細(xì)胞因子檢測

關(guān)于細(xì)胞因子檢測細(xì)胞因子

一類由細(xì)胞分泌，具有多種功能的高活性小分子蛋白，參與免疫調(diào)節(jié)和多種生理病理過程等。

白細(xì)胞介素(interleukin,IL)干擾素(interferon,IFN)腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)集落刺激因子(colonystimulatingfactor,CSF)生長因子(growthfactor,GF)趨化因子(chemokine)第2頁,共27頁，2024年2月25日，星期天優(yōu)點(diǎn)：敏感、可靠；缺點(diǎn)：需長期飼養(yǎng)細(xì)胞、檢測耗時長、步驟繁雜。1不同的CK具有不同的生物學(xué)活性，選擇CK獨(dú)特的生物學(xué)活性，即可檢測。細(xì)胞增殖/抑制實(shí)驗(yàn)細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)。。。生物學(xué)檢測法細(xì)胞因子的檢測方法2利用抗體對抗原表位的識別，測定的是可溶性細(xì)胞因子的抗原性。ELISARIAFIAELISPOT。。。免疫學(xué)檢測法優(yōu)點(diǎn)：方便、迅速缺點(diǎn)：價格昂貴，結(jié)果僅代表CK的量而非活性，敏感性較低。3利用基因探針，檢測特定細(xì)胞因子基因表達(dá)，即mRNA水平。斑點(diǎn)雜交Northern印跡細(xì)胞和組織原位雜交RT-PCR。。。分子生物學(xué)檢測法局限性：僅能檢測基因表達(dá)情況，不能直接提供有關(guān)細(xì)胞因子的濃度和活性，只用于機(jī)制探討。第3頁,共27頁，2024年2月25日，星期天待檢樣品(細(xì)胞上清)指示細(xì)胞（CTLL-2）IL-2依賴細(xì)胞系按不同稀釋度加入37oC，16-20小時加入3HTdR（1-5

Ci）37oC，4-6小時收集細(xì)胞測定細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)第4頁,共27頁，2024年2月25日，星期天細(xì)胞病變抑制實(shí)驗(yàn)待檢樣品（細(xì)胞上清）IFN-

指示細(xì)胞（wish）按不同稀釋度加入37oC，4小時37oC，24-48小時棄取上清，加入VSV(水泡性口炎病毒)觀察細(xì)胞病變（鏡檢或比色）第5頁,共27頁，2024年2月25日，星期天UsingCFSEtotrackCMLprogenitorproliferationSDMSDM+Glivec第6頁,共27頁，2024年2月25日，星期天CalculationofProliferativeIndex(P.I.)CFSE--->43210TheProliferativeIndexisthesumofthecellsinallgenerationsdividedbythecalculatednumberoforiginalparentcells.Itisusefulforcomparingquantityofcelldivisionbetweenculturesofthesamecellsundergoingdifferenttreatments.第7頁,共27頁，2024年2月25日，星期天CellProliferationELISAKit,BrdU(colorimetric)第8頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Chromium-51(51Cr)releaseassays

第9頁,共27頁，2024年2月25日，星期天計(jì)數(shù)受趨化細(xì)胞趨化因子細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)示意圖微孔濾膜第10頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

用示蹤物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，使其與相應(yīng)的抗原或抗體反應(yīng)，使微量的、不可見的反應(yīng)成為可見的或可測定的。免疫標(biāo)記技術(shù)第11頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

高通量細(xì)胞因子檢測CBA(CytometricBeadArray)是一種微珠多用途檢測分析技術(shù)，它由一系列的微珠組合來捕獲并結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)液、EDTA血漿、血清樣本中被檢測物質(zhì)的量。其采用夾心法分析策略，與傳統(tǒng)的ELISA分析技術(shù)相比，此方法可以同時檢測多項(xiàng)指標(biāo)。用已知的標(biāo)準(zhǔn)品和對照標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以得出被測樣本的濃度。此分析方法不受樣本量的限制，而且可以得到一個樣本的多個數(shù)據(jù)。第12頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Cytokinenetwork第13頁,共27頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共27頁，2024年2月25日，星期天第15頁,共27頁，2024年2月25日，星期天CBA原理示意圖第16頁,共27頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共27頁，2024年2月25日，星期天LabInvest2003,83:1131–1146cytokinebeadarrays(CBA)第18頁,共27頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT(酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn))ELISPOT技術(shù)利用結(jié)合在固相載體上的抗細(xì)胞因子的特異性抗體，在分泌細(xì)胞周圍直接撲獲待檢細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)中每個斑點(diǎn)（spot）是激活的淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子區(qū)域，代表一個活性淋巴細(xì)胞。它可在單細(xì)胞水平檢測淋巴細(xì)胞對特異性抗原的反應(yīng)能力。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，是目前為止最靈敏的檢測技術(shù)?？蓹z測到百萬分之一陽性細(xì)胞率;單細(xì)胞水平、活細(xì)胞功能檢測;操作簡便，可進(jìn)行高通量篩選。第19頁,共27頁，2024年2月25日，星期天1.特異性單抗包被在培養(yǎng)板孔底部；2.封閉能結(jié)合單抗的其他部位；3.加入細(xì)胞及刺激物培養(yǎng)，陽性細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子被單抗捕獲；4.移出細(xì)胞，洗滌；5.加入生物素標(biāo)記的二抗；6.加入酶標(biāo)鏈霉親和素；7.加入顯色底物，在酶的催化分解下，產(chǎn)生不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑點(diǎn)；8.斑點(diǎn)計(jì)數(shù)（可人工計(jì)數(shù)，也可用自動讀板儀計(jì)數(shù)），數(shù)據(jù)處理，結(jié)果分析。ELISPOT第20頁,共27頁，2024年2月25日，星期天第21頁,共27頁，2024年2月25日，星期天應(yīng)用移植研究--allograftrejection疫苗開發(fā)--亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響Th0/Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)換分析自體免疫研究--免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究癌癥研究--腫瘤反應(yīng)T細(xì)胞作用過敏機(jī)制探討--IL-4誘導(dǎo)免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換，其它參與過敏機(jī)制之細(xì)胞因子的研究傳染疾病研究--Lymedisease,Chlamydiainfections,Helicobacterpyloriinfections,HIVinfections,multiplesclerosis,等第22頁,共27頁，2024年2月25日，星期天MediumPHAPeptide1Peptide21Peptide47GzBHIV-peptiderecallpatientBIFN-gHIV-peptidespecificrecallresponseshowsdissociatedproductionofIFN-gandGzBKleenT.etal,AIDS2003,18:383-392第23頁,共27頁，2024年2月25日，星期天ELISPOT和ELISA的區(qū)別ELISPOT法源自ELISA，又突破傳統(tǒng)ELISA法，是定量ELISA技術(shù)的延伸和新的發(fā)展，它們最大的不同:

1.ELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得出可溶性蛋白總量(整體水平);ELISPOT也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點(diǎn)，可直接在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)斑點(diǎn)或通過ELISPOT分析系統(tǒng)對斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，1個斑點(diǎn)代表1個細(xì)胞，從而計(jì)算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率（單細(xì)胞水平）；

2.ELISPOT比ELISA更敏感。ELISPOT技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域：自身免疫診斷和預(yù)后分析、器官移植后排斥反應(yīng)的預(yù)測、過敏性疾病脫敏治療的監(jiān)測、疫苗和藥品的研發(fā)與檢測等。第24頁,共27頁，2024年2月25日，星期天胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測LPS活化單核細(xì)胞內(nèi)TNF-α的測定

R1：淋巴細(xì)胞；R2：單核細(xì)胞第25頁,共27頁，2024年2月25日，星期天TNF-

的誘生和檢測主要由單核/巨噬細(xì)胞及其他多種細(xì)胞產(chǎn)生，能使殺傷腫瘤細(xì)胞;THP-1(人單核細(xì)胞系)在LPS(脂多糖)刺