動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1.動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)及培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)化程度高結(jié)構(gòu)、形態(tài)、成分復(fù)雜細(xì)胞間連接形式多樣生長(zhǎng)相對(duì)緩慢功能全面21.動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)及培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)21.1培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征31.1培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特征3體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型（一）貼附型成纖維細(xì)胞型上皮型細(xì)胞游走細(xì)胞型多形型細(xì)胞（二）懸浮型（三）半貼壁型4體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型（一）貼附型4（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴(lài)性細(xì)胞貼附:是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長(zhǎng)發(fā)育的基本存在方式結(jié)果:基于貼附特性，使細(xì)胞及細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須貼附于一固相表面才能生存和生長(zhǎng)。培養(yǎng)時(shí)：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要貼附于某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)，因而屬于貼附型細(xì)胞貼附(錨定或錨著)依賴(lài)型(性)細(xì)胞：唯有貼附于固相表面才能生存的細(xì)胞5（一）貼附型：5細(xì)胞在體內(nèi)、外的貼附方式：存在差異體內(nèi)：貼附是全方位,外形具有復(fù)雜的立體特征體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面，外形一般及體內(nèi)時(shí)明顯不同貼附的固相表面：玻璃、聚苯乙烯塑料按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為幾大類(lèi)型6細(xì)胞在體內(nèi)、外的貼附方式：存在差異61、成纖維細(xì)胞型：71、成纖維細(xì)胞型：7名稱(chēng)：凡在培養(yǎng)中形態(tài)及成纖維細(xì)胞類(lèi)似的來(lái)源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞：心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2—3個(gè)長(zhǎng)短不等的突起，中有卵圓形核生長(zhǎng)特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀，并不緊靠連成片，細(xì)胞—細(xì)胞接觸易斷開(kāi)而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起8名稱(chēng)：凡在培養(yǎng)中形態(tài)及成纖維細(xì)胞類(lèi)似的82、上皮型細(xì)胞：92、上皮型細(xì)胞：9名稱(chēng)：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同來(lái)源：來(lái)源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞,如：皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性腫瘤形態(tài)：類(lèi)似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核生長(zhǎng)特點(diǎn)：易相連成片，相靠—緊密相連—成薄層—鋪石狀生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)10名稱(chēng)：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同103、游走細(xì)胞型：呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。4、多型細(xì)胞型：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類(lèi)。113、游走細(xì)胞型：11（二）懸浮型：見(jiàn)于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類(lèi)型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這類(lèi)細(xì)胞容易大量繁殖。概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)來(lái)源：自血，脾或骨髓，血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)：純化不方便，不能通過(guò)離心將死、活細(xì)胞分離12（二）懸浮型：121313無(wú)菌無(wú)毒害的環(huán)境1支持生長(zhǎng)增殖的營(yíng)養(yǎng)2其它類(lèi)似體內(nèi)的環(huán)境3維持細(xì)胞性狀41.2細(xì)胞培養(yǎng)總原則14無(wú)菌無(wú)毒害的環(huán)境1支持生長(zhǎng)增殖的營(yíng)養(yǎng)2其它類(lèi)似體內(nèi)的環(huán)境3維(一)細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌無(wú)毒環(huán)境實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合理常用設(shè)施及設(shè)備培養(yǎng)器皿：透明度好、無(wú)毒、利于細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。15(一)細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌無(wú)毒環(huán)境實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合理151616細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌操作基本技術(shù)工作環(huán)境及表面的處理細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理培養(yǎng)液及培養(yǎng)細(xì)胞的處理17細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌操作基本技術(shù)工作環(huán)境及表面的處理17(二)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：合適的細(xì)胞培養(yǎng)基是體外細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的最重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，而且還提供培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。血清：血清是細(xì)胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一，含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種生長(zhǎng)因子及其它營(yíng)養(yǎng)成分。其它成分（條件培養(yǎng)基）18(二)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：合適的細(xì)胞培養(yǎng)基是體外細(xì)胞生長(zhǎng)增殖合成培養(yǎng)基的主要成分氨基酸碳水化合物無(wú)機(jī)鹽維生素其它輔助物質(zhì)培養(yǎng)基種類(lèi)1640（標(biāo)準(zhǔn)型）高糖（標(biāo)準(zhǔn)型）低糖（標(biāo)準(zhǔn)型）5AM199F1219合成培養(yǎng)基的主要成分氨基酸培養(yǎng)基種類(lèi)1640（標(biāo)準(zhǔn)型）19血清牛血清、馬血清、人血清（1）儲(chǔ)存于-20℃—-70℃低溫冰箱中（2）一般廠商提供的血清為無(wú)菌（3）熱滅活是指56℃,30分鐘加熱已完全解凍的血清，目的是使血清中的補(bǔ)體成分（）滅活（4）血清中的沉淀物絮狀物，可用離心3000,5分鐘去除，也可不用處理。20血清牛血清、馬血清、人血清20其它常用液體試劑’s’s3（7.5%）胰酶溶液（0.25%）21其它常用液體試劑’s21(三)其它類(lèi)似體內(nèi)的環(huán)境溫度氣體滲透壓氫離子濃度()其他22(三)其它類(lèi)似體內(nèi)的環(huán)境溫度22(四)合理的計(jì)劃，維持細(xì)胞性狀

盡早凍存原代細(xì)胞，復(fù)蘇后狀態(tài)恢復(fù)的細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定存在的細(xì)胞需要做實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞要選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期防止細(xì)胞污染，如遇污染，及時(shí)處理23(四)合理的計(jì)劃，維持細(xì)胞性狀盡早凍存原代細(xì)胞，復(fù)蘇后狀態(tài)恢一、細(xì)菌污染細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴?。最常?jiàn)的有革蘭氏陽(yáng)性菌。培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無(wú)多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)觀察。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)丟失。24一、細(xì)菌污染24二、真菌污染

真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中最常見(jiàn)的一種，尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)更易污染。最常見(jiàn)的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。

培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后，可見(jiàn)培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(zhǎng)，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見(jiàn)絲狀、管狀或樹(shù)枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。個(gè)體細(xì)小，有增多趨勢(shì)。鏡下看時(shí)，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止及瓶外尤其瓶底外面生長(zhǎng)的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。25二、真菌污染

25三、支原體污染

支原體是介于細(xì)菌及病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過(guò)濾除菌無(wú)法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開(kāi)始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(7.6～8.0)下生存，對(duì)青霉素有抗藥性。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。電鏡下可見(jiàn)其有三層結(jié)構(gòu)，無(wú)細(xì)胞壁，中央有電子密度大的密集顆粒或絲狀的中心囊。

培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無(wú)明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。26三、支原體污染

26四、病毒污染采用組織細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒(méi)有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會(huì)產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。若二倍體細(xì)胞系有40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細(xì)胞含病毒，細(xì)胞會(huì)發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異倍體的細(xì)胞系。27四、病毒污染27五、非同種細(xì)胞污染

由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒(méi)有嚴(yán)格分開(kāi)，操作不當(dāng)，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。如“靈長(zhǎng)類(lèi)”細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類(lèi)細(xì)胞的混合物，細(xì)胞是從兔腎中分離出來(lái)的，而現(xiàn)在卻認(rèn)為是細(xì)胞。非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。28五、非同種細(xì)胞污染

28常用的排除微生物污染的方法抗生素排除法：采用5～10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24～48h，再換入常規(guī)培養(yǎng)物，有時(shí)可能奏效。加溫除菌：根據(jù)支原體不耐熱的特點(diǎn)，可將受支原體污染的細(xì)胞至于41攝氏度作用5～10h（最長(zhǎng)可達(dá)18h），以殺滅支原體。動(dòng)物體內(nèi)接種：受污染的腫瘤細(xì)胞可接種在同種動(dòng)物皮下或腹腔內(nèi)，利用動(dòng)物的免疫功能消滅污染的微生物，而腫瘤細(xì)胞卻能在動(dòng)物體內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)，待一定時(shí)間后從體內(nèi)取出腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)及巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)：巨噬細(xì)胞在體外可存活7～10天，并保持吞噬、消化微生物的能力。利用這一特點(diǎn)，可將少量的污染細(xì)胞及足夠量的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，從而消除污染。29常用的排除微生物污染的方法抗生素排除法：采用5～10倍于常1.3培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程幼齡動(dòng)物取動(dòng)物器官和組織剪碎組織胰蛋白酶處理細(xì)胞培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞301.3培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程幼齡動(dòng)物取動(dòng)物器官剪碎組織細(xì)胞懸液10代細(xì)胞50代細(xì)胞無(wú)限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)；多數(shù)組織細(xì)胞固定在表面生長(zhǎng)和分裂。隨細(xì)胞增多，細(xì)胞就會(huì)停止分裂增殖遺傳物質(zhì)改變遺傳物質(zhì)未改變31細(xì)胞10代細(xì)胞50代細(xì)胞無(wú)限傳代原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)如何界定原代原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。培養(yǎng)的第1代細(xì)胞及傳10代以?xún)?nèi)的細(xì)胞稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：將原代細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中取出，配制成細(xì)胞懸浮液，分裝到兩個(gè)或兩個(gè)以上的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，稱(chēng)為傳代培養(yǎng)。有關(guān)概念32原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞。培養(yǎng)的第1代細(xì)胞的原代培養(yǎng)將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用）或機(jī)械方法處理，分散成單細(xì)胞，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖，這一過(guò)程稱(chēng)原代培養(yǎng)。33細(xì)胞的原代培養(yǎng)將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出，經(jīng)33組織塊直接培養(yǎng)法（機(jī)械法）1、取材：將小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘（時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)、以免酒精從口和肛門(mén)浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，將鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)解剖取肝臟，置平皿中。2、用’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1-2），再用’s液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中4、將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附及瓶底面5、翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入37℃靜置3—5小時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37℃繼續(xù)培養(yǎng)34組織塊直接培養(yǎng)法（機(jī)械法）1、取材：將小鼠拉頸椎致死，置75胰酶消化法1、取材：將小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘（時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)、以免酒精從口和肛門(mén)浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，將鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)解剖取肝臟，置平皿中。2、用’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（12），再用’s液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。4、視組織塊量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次.5、加入2培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）,用吸管吹打，沖散細(xì)胞。6、靜置，使未分散的組織塊下沉。7、吸取上層細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到兩個(gè)培養(yǎng)皿中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)液，37℃下培養(yǎng)。35胰酶消化法1、取材：將小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。36（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期361．原代培養(yǎng)期：從體內(nèi)取出組織,接種培養(yǎng)到第一次傳代階段（初代培養(yǎng)）特點(diǎn)：1一4周、細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)、可見(jiàn)細(xì)胞分裂、形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上及體內(nèi)原組織相似性、多呈二倍體核型細(xì)胞群是異質(zhì)的，細(xì)胞克隆形成率很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。371．原代培養(yǎng)期：372．傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱(chēng)做細(xì)胞系。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱(chēng)二倍體細(xì)胞系。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。382．傳代期：383．衰退期：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)，由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性或惡性性。393．衰退期：39細(xì)胞永生性也稱(chēng)不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱(chēng)無(wú)限細(xì)胞系，也稱(chēng)連續(xù)細(xì)胞系。無(wú)限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。40細(xì)胞永生性也稱(chēng)不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖40（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期所謂細(xì)胞“一代”一詞，系指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說(shuō)法，它及細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它及細(xì)胞世代或倍增不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過(guò)以下三個(gè)階段：?潛伏期指數(shù)生長(zhǎng)期停滯期41（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期所謂細(xì)胞“一代”一詞，系指從1．潛伏期：421．潛伏期：42過(guò)程:游離:懸浮,胞質(zhì)回縮,全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形吸附:貼附底物,一般24小時(shí)內(nèi)貼壁潛伏期:可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng),基本無(wú)增殖,少見(jiàn)分裂相43過(guò)程:43影響因素：潛伏期的長(zhǎng)短及：細(xì)胞種類(lèi)接種的細(xì)胞密度培養(yǎng)條件44影響因素：441.細(xì)胞類(lèi)型傳代培養(yǎng)的細(xì)胞之潛伏期比原代培養(yǎng)的細(xì)胞短。傳代培養(yǎng)期的細(xì)胞6-24h;原代24-96h或更長(zhǎng)單個(gè)細(xì)胞快,細(xì)胞大團(tuán)慢,組織塊慢連續(xù)細(xì)胞系及發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(6-24h)比有限細(xì)胞系及正常二倍體細(xì)胞的短來(lái)源：胚胎組織:短,2天可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)，成體:長(zhǎng)451.細(xì)胞類(lèi)型452.細(xì)胞密度

密度越大、數(shù)量越多，細(xì)胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境，潛伏期就短。相反，即便是在很小的培養(yǎng)空間內(nèi)，如接種的細(xì)胞數(shù)量不夠大，潛伏期仍會(huì)較長(zhǎng)3.培養(yǎng)條件

培養(yǎng)液、底物、污染,有毒462.細(xì)胞密度

密度越大、數(shù)量越多，細(xì)胞群體越容易適應(yīng)體外環(huán)境2．指數(shù)增生期：這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛及否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂指數(shù)表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%。472．指數(shù)增生期：47特點(diǎn)：是細(xì)胞增生最活躍、活力最旺盛的階段培養(yǎng)物中細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)增長(zhǎng),細(xì)胞群體均一是理想的實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞接觸抑制密度抑制48特點(diǎn)：接觸抑制483．停滯期：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱(chēng)平臺(tái)期（）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡493．停滯期：49特點(diǎn)(1)細(xì)胞數(shù)量：

細(xì)胞達(dá)飽和密度，出現(xiàn)密度抑制。(2)細(xì)胞活動(dòng)小(3)生長(zhǎng)組分下降(4)及時(shí)傳代：細(xì)胞已中毒，即使傳代，也會(huì)影響下一代細(xì)胞的功能狀況50特點(diǎn)50潛伏期指數(shù)生長(zhǎng)期停滯期51潛伏期指數(shù)生長(zhǎng)期停滯期51細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。52細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測(cè)定培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能細(xì)胞計(jì)數(shù)原理53細(xì)胞計(jì)數(shù)原理53細(xì)胞計(jì)數(shù)操作步驟 1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。

2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。

3、靜置3分鐘。

4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：

細(xì)胞數(shù)＝4大格細(xì)胞總數(shù)/4×10000

注意：鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。54細(xì)胞計(jì)數(shù)操作步驟 1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦試干凈，并將蓋片請(qǐng)計(jì)算一下細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)需要效應(yīng)細(xì)胞及靶細(xì)胞的比例為20：1且靶細(xì)胞需要1x104?，F(xiàn)有效應(yīng)細(xì)胞10，取100效應(yīng)細(xì)胞加入900中，混勻后記數(shù)，細(xì)胞濃度為2x104。靶細(xì)胞也有10，經(jīng)記數(shù)，細(xì)胞濃度為1x105。效應(yīng)細(xì)胞共有多少？靶細(xì)胞共有多少？以現(xiàn)有的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)，能做幾個(gè)？55請(qǐng)計(jì)算一下細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)需要效應(yīng)細(xì)胞及靶細(xì)胞的比例為20：155細(xì)胞活力測(cè)定步驟 1、將細(xì)胞懸液以0.5加入試管中。

2、加入0.50.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2一3分鐘。

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力。

死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色，鏡下可見(jiàn)深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無(wú)色透明狀。

活力測(cè)定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來(lái)進(jìn)行，但要考慮到染液對(duì)原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。56細(xì)胞活力測(cè)定步驟 1、將細(xì)胞懸液以0.5加入試管中。

2、加哺乳動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存主要目的：（1）保存種子細(xì)胞，以便隨時(shí)取用。（2）降低人力和物力（3）減少細(xì)胞被微生物污染的危險(xiǎn)性。（4）避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)變（5）減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變57哺乳動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存主要目的：57冷凍保存要點(diǎn)（1）冷凍過(guò)程要緩慢，有條件的地方，可用程控降溫儀，按每分鐘-1到-3℃速度降溫，一直到-80℃以下，然后直接放入液氮中長(zhǎng)期保存（2）凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力大于90％，無(wú)微生物污染。（3）細(xì)胞濃度控制在：1×106－1×107。（4）使用高濃度血清（30%）（5）使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑（、甘油）細(xì)胞冷凍保存液主要成分：冷凍保護(hù)劑（5-10%，培養(yǎng)基（60%），血清（30%）。58冷凍保存要點(diǎn)（1）冷凍過(guò)程要緩慢，有條件的地方，可用程控降溫細(xì)胞凍存實(shí)用程序收集細(xì)胞凍存液重懸分裝入凍存管106-1074℃40-20℃30-60-30℃30-80℃過(guò)夜液氮罐保存并記錄59細(xì)胞凍存實(shí)用程序收集細(xì)胞59冷凍保存細(xì)胞的解凍及復(fù)蘇（1）快速解凍（2）解凍操作過(guò)程動(dòng)作要輕特別注意：解凍時(shí)務(wù)必注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂。要帶手套，用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出，放入37℃水浴中。切不可直接用手，以免凍傷冷凍管在水浴中解凍時(shí)，液面不可超過(guò)凍存管蓋面，否則，易發(fā)生污染60冷凍保存細(xì)胞的解凍及復(fù)蘇（1）快速解凍60解凍冷凍保存細(xì)胞的離心方法:從液氮中取出凍存的細(xì)胞，立即放入37℃水浴中快速解凍。將1－2凍存細(xì)胞液加入到25新鮮完全細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液中，輕輕混勻。用80g離心2－3分鐘（800-10005），棄上清液。用完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液輕輕懸浮細(xì)胞團(tuán)，并計(jì)數(shù)細(xì)胞。接種細(xì)胞到培養(yǎng)瓶中，起始密度不低于3×105。24-48h后換液。61解凍冷凍保存細(xì)胞的離心方法:從液氮中取出凍存的細(xì)胞，立即放入1.4體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類(lèi)細(xì)胞系細(xì)胞株二倍體細(xì)胞遺傳缺陷細(xì)胞腫瘤細(xì)胞621.4體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類(lèi)細(xì)胞系62（一）細(xì)胞系

初代培養(yǎng)物開(kāi)始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱(chēng)之為細(xì)胞系。如細(xì)胞系的生存期有限，則稱(chēng)之為有限細(xì)胞系已獲無(wú)限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱(chēng)連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系。63（一）細(xì)胞系

初代培養(yǎng)物開(kāi)始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱(chēng)之為（二）細(xì)胞株

從一個(gè)經(jīng)過(guò)生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱(chēng)細(xì)胞株。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出及原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱(chēng)之為亞株64（二）細(xì)胞株

從一個(gè)經(jīng)過(guò)生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或（三）二倍體細(xì)胞

細(xì)胞群染色體數(shù)目具有及原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細(xì)胞占75％或80％以上）的細(xì)胞群，稱(chēng)二倍體細(xì)胞。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。為保持二倍體細(xì)胞能長(zhǎng)期被利用，一般在初代或2～5代即大量?jī)龃孀鳛樵N。65（三）二倍體細(xì)胞

細(xì)胞群染色體數(shù)目具有及原供體二倍細(xì)胞染色體（四）遺傳缺陷細(xì)胞

從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細(xì)胞）培養(yǎng)的細(xì)胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細(xì)胞，都屬遺傳缺欠細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。66（四）遺傳缺陷細(xì)胞

從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細(xì)胞（五）腫瘤細(xì)胞系或株

這是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類(lèi)，我國(guó)已建細(xì)胞系主要為這類(lèi)細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類(lèi)上皮型細(xì)胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。67（五）腫瘤細(xì)胞系或株

這是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類(lèi)，我國(guó)已建細(xì)細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名：為供體患者的姓名（來(lái)源于宮頸癌）

：中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞（）宮-743：宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立

3T3：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（）建立；每3天傳代，每次接種3×105細(xì)胞／毫升。68細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名：為供體患者的姓名（來(lái)源于宮頸癌）

：細(xì)胞系或株的鑒定、管理和使用入庫(kù)細(xì)胞要求檢測(cè)項(xiàng)目如下：

培養(yǎng)簡(jiǎn)歷：組織來(lái)源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正?；虍惓＝】禒顟B(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等

凍存液：培養(yǎng)基和防凍液名稱(chēng)

細(xì)胞活力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長(zhǎng)特性

培養(yǎng)液：培養(yǎng)基種類(lèi)和名稱(chēng)（一般要求不含抗生素）、血清來(lái)源和含量69細(xì)胞系或株的鑒定、管理和使用入庫(kù)細(xì)胞要求檢測(cè)項(xiàng)目如下：69細(xì)胞形態(tài)：類(lèi)型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等，融解后細(xì)胞生長(zhǎng)特性

核型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無(wú)

無(wú)污染檢測(cè)：包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲(chóng)和病毒等

物種檢測(cè)：檢測(cè)同工酶，以證明細(xì)胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)

免疫檢測(cè)：一兩種血清學(xué)檢測(cè)

細(xì)胞建立者：建立者姓名；檢測(cè)者姓名70細(xì)胞形態(tài)：類(lèi)型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等，融解后細(xì)胞生長(zhǎng)特性

7171727273737474細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡:是能量依賴(lài)的細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而致的細(xì)胞自殺，由基因控制的細(xì)胞自主有序的主動(dòng)死亡過(guò)程。細(xì)胞程序性死亡（，）:指生理性細(xì)胞死亡。描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的，并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。75細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡:是能量依賴(lài)的細(xì)胞內(nèi)死亡程序活化而致的細(xì)胞自細(xì)胞凋亡及壞死的區(qū)別——————————————————壞死凋亡1.性質(zhì)病理性，非特異性,非遺傳性生理性或病理性，特異性遺傳性2.誘導(dǎo)因素強(qiáng)烈刺激（極端環(huán)境），隨機(jī)發(fā)生較弱刺激，非隨機(jī)發(fā)生3.生化特點(diǎn)被動(dòng)過(guò)程，無(wú)新蛋白合成，主動(dòng)過(guò)程，有新蛋白合成，不耗能耗能4.形態(tài)變化細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、胞膜及細(xì)胞器相對(duì)完整細(xì)胞腫脹細(xì)胞皺縮，核固縮5電泳彌散性降解，電泳呈均一片段化（180-200），片狀電泳呈“梯”狀條帶6.炎癥反應(yīng)溶酶體破裂，局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對(duì)完整，局部無(wú)炎癥反應(yīng)7.凋亡小體無(wú)有8.基因調(diào)控?zé)o有76細(xì)胞凋亡及壞死的區(qū)別——————————————————壞死7777常用細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)磷脂酰絲氨酸外翻分析（V法）線粒體膜勢(shì)能的檢測(cè)片斷化檢測(cè)法3活性的檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白19蛋白的表達(dá)和細(xì)胞定位分析78常用細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)78細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)79細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)79磷脂酰絲氨酸外翻分析（V法）磷脂酰絲氨酸（，）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中是一種分子量為35～36的2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能及高親和力特異性結(jié)合。碘化丙啶（，）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將及匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)80磷脂酰絲氨酸外翻分析（V法）磷脂酰絲氨酸（，）正常位于細(xì)胞

1811818282線粒體膜勢(shì)能的檢測(cè)線粒體在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而線粒體跨膜電位的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征（染色質(zhì)濃縮、斷裂）出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽(yáng)離子熒光染料可結(jié)合到線粒體基質(zhì)，其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。

83線粒體膜勢(shì)能的檢測(cè)線粒體在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著樞紐作用，多種片斷化檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮，染色質(zhì)在核小體單位之間的連接處斷裂，形成50～300長(zhǎng)的大片段，或180～200整數(shù)倍的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜（）。84片斷化檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)主要的生化84法細(xì)胞凋亡中，染色體雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3‘末端，