腫瘤基因治療的基本策略和常用方法

關于腫瘤基因治療的基本策略和常用方法一.腫瘤和基因治療的基本概念1.腫瘤（Tumor）

機體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個細胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控，導致其克隆性異常增生而形成的異常病變。學界一般將腫瘤分為良性和惡性兩大類。第2頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第3頁,共31頁，2024年2月25日，星期天2.基因治療指將外源正?；?qū)氚屑毎约m正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療目的。也就是將外源基因通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入病人的適當?shù)氖荏w細胞中，使外源基因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病。從廣義說，基因治療還可包括從DNA水平采取的治療某些疾病的措施和新技術(shù)。第4頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第5頁,共31頁，2024年2月25日，星期天3.什么是腫瘤基因治療基因治療的經(jīng)典概念指通過外源基因?qū)巳梭w以糾正內(nèi)在的基因缺陷的療法。腫瘤基因治療不再局限于“糾正基因缺陷”，系指將外源的正?；?qū)巳梭w，達到直接或間接抑制或殺傷腫瘤細胞的目的?；蚴巧?，是生物得以保持其連續(xù)性和穩(wěn)定性的物質(zhì)基礎。隨著對惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機制研究的不斷深人，出于對腫瘤是一種基因病的認識，加之惡性腫瘤的發(fā)病率和病死率較高，這使得惡性腫瘤的基因治療成為近年來基因治療研究的主要內(nèi)容和熱點。第6頁,共31頁，2024年2月25日，星期天4.與基因治療有關幾個概念

a.基因毒癌發(fā)生發(fā)展的第一步是活化致癌物，改變細胞內(nèi)的DNA，導致原癌基因的移位及擴增，這些特殊基因的翻譯，使帶有這些異?；蚣毎哪承┨匦缘靡詫Ｒ槐磉_，一個特殊的化學物對一系列細胞有誘變及DNA修復作用者，稱為基因毒。目前人類已知的致癌物均為基因毒。

b.原癌基因(前癌基因)細胞癌基因存在于細胞基因組內(nèi)，激活前的細胞癌基因稱為原癌基因(前癌基因)，一旦原癌基因激活成癌基因便會引起細胞癌變，癌基因激活后，通過其表達產(chǎn)物改變細胞生長和分化規(guī)律，誘發(fā)細胞癌變。細胞癌基因被激活的途徑很多，如啟動子插人，基因重排和擴增，基因點突變和DNA分子中去甲基化等。第7頁,共31頁，2024年2月25日，星期天c.抑癌基因正常細胞中存在抑制腫瘤發(fā)生的基因，稱為抑癌基因。抑癌基因的存在從最初的一個發(fā)現(xiàn)中得到證實，即一個腫瘤細胞和一個正常細胞融合成的雜交細胞，往往不具有細胞表型，即使兩種不同的腫瘤細胞雜交，也可能是非腫瘤性的，只有正常的親代失去某些基因之后，其子代才會發(fā)生腫瘤。后來，通過限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)分析及分子克隆技術(shù)的研究證實，正常細胞中有一類對細胞增殖起負性調(diào)節(jié)作用的基因，如大腸癌中的p53基因，視網(wǎng)膜母細胞瘤和骨肉瘤中的Rb基因。這兩種基因也是目前被確認并研究最為深人的抑癌基因。如將正常的Rb基因轉(zhuǎn)人骨肉瘤細胞，Rb基因表達增高，細胞分裂幾乎完全抑制，將Rb基因轉(zhuǎn)人前列腺細胞，對正常細胞的生長無影響，但抑制了細胞的癌變，所以當這一類的抑癌基因發(fā)生丟失，失活或變異時，就會促進細胞惡變。第8頁,共31頁，2024年2月25日，星期天二.采用基因治療腫瘤的基本策略

目前國內(nèi)外惡性腫瘤基因治療基本策略包括：1.免疫性基因治療

2.病因性基因治療

3.溶瘤腺病毒基因治療

4.自殺基因治療等第9頁,共31頁，2024年2月25日，星期天1.免疫性基因治療

a.免疫性基因治療的對象

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在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，免疫系統(tǒng)發(fā)育未完善（3-4歲）和免疫機能衰退（老年人的細胞免疫和體液免疫功能均衰退）而出現(xiàn)兩個腫瘤發(fā)生的年齡高峰期。胸腺發(fā)育不良（Digeoge’s）綜合癥或咽囊綜合癥是因胸腺發(fā)育不良而導致細胞免疫系統(tǒng)停留在未分化階段，這類患兒兼有細胞免疫缺陷和體液免疫缺陷的共濟失調(diào)，惡性腫瘤的發(fā)生率高達10%。由此說明細胞免疫和體液免疫功能的正常或活性增強在抗惡性腫瘤的發(fā)生中是不可缺少的。第10頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

選擇性IgA缺乏：患者血漿中IgA極低，而IgG、IgM與細胞免疫正常，組織中缺乏分泌IgA的漿細胞，約10%發(fā)生胃癌。當IgM缺乏時，約有8%患者發(fā)生惡性腫瘤以及淋巴網(wǎng)狀惡性疾病。研究發(fā)現(xiàn)當患者免疫球蛋白很低，抗體產(chǎn)生受到嚴重影響時，臨床上病人除了反復發(fā)生化膿性感染外，其患者發(fā)生惡性腫瘤率為8-10%，常見類型為淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)腫瘤（56%）和胃腸道上皮癌（26%）。Wiskott-Aldrich綜合癥：（嚴重混合型免疫缺陷綜合癥）以血小板減少出血，反復感染為臨床特征，早期細胞免疫完善，隨之淋巴細胞減少，體外淋轉(zhuǎn)反應缺乏，病兒很少活過青春期，約8-10%發(fā)生淋巴網(wǎng)狀系統(tǒng)腫瘤。第11頁,共31頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

1.2免疫性基因治療的方法

研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中存在著機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的免疫耐受狀態(tài)，而這種狀態(tài)可能源于腫瘤細胞本身的免疫性不強（如MHC表達不足），也可源于抗原遞全細胞（APC）不能提供足夠的共刺激信號（如B7）或者機體免疫因子分泌不足，在免疫性基因治療中通過以下三種方法糾正機體免疫的耐受狀態(tài)。第13頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

a.將某些細胞因子（如IL-2、TNF-a等）的基因轉(zhuǎn)染到機體免疫細胞（如TIL、LAK細胞及細胞毒淋巴細胞）中，大幅度提高機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的識別和反應能力。使用細胞因子的基因治療在一定程度上克服了細胞因子注射療法需反復多次應用，副作用嚴重等缺點，療效有較大幅度提高?？梢赃@樣認為：腫瘤免疫細胞因子基因治療的開展，為惡性腫瘤患者帶來生的希望，其療效的穩(wěn)定，治療的簡單、安全，已成為腫瘤免疫基因治療研究的最常用方法而獨樹一幟，前景是令業(yè)內(nèi)人士振奮的。第14頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

b.腫瘤細胞存在功能性MHCI類抗原和共刺激信號表達不足，將一些與免疫識別有關的基因（如HLA、B7等）轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的腫瘤細胞，經(jīng)照射后再植入腫瘤患者體內(nèi);或者表達HLA-B7的病毒載體或質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)復合物直接注射到瘤體內(nèi)，以大幅度增強腫瘤細胞對機體免疫系統(tǒng)的免疫原性，誘導宿主的免疫反應而提高宿主的免疫監(jiān)視功能和對腫瘤細胞的攻擊能力，達到治愈率的提高具有積極作用。第15頁,共31頁，2024年2月25日，星期天c.制備腫瘤KNA疫苗采用編碼特異抗原的基因直接注入人體，通過其在機體內(nèi)的表達從而激發(fā)機體對編碼抗原的免疫反應。應用癌胚抗原（CEA）制備的DNA疫苗在實驗中顯示出一定效果，研究的前景可觀，進入臨床藥理實驗只是時間問題而毋庸置疑。第16頁,共31頁，2024年2月25日，星期天2惡性腫瘤的病因性基因治療

腫瘤病因性基因治療主要針對癌基因和抑癌基因，其治療策略是抑制、阻斷癌基因的表達或替代，恢復抑癌基因的功能。從而達到治療腫瘤的目的。第17頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

a.針對癌基因治療

采用反義寡核苷酸、核酸、三鏈結(jié)構(gòu)寡核苷酸（Triplex-forming

oligonucleotides，TFO）抑制腫瘤細胞的基因轉(zhuǎn)錄，抑制癌基因的表達將有可能使腫瘤的基因表達調(diào)控回復到正常并使細胞重新分化或者誘發(fā)其凋亡（Apoptosis）。由于轉(zhuǎn)條是遺傳信息放大的過程，因此對癌基因的表達抑制來說更為有效，其治療前景是極為樂觀的。第18頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

b.針對抑癌基因治療

替代或恢復由于缺失或突變而丟失的抑癌基因（Tumorsuppressorgene）的正常功能是腫瘤病因性治療的手段而被世人所公認。利用抑癌基因治療腫瘤，在體外的實驗和實驗治療學中取得較好的療效；但在體內(nèi)由于腫瘤體積較大；內(nèi)環(huán)境又十分復雜，基因轉(zhuǎn)移率限制等因素的干擾，抑癌基因治療的確切療效不盡人意值得進一步研究。第19頁,共31頁，2024年2月25日，星期天3溶瘤腺病毒基因治療

a.溶瘤腺病毒的特點：①具有復制性，因此所需病毒顆粒較小；②能擴展至鄰邁腫瘤細胞，作用范圍廣泛；③溶瘤腺病毒可產(chǎn)生溶瘤和抗腫瘤免疫反應；④溶瘤腺病毒由于能夠復制故存在著不安全因素（轉(zhuǎn)移、擴散、活化）對腫瘤患者造成損害而失去可控性應引起注意和警惕。第20頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

b.溶瘤腺病毒的主要分類：①利用腫瘤特異表達的調(diào)控序例的表達：黑色素瘤表達酪氨酸酶，肝細胞癌表達甲胎蛋白（AFP），結(jié)直腸癌表達癌胚抗原（CEF）從而控制病毒復制。②利用腫瘤細胞生物學特性，如腺病毒復制時抵抗宿主細胞凋亡可能相關的EIB55K蛋白發(fā)生變異或缺失時，病毒復制的宿主細胞就會發(fā)生凋亡，從而使復制不能完成。代表為E1B55K剔除的d11520（onyx-015）腺病毒，它能夠在抑癌基因P53缺陷的腫瘤細胞中復制，從而達到裂鮮腫瘤細胞，同時又不損傷正常細胞的目的其特異的選擇性十分明顯。值得期待的是D11520和TH101病毒已進入III期臨床試驗。這時于癌癥的預防的作用將產(chǎn)生深遠的影響。第21頁,共31頁，2024年2月25日，星期天4自殺基因治療一些來自病毒或細菌的基因具有一些特殊的功能，其表達產(chǎn)物可將原先對哺乳動物細胞無毒的或毒性極低的前藥（Prodrug）轉(zhuǎn)換成毒性產(chǎn)物，導致這些細胞的凋亡。這類基因即稱為“自殺基因”（Suicidegene）由于自殺基因表達的產(chǎn)物多是能夠?qū)⑶八幋x為毒性產(chǎn)物的酶，故又稱為“前藥轉(zhuǎn)換酶基因”或“藥物敏感基因”。根據(jù)細胞自殺機制，將自殺基因作為治療性目的基因應用于腫瘤治療的研究稱為腫瘤的自殺基因方式。在臨床實踐中設計腫瘤細胞特異性自殺機制的基因治療方案對腫瘤治療具有重大的實際應用價值。第22頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

a.自殺基因療法中酶和前藥

第23頁,共31頁，2024年2月25日，星期天

b.自殺基因的特異性控制

要高效及特異性表達腫瘤自殺基因?qū)δ[瘤細胞的作用，自殺基因必須局現(xiàn)于腫瘤細胞以選擇性殺傷腫瘤細胞。一是利用免疫脂質(zhì)體，受體介導法進行定向基因轉(zhuǎn)移或直接瘤內(nèi)注射。二是利用腫瘤細胞生物學特性，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒介導HSV-TK基因（I型單純皰疹病毒胸腺激酶）選擇性治療腦腫瘤。三是利用腫瘤特異表達的調(diào)控序例，如酪氨酸酶、甲胳蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA），在自殺基因的上游安插特異的轉(zhuǎn)條調(diào)節(jié)序例，可以實現(xiàn)自殺基因的特異表達，從而克服傳統(tǒng)化學治療藥物作選擇性問題和較為嚴重的細胞毒問題，使腫瘤治療有較大幅度的進展。第24頁,共31頁，2024年2月25日，星期天c.旁觀者效應（Bystandereffect）

用外源性自殺基因轉(zhuǎn)染腫瘤細胞后，未能轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞可因鄰近的少數(shù)腫瘤細胞攜帶有自殺基因而被前體藥物殺傷。研究發(fā)現(xiàn)，旁觀者效應產(chǎn)生與自殺基因的種類、腫瘤細胞的類型及數(shù)量有關。TK/GCV系統(tǒng)的旁觀者效應是比較明顯和突出的。

第25頁,共31頁，2024年2月25日，星期天三.常采用的基因治療方法a.基因修飾腫瘤細胞“疫苗”療法

將某些細胞因子基因如IL-2、IL-4、TNF-α、INF-γ、GM-CSF等轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，可使腫瘤細胞表達活性細胞因子。轉(zhuǎn)染細胞因子基因的腫瘤細胞基體內(nèi)致瘤性喪失，耐動物預接腫這種轉(zhuǎn)基因腫瘤細胞后，該動物對再接種的同種腫瘤有抵抗作用。能分泌細胞因子的轉(zhuǎn)基因腫瘤細胞具有腫瘤疫苗作用，成為新型的腫瘤“疫苗”。這種腫瘤疫苗的作用機制是由于細胞因子表達后，一方面促進腫瘤表達特異抗原并誘發(fā)宿主抗腫瘤細胞毒性淋巴細胞(CTL)反應;另一方面分泌的細胞因子增強CTL和其他抗癌效應細胞的作用。第26頁,共31頁，2024年2月25日，星期天b.基因修飾TIL的過繼免疫療法將細胞因子導入TIL細胞中，活化后的TIL具有顯著抗自身腫瘤的作用，回輸體仙后有聚集于腫瘤部位的傾向，攜帶的抗癌免疫增強性細胞因子基因在腫瘤局部表達量增加，同時還避免全身大劑量投用IL-2、TNF-α等細胞因子所引起的嚴重毒副反應。目前已將TNF-α基因?qū)隩IL，并在癌癥患者中進行臨床試驗。第27頁,共31頁，2024年2月25日，星期天c.免疫增強基因療法

是將MHC1類抗原基因經(jīng)體內(nèi)導入腫瘤細胞內(nèi)，增加其免疫原性，有效地激活機體抗癌免疫反應，降低腫瘤細胞的致瘤性。

d.原位修飾腫瘤免疫原