喉類毒素的工藝流程116編輯ppt干燥菌種全培養(yǎng)液產(chǎn)毒培養(yǎng)液沉淀精制毒素濾液精制類毒素吸附精制（1）菌種

采用產(chǎn)高效價(jià)毒素的菌株（Pw8）培養(yǎng)基：改良馬丁培養(yǎng)基：主要成分為豬胃消化液及牛肉水，將豬胃消化液繼續(xù)用胰酶消化，提高其氨基氮含量，菌種產(chǎn)毒能力得到很大提高保浦市培養(yǎng)基：胰酶消化牛肉后煮沸過濾形成的消化液，再加入酵母浸液、乳酸、氯化鈣等成分構(gòu)成。改良林氏培養(yǎng)基：由Linggood原制培養(yǎng)基改良而成。117編輯ppt（1）菌種117編輯ppt（2）培養(yǎng)產(chǎn)毒a.產(chǎn)毒培養(yǎng)基用保浦氏培養(yǎng)基。在培養(yǎng)過程中必需加入細(xì)菌必需的氨基酸、糖類、各種生長因子及無機(jī)離子。b.培養(yǎng)采用深層培養(yǎng)法，以利于細(xì)菌生長過程中能源的補(bǔ)充、供氧量的調(diào)節(jié)及pH的控制，更好發(fā)揮細(xì)菌產(chǎn)毒的能力。溫度控制在34~35℃，pH值為7.6~8.0，用麥芽糖替代葡萄糖為主要碳源，適當(dāng)補(bǔ)充氨基酸以滿足培養(yǎng)過程中氮水平的穩(wěn)定。118編輯ppt（2）培養(yǎng)產(chǎn)毒118編輯ppt（3）脫毒毒素經(jīng)甲醛加溫處理以后，去除毒性而保留其抗原性，形成類毒素。a。脫毒應(yīng)考慮溫度、pH、甲醛濃度以及毒素自身等影響：一般來說溫度高、pH高、甲醛濃度高都利于毒素脫毒，但同時(shí)卻易造成抗原的損失，破壞其免疫原性。毒素濃度過高也不利于毒素脫毒，要適當(dāng)?shù)南♂尅囟纫话憧刂圃?7~39℃，pH值控制在7.0~7.5較為適宜。119編輯ppt（3）脫毒毒素經(jīng)甲醛加溫處理以后，去除毒性而保留其抗原性，b.類毒素生產(chǎn)有脫毒后精制和精制后脫毒兩種方式。原制毒素脫毒培養(yǎng)物濾液加0.5%~0.6%甲醛，調(diào)pH7.5~7.6,于37~39℃脫毒30d。此法質(zhì)量穩(wěn)定，毒性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象極少，但由于含大量培養(yǎng)基殘留物質(zhì)，進(jìn)一步提高純度有困難，且脫毒體積大，不利于操作。精制毒素脫毒將精制毒素進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，再脫毒。方法同上。但是為了防止毒性逆轉(zhuǎn)的發(fā)生，要加深脫毒20d。工藝緊湊利于操作，且可獲得高純度制品。但是易發(fā)生毒性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，而長時(shí)間的脫毒易造成抗原易損傷。120編輯pptb.類毒素生產(chǎn)有脫毒后精制和精制后脫毒兩種方式。120編輯（4）白喉類毒素的精制去除細(xì)菌代謝的產(chǎn)物（菌體蛋白、小分子有機(jī)物等）及培養(yǎng)基中殘留的有機(jī)物、無機(jī)物等非特異性雜志，提高白喉類毒素的純度，降低接種副反應(yīng)。a.毒素或類毒素濾液中加入0.5%NaHCO3、23%~27%的硫酸銨、適量的活性炭，溶解后過濾，沉淀廢棄，收集濾液。b.上訴濾液再加17%~20%硫酸銨，溶解后過濾，濾液濾清后廢棄，收集沉淀。c.收集的沉淀用適量的注射用水溶解，利于透析的方法去除殘留的硫酸銨，加入防腐劑（0.01%硫柳汞），除菌過濾。121編輯ppt（4）白喉類毒素的精制121編輯ppt(5)精制類毒素的吸附目的：為使白喉類毒素效力提高，降低接種副反應(yīng)，利于產(chǎn)生良好的免疫效果，同時(shí)減少免疫接種次數(shù)。方法：典型的吸附劑為Al(OH)3，以1.5%磷酸鹽緩沖液，并加入精制白喉類毒素使其最終含量為30~50Lf/ml?？贵w效價(jià)測定方法

采用絮狀反應(yīng)法。即以不同量的抗毒素，和一定量的毒素在試管中混合，觀察最早發(fā)生絮狀沉淀反應(yīng)的一管，計(jì)算和一單位抗毒素首先發(fā)生絮狀沉淀反應(yīng)的毒素量，即為一個(gè)絮狀沉淀單位(Lf)。Lf/ml=抗毒素單位/ml*抗毒素ml數(shù)÷毒素ml數(shù)122編輯ppt(5)精制類毒素的吸附122編輯ppt試驗(yàn)血清每毫升含抗毒素430個(gè)抗毒單位，請問第五管毒素量？123編輯ppt試驗(yàn)血清每毫升含抗毒素430個(gè)抗毒單位，請問第五管毒素量？1三、流行性感冒疫苗每年約5億人患流感，而且流感并發(fā)癥死亡的人數(shù)超過了100萬。流感疫苗每人每年需注射一次，接種后7~15天產(chǎn)生抗體，在體內(nèi)延續(xù)一年，基本上能免除或降低流感對身體的危害。對雞蛋過敏的人應(yīng)禁止接種發(fā)熱、急性病及慢性病活動(dòng)期者應(yīng)推遲接種。接種疫苗預(yù)防流感的有效率可達(dá)80％，并可減少類流感77．4％，減輕上感(包括普通感冒)癥狀44．8％。124編輯ppt三、流行性感冒疫苗124編輯ppt流感疫苗中作為抗原的主要有效成分是血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)125編輯ppt流感疫苗中作為抗原的主要有效成分是血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶我國目前主要應(yīng)用的預(yù)防流感的滅活疫苗有3種，即：全病毒流感疫苗、流感裂解疫苗、主要由HA和NA抗原制成的亞單位疫苗。每種疫苗均含有甲1亞型、甲3亞型和乙型3種流感滅活病毒或抗原組份。126編輯ppt我國目前主要應(yīng)用的預(yù)防流感的滅活疫苗有3種，即：全病毒流感疫全病毒滅活疫苗免疫原性不錯(cuò)但副作用較大；亞單位疫苗副作用較小但免疫原性一般；裂解疫苗免疫原性和副作用比較理想，且成本低，也是目前世界及中國使用最為普遍的流感疫苗。127編輯ppt全病毒滅活疫苗免疫原性不錯(cuò)但副作用較大；127編輯ppt滅活疫苗的制備：a.將病毒毒種稀釋后，接種于無特殊病原體的9~10日齡雞胚胎尿囊腔中，32~34℃培養(yǎng)48~80h，收取高滴度的尿囊液和羊水b.以蔗糖為介質(zhì)進(jìn)行速率區(qū)帶超速離心純化毒粒。蔗糖的濃度為30~50%，25000r/min，15℃離心8h，分步收集合并HA高滴度峰，此步去除大部分雜質(zhì)并濃縮病毒c.加入滅活劑β-丙烯內(nèi)脂，20℃滅活72hd.超濾技術(shù)脫去蔗糖。分裝成成品。128編輯ppt滅活疫苗的制備：128編輯ppt流感裂解疫苗：a.將凍干病毒毒種稀釋后，接種于無特殊病原體的9~10日齡雞胚胎尿囊腔中，35℃培養(yǎng)48h，冷卻雞胚，收集尿囊液。b.以10000（相對分子量）超濾膜濾器超濾濃縮后，經(jīng)Sepharose4FF凝膠柱層析純化，分步收集毒粒富集液。c.加入終濃度1.0%的TritonX-100裂解90min，再經(jīng)蔗糖梯度超速離心純化，分步收集抗原峰。d.合并后超濾除去蔗糖，稀釋并配型129編輯ppt流感裂解疫苗：129編輯ppt(四)乙型肝炎疫苗重組CHO細(xì)胞乙型肝炎疫苗，利用DNA操作技術(shù)將編碼HBsAg的基因拼接入CHO細(xì)胞染色體中而獲得。待培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)HBsAg含量達(dá)到10mg/L以上時(shí)收獲培養(yǎng)液。（1）沉淀-超速離心-凝膠過濾法上清液以50%飽和(NH4)2SO4溶液沉淀，沉淀物溶解后再以50%飽和(NH4)2SO4溶液沉淀沉淀用生理鹽水溶解后超濾兩次KBr等密度區(qū)帶超速離心（25000r/min）分步收集合并密度梯度離心液中HBsAg特異活性峰。過Sepharose4B層析柱，收集洗脫液中的HBsAg富集峰，超濾透析后再經(jīng)超速平衡離心，收集HBsAg特異活性峰，即制得精制HBsAg130編輯ppt(四)乙型肝炎疫苗130編輯ppt（2）三步層析法培養(yǎng)上清液經(jīng)過Butyl-S-SepharoseFF為介質(zhì)的疏水作用層析，以DEAE-SepharoseFF為介質(zhì)的陰離子交換層析以Sepharose4FF為介質(zhì)的凝膠過濾層析制得精制HBsAg。131編輯ppt（2）三步層析法131編輯ppt純化獲得的HBsAg加入終濃度為1：4000的甲醛于37℃保溫72h，再經(jīng)超濾，濃縮及除菌過濾后得到原液，原液吸附Al(OH)3佐劑并加入防腐劑為半成品，經(jīng)分包裝即為成品。132編輯ppt純化獲得的HBsAg加入終濃度為1：4000的甲醛于37℃保一.核酸疫苗簡介核酸疫苗(nucleicacidvaccine),也稱基因疫苗(geneticvaccine),是指被用作疫苗的帶有編碼外源蛋白抗原基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，包括DNA疫苗和RNA疫苗。

第四節(jié)核酸疫苗133編輯ppt一.核酸疫苗簡介

第四節(jié)核酸疫苗133編輯ppt將含有編碼的蛋白基因序列的質(zhì)粒載體，經(jīng)肌肉注射或微彈轟擊等方法導(dǎo)入宿主體內(nèi)，通過宿主細(xì)胞表達(dá)抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，以達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。DNA疫苗導(dǎo)入宿主體內(nèi)后，被細(xì)胞（組織細(xì)胞、抗原遞呈細(xì)胞或其它炎性細(xì)胞）攝取，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)病原體的蛋白質(zhì)抗原，通過一系列的反應(yīng)刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫。134編輯ppt將含有編碼的蛋白基因序列的質(zhì)粒載體，經(jīng)肌肉注射或微彈轟擊等方135編輯ppt135編輯ppt

核酸疫苗的發(fā)展史真正開始于20世紀(jì)90年代。

在過去的20世紀(jì)中，疫苗研究取得了巨大成功，它是繼柯赫、巴斯德等人的科學(xué)突破而迅速發(fā)展起來的，經(jīng)歷了一個(gè)由“期盼”到“實(shí)現(xiàn)”這樣一個(gè)偉大的歷史轉(zhuǎn)變過程。疫苗免疫接種所經(jīng)過的第一次重大變革是由Pasteur等研制開發(fā)的減毒或滅活的疫苗，而第二代疫苗包括亞單位疫苗，合成肽疫苗和基因工程疫苗。

二.核酸疫苗產(chǎn)生136編輯ppt

核酸疫苗的發(fā)展史真正開始于20世紀(jì)90年代。

1990年，wolff等偶然發(fā)現(xiàn)給小鼠肌肉注射外源性重組質(zhì)粒后，質(zhì)粒被攝取并能在體內(nèi)至少兩個(gè)月穩(wěn)定地表達(dá)所編碼蛋白。

1991年，Williams等發(fā)現(xiàn)外源基因輸入體內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。

1992年，Tang等將表達(dá)人生長激素的基因質(zhì)粒DNA導(dǎo)入小鼠皮內(nèi)，小鼠產(chǎn)生特異性抗體，從而提出了基因免疫的概念。

1993年，Ulmer等證實(shí)小鼠肌肉注射含有編碼甲型流感病毒核蛋白的重組質(zhì)粒后，可有效地保護(hù)小鼠抗不同亞型、分離時(shí)間相隔34年的流感病毒的攻擊。隨后的大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都說明在合適的條件下，DNA接種后既能產(chǎn)生細(xì)胞免疫又能引起體液免疫。因此，1994年在日內(nèi)瓦召開的專題會(huì)議上將這種疫苗定名為核酸疫苗。

核酸疫苗的出現(xiàn)與發(fā)展是疫苗發(fā)展史上的第三次革命。137編輯ppt

1990年，wolff等偶然發(fā)現(xiàn)138編輯ppt138編輯ppt三.核酸疫苗的特點(diǎn)

1免疫保護(hù)力增強(qiáng)

2制備簡單，省時(shí)省力

3同種異株交叉保護(hù)

4應(yīng)用較安全

5產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答

6貯存、運(yùn)輸方便

7可用于防治腫瘤139編輯ppt三.核酸疫苗的特點(diǎn)

1免疫保護(hù)力增強(qiáng)

2制備簡單，省時(shí)1免疫保護(hù)力增強(qiáng)

接種后蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，直接與組織相容性復(fù)合物MHCI或II類分子結(jié)合，同時(shí)引起細(xì)胞和體液免疫，對慢性病毒感染性疾病等依賴細(xì)胞免疫清除病原的疾病的預(yù)防更加有效。

2制備簡單，省時(shí)省力

核酸疫苗作為一種重組質(zhì)粒，易在工程菌內(nèi)大量擴(kuò)增，提純方法簡單，且可將編碼不同抗原基因的多種重組質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用，制備多價(jià)核酸疫苗，這樣可大大減少人力、物力、財(cái)力以及多次接種帶來的應(yīng)激反應(yīng)。

140編輯ppt1免疫保護(hù)力增強(qiáng)

接種后蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，直接3同種異株交叉保護(hù)

這是基因疫苗的最大優(yōu)點(diǎn)之一。在制備基因疫苗時(shí)，可通過對基因表達(dá)載體所攜帶的靶基因進(jìn)行改造，從而選擇抗原決定簇。

4應(yīng)用較安全

接種核酸疫苗后，蛋白質(zhì)抗原在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，無因毒力返祖或殘留毒力病毒顆粒而引發(fā)疫病的危險(xiǎn)，也不會(huì)引起對機(jī)體的不良反應(yīng)。

5產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答

免疫具有持久性，一次接種可獲得長期免疫力，無需反復(fù)多次加強(qiáng)免疫。Wolff等報(bào)道，在注射后19個(gè)月仍可檢測到外源基因相當(dāng)數(shù)量的表達(dá)。141編輯ppt3同種異株交叉保護(hù)

這是基因疫苗的最大優(yōu)點(diǎn)之一。在制6貯存、運(yùn)輸方便

核酸疫苗的質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性好，便于貯存和運(yùn)輸，無須冷藏。

7可用于防治腫瘤

細(xì)胞毒性T細(xì)胞

（CytotoxicTLymphocytes，CTL）應(yīng)答也是機(jī)體殺死癌變細(xì)胞的有效清除途徑。若能找到在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵蛋白就能制備腫瘤的CTL疫苗。該基因疫苗接種后，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生CTL免疫應(yīng)答，對細(xì)胞的惡變進(jìn)行免疫監(jiān)視，對癌變的細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答從而為癌癥的預(yù)防和免疫治療提供強(qiáng)有力的新式武器。142編輯ppt6貯存、運(yùn)輸方便

核酸疫苗的質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性好，便于第五節(jié)DNA重組藥物一、概述DNA重組藥物，又稱基因工程藥物（geneticallyengineereddrug），是指利用DNA重組技術(shù)（基因工程技術(shù)）研制和生產(chǎn)的藥物，主要包括重組蛋白質(zhì)藥物、多肽藥物、反義核酸藥物、DNA藥物和基因工程抗體等。143編輯ppt第五節(jié)DNA重組藥物一、概述143編輯ppt二、DNA重組藥物的特點(diǎn)穩(wěn)定性差，易腐敗使用量低，但藥理活性極高具有細(xì)胞和組織特異性注射用藥有特殊要求144編輯ppt二、DNA重組藥物的特點(diǎn)144編輯ppt三、DNA重組藥物制備舉例（一）干擾素（interferon;IFN）干擾素是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復(fù)制；同時(shí)還可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強(qiáng)抗病毒能力。干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(zhì)（主要是糖蛋白），是一種由單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。它們在同種細(xì)胞上具有廣譜的抗病毒、影響細(xì)胞生長，以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性。145編輯ppt三、DNA重組藥物制備舉例145編輯ppt干擾素有Ⅰ型和Ⅱ型，以及干擾素樣細(xì)胞因子，Ⅰ型干擾素有7種：IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-δ和IFN-τ，人類沒有IFN-δ和IFN-τ；Ⅱ型僅有IFN-γ。146編輯ppt干擾素有Ⅰ型和Ⅱ型，以及干擾素樣細(xì)胞因子，Ⅰ型干擾素有7種：rhIFNα-2b生產(chǎn)工藝?yán)砘再|(zhì)IFNα-2b是由165個(gè)氨基酸組成的單肽鏈蛋白質(zhì)，含四個(gè)Cys殘基，形成兩個(gè)二硫鍵。147編輯pptrhIFNα-2b生產(chǎn)工藝?yán)砘再|(zhì)147編輯ppt2.制備原理與制備工藝路線用基因工程方法構(gòu)建陽性質(zhì)粒pGAPZαA，通過大腸桿菌獲得大量載體，然后轉(zhuǎn)化酵母SMD1168，從而獲得陽性酵母菌落，通過高濃度的Zeocin（博來霉素）篩選獲得高表達(dá)工程菌，在pH4.0~5.0、300r/min、30℃培養(yǎng)至OD6006~8時(shí)，獲得最大量rhIFNα-2b，上清液依次通過陰離子和陽離子交換及凍干等步驟，獲得純品。148編輯ppt2.制備原理與制備工藝路線148編輯pptIFNα-2b的目的基因PichiapastorisSMD1168轉(zhuǎn)化大腸桿菌pGAPZαA質(zhì)粒IFNα-2b的目的基因雜交質(zhì)粒pGAPZαA線性pGAPZαA質(zhì)粒陽性質(zhì)粒pGAPZαA線性陽性質(zhì)粒pGAPZαA高表達(dá)工程菌上清液IFNα-2b的原液IFNα-2b成品[酶切]XhoⅠ、XbaⅠXhoⅠ、XbaⅠ[連接]T4連接酶[轉(zhuǎn)化][轉(zhuǎn)化][酶切]AvrⅡ[發(fā)酵、離心][凍干][篩選]Zeocin[篩選]Zeocin[色譜]CM-SepharoseF.F,DEAE-SepharoseF.F圖1重組干擾素α-2b的制備工藝149編輯pptIFNα-2b的目的基因PichiapastorisS質(zhì)粒pGAPZ