蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)

關(guān)于蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)

DE（directedevolutionofprotein）始于上世紀70年代，最早的一個例子是進化一個來源于大腸桿菌的EbgA蛋白，這個酶幾乎不具備β-半乳糖苷酶的活性。通過以乳糖為單一碳源的平板上篩選Lac-缺失的大腸菌株，野生型的EbgA就進化成為了具有β-半乳糖苷酶活性的酶。第2頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)★定義（definition）★原理（theory）★隨機突變的策略（markedfeatures）★定向進化的選擇的策略（methods）★應(yīng)用及展望（applicationandprospects）

第3頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)定義定向進化技術(shù)是一種在生物體體外(試管中)模擬達爾文進化，利用自然選擇的動力進化出在自然界并不存在的或是具有更優(yōu)性質(zhì)的蛋白。第4頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)

生物在漫長的時間里經(jīng)過自發(fā)突變（突變與重組），通過自然選擇，逐漸形成了多樣性的生物。自然選擇自發(fā)、不定向、自然選擇、慢分子定向進化

基因在短時間內(nèi)通過人為引發(fā)突變，經(jīng)過人工篩選，形成滿足人們需要的新功能或者優(yōu)良性能生物物質(zhì)（酶蛋白）人為、定向、人工選擇、快第5頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)原理

DE的原理是對目的基因進行突變、重組、表達和篩選,在試管內(nèi)模擬蛋白質(zhì)的自然進化過程,獲取人們需要的、具有特定性質(zhì)和功能的蛋白質(zhì)。定向進化=隨機突變+選擇第6頁,共26頁，2024年2月25日，星期天

隨機突變的策略■易錯PCR■

DNA改組和外顯子改組■雜合蛋白質(zhì)■體外隨機引發(fā)重組■交錯延伸第7頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)●易錯PCR

易錯PCR是指通過改變PCR的反應(yīng)條件，如：調(diào)整反應(yīng)體系中4種dNTP的濃度、增加Mg2+

的濃度等，使堿基在一定程度上隨機錯配而引入多點突變，構(gòu)建突變庫，刷出所需的突變體。易錯PCR的關(guān)鍵是控制DNA的突變頻率。第8頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)●DNA改組

DNA改組又稱有性PCR，目的是創(chuàng)造將親本基因群中的突變盡可能組合的機會，導致更大的變異，最終獲得最佳突變組合的蛋白質(zhì)。第9頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)●雜合蛋白質(zhì)

把不同蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)單元或整個蛋白質(zhì)分子進行組合或交換，以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的優(yōu)化蛋白質(zhì)雜合體。第10頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)●體外隨機引發(fā)重組

以單鏈DNA為模板，配合一套隨機序列引物，先產(chǎn)生大量互補于模板不同位點的短DNA片段，由于堿基的錯配和錯誤引發(fā)，這些短DNA片段中也會有少量的點突變，在隨后的PCR反應(yīng)中，它們互為引物進行合成，伴隨組合，再組裝成完整的基因長度。第11頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)●交錯延伸

一種簡化的DNA重組方法，它不是由短片段組裝全長基因，而是在PCR反應(yīng)中，將含不同點突變的模板混合，隨之進行多輪變性、短暫復性及延伸反應(yīng)，在每一輪中，那些部分延伸的片段可以隨機地雜交到含不同突變的模板上繼續(xù)延伸，由于模板轉(zhuǎn)換而實現(xiàn)不同模板間的重組，如此重復直至獲得全長基因片段。第12頁,共26頁，2024年2月25日，星期天定向進化的選擇策略Venekei等人報道了有效快速篩選蛋白水解酶突變體的方法和篩選條件，主要是利用蛋白酶選擇平板初選，再配合活性染色和X-光片消滅分析加以驗證，并檢測其活力快速篩選了44000個突變株。Roberts等人用嗜菌體表面呈現(xiàn)技術(shù)篩選與嗜中性酯酶結(jié)合力更強的抑制劑。從含有4900個突變體的基因庫中，獲得與該酶的結(jié)合能力高于野生蛋白質(zhì)3600000倍的突變體，比已報道的任何一個相應(yīng)的抑制劑高50倍。第13頁,共26頁，2024年2月25日，星期天定向進化的展望不僅能使蛋白質(zhì)進化出非天然特性，還能定向進化某一代謝途徑；不僅能進化出具有單一優(yōu)良特性的蛋白質(zhì)，還可能是已分別優(yōu)化的蛋白質(zhì)的兩個或多個特性疊加，產(chǎn)生具有多項優(yōu)化功能的蛋白質(zhì)，進而發(fā)展和豐富蛋白質(zhì)資源；完全在試管中進行的蛋白質(zhì)的體外定向進化使在自然界需要幾百萬年的進化過程縮短至幾年。第14頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化的應(yīng)用及展望●提高酶的催化活性●提高酶的穩(wěn)定性●改變酶的底物特異性●改變對映異構(gòu)體特異性第15頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)◆提高酶的催化活性

Shim等采用定點突變技術(shù)構(gòu)建的突變體，改變了位于酶活性中心“蛋白-s-結(jié)合”口袋中Met-317，并突變?yōu)锳la，從而有利于底物范圍的擴大；

Potocki—Veronese等利用易錯PCR和DNA重組技術(shù)對其進行突變，得到催化蔗糖活性提高60％的突變體Asn387Asp，從而擴大其應(yīng)用范圍，在實際生產(chǎn)中具有重要意義。第16頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)第17頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)◆提高酶的穩(wěn)定性

Xiao等運用序列比對的結(jié)果為指導，進行定點突變，得到突變體的Tm值提高了6℃，同時在不影響原有催化活性的基礎(chǔ)上，在45℃時的半衰期比原酶提高了23倍之多。

Miyazaki等為了適應(yīng)生產(chǎn)化需要，綜合了隨機突變、定點飽和突變和DNA重組的方法，將11家族木聚糖酶進行改造以提高其熱穩(wěn)定性。最終得到的突變體的半熱變性溫度從58℃提高到68℃，最適溫度也從55℃升到了65℃，同時在60℃的熱穩(wěn)定性也明顯增強。第18頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)◆改變酶的底物特異性

Manu等通過對纖維二糖磷酸化酶(CP)進行易錯PCR篩選，得到的突變株作用底物從傳統(tǒng)的纖維二糖轉(zhuǎn)變成了乳糖，隨即提高了乳糖磷酸化酶的活性。最終得到的突變體菌株的乳糖磷酸化酶的活性比原酶高出了10倍。

第19頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)

◆改變對映異構(gòu)體特異性

（1）Schmidt等選用易錯PCR技術(shù)將來源于Pseudomonasfluoresce~酯酶的對應(yīng)選擇性野生型的E值從63提高至96，同時活性也相應(yīng)的增加了，能夠達到2min轉(zhuǎn)化50％的底物，相當于1．25U／mg的蛋白量。第20頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)（2）1998年，Arnold等運用易錯PCR和飽和誘變的方法，成功地使一株傾向于D-型底物的乙內(nèi)酰脲酶發(fā)生轉(zhuǎn)變，使之變?yōu)閮A向于L-型底物，經(jīng)過分析這種轉(zhuǎn)變只生發(fā)了一個氨基酸的替換。與野生型的催化蛋白相比，增加了L-甲硫氨酸的產(chǎn)量，降低了不必要的產(chǎn)物積累。第21頁,共26頁，2024年2月25日，星期天實際用途在新藥和疫苗開發(fā)中的應(yīng)用在改進單鏈抗體親和力方面的應(yīng)用在酶制劑改造中的應(yīng)用構(gòu)建大型文庫和獲取分子的有力工具在化學品生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用第22頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)第23頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)

Luginbuhl等用易錯PCR和DNA改組的方法,進行了幾個回合的DE和用核糖體展示抗體庫技術(shù)進行篩選后發(fā)現(xiàn),得到的抗體與朊病毒肽鏈非結(jié)構(gòu)化區(qū)域的親和力增加.第24頁,共26頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)定向進化技術(shù)

Kikuchi等借助DNA改組方法提高了根癌農(nóng)桿菌N-氮基甲酰．D-氨基酸酰胺水解酶的氧穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，使N-氨基甲酰-D-氨基酸酰胺水解這一生物轉(zhuǎn)化過程更易應(yīng)用于工業(yè)環(huán)