核酸降解和核苷酸代謝

關(guān)于核酸降解和核苷酸代謝核酸水解糖苷鍵、磷酸酯鍵均可酸水解最不穩(wěn)定為嘌啉與脫氧核糖間的糖苷鍵酸水解RNA的磷酸酯鍵易堿解，DNA耐受堿濃度0.3-1M,37℃18－24h完成堿水解第2頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天外源核酸在小腸發(fā)生有限的消化吸收核酸在核酸酶的作用下，水解為寡核苷酸或單核苷酸單核苷酸可進(jìn)一步降解為堿基、戊糖和磷酸。核酸酶解第3頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天根據(jù)核酸酶作用的位置不同，又可將核酸酶分為核酸外切酶（exonuclease）和核酸內(nèi)切酶（endonuclease）。有些核酸酶能從DNA或RNA鏈的一端逐個(gè)水解下單核苷酸，所以稱為核酸外切酶。核酸內(nèi)切酶催化水解多核苷酸內(nèi)部的磷酸二酯鍵。核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶第4頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天限制性內(nèi)切酶20世紀(jì)70年代，在細(xì)菌中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一類核酸內(nèi)切酶，能識(shí)別雙鏈DNA分子中特定核苷酸序列，并在識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割雙鏈DNA的核酸內(nèi)切酶。稱為限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）第5頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)1953年，Arber研究噬菌體與細(xì)菌的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)限制現(xiàn)象。1962年，Arber發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對(duì)外來(lái)侵入的DNA有限制作用。預(yù)言了DNA限制性內(nèi)切酶的存在。1968年，H·O·Smith分離出第一個(gè)內(nèi)切酶。1971年，D·Nathans應(yīng)用內(nèi)切酶切割SV-40病毒的DNA，獲得了第一個(gè)DNA的內(nèi)切圖譜限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)了基因工程時(shí)代三人共享了1978年的諾貝爾獎(jiǎng)第6頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天限制與修飾現(xiàn)象限制酶天然存在于細(xì)菌體內(nèi)，與相伴存在的甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制-修飾系統(tǒng)。修飾和限制現(xiàn)象是50年代初發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)菌自衛(wèi)的方式。細(xì)菌內(nèi)兩種不同功能的酶：限制性內(nèi)切酶；甲基化酶。甲基化酶能識(shí)別限制性內(nèi)切酶所識(shí)別的堿基順序，并把其中某些堿基甲基化。被修飾酶甲基化了的DNA就不能被限制性內(nèi)切酶降解第7頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天三類限制與修飾酶類型Ⅰ：多亞基雙功能酶，甲基化和切割由同一酶完成。識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)不一致，沒(méi)有固定切割位點(diǎn)類型Ⅱ：修飾和限制由兩個(gè)分開(kāi)的酶完成。能識(shí)別雙鏈DNA的特殊序列，并可特異切割DNA類型Ⅲ：雙亞基雙功能酶，切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)下游24-26bp處。第8頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天限制性內(nèi)切酶的命名HindⅢ前三個(gè)字母來(lái)自于菌種名稱H.influenzae，“ｄ”表示菌系為ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分離到的第三個(gè)限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—Haemophilus

influensaedⅢSacI(II)—Streptomyces

achromagenesI(Ⅱ)

限制酶由三部分構(gòu)成，即菌種名（斜寫）、菌系編號(hào)、分離順序。第9頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)識(shí)別長(zhǎng)度為4-8個(gè)核苷酸的特異序列；許多識(shí)別序列具回文結(jié)構(gòu)，如HindⅢ的識(shí)別序列：

5`AAGCTT3`3`TTCGAA5切割產(chǎn)生的末端有粘端

(cohesive/stickyend)如BamHI(G↓GATCC)和平端

(bluntend)如SmaI(CCC↓GGG)第10頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天同裂酶與同尾酶來(lái)源不同但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)的酶稱為同功異源酶(isoschizomer),有時(shí)也稱同裂酶；有些限制酶識(shí)別序列不同，但是產(chǎn)生相同的粘性末端，這些酶稱為同尾酶（isocaudamer)第11頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天基因工程常用工具酶酶主要用途限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA特定序列，切割DNA分子DNA連接酶連接兩個(gè)DNA分子或片段大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ或Klenow酶制作DNA探針；合成cDNA第二鏈；填補(bǔ)雙鏈DNA3`凹端；DNA測(cè)序。TaqDNA聚合酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸5`-OH磷酸化，制末端標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶使3`-末端加同聚物尾S1核酸酶降解單鏈DNA或RNADNA酶Ⅰ在雙鏈DNA上產(chǎn)生隨機(jī)切口RNA酶A降解RNA逆轉(zhuǎn)錄酶補(bǔ)平反應(yīng)，合成cDNA或制探針堿性磷酸酶切除核酸末端磷酸基第12頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天核苷酸的進(jìn)一步水解核苷酸H2OPi5-Pi-戊糖+堿基核苷+Pi僅在E.Coli和棕色固氮菌中發(fā)現(xiàn)H2O堿基＋1-Pi-戊糖H2O堿基＋戊糖僅對(duì)植物和微生物的核糖核苷酸

第13頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天核苷酸分解代謝核苷酸水解，產(chǎn)生磷酸和核苷。核苷可在核苷酶的作用下進(jìn)一步分解為戊糖和堿基。不同種類生物降解嘌呤堿基的能力不同，代謝產(chǎn)物的形式也各不相同。人類、靈長(zhǎng)類、鳥(niǎo)類、爬蟲(chóng)類以及大多數(shù)昆蟲(chóng)體內(nèi)缺乏尿酸酶，故嘌呤代謝的最終產(chǎn)物是尿酸。嘧啶的降解：嘧啶堿的分解過(guò)程比較復(fù)雜，包括水解脫氨基作用、氨化、還原、水解和脫羧基作用等。第14頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天嘌呤核苷酸分解第15頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天人體嘌呤分解代謝的特點(diǎn)氧化降解，環(huán)不打破;最終產(chǎn)物:尿酸;嘌呤代謝障礙:痛風(fēng)癥第16頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天嘌呤代謝的終產(chǎn)物尿酸靈長(zhǎng)類，鳥(niǎo)類、爬蟲(chóng)類、昆蟲(chóng)等尿囊素哺乳動(dòng)物（靈長(zhǎng)類除外）尿囊酸硬骨魚(yú)尿素大多數(shù)魚(yú)類、兩棲類氨甲殼類、咸水瓣鰓類第17頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天嘧啶分解代謝特點(diǎn)還原降解，環(huán)被打破第18頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天生物體內(nèi)的核苷酸，可以直接利用細(xì)胞中自由存在的堿基和核苷合成（補(bǔ)救途徑），也可以利用氨基酸和某些小分子物質(zhì)為原料，經(jīng)一系列酶促反應(yīng)從頭合成核苷酸（從頭合成途徑）。核苷酸的生物合成第19頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天嘌呤核苷酸的生物合成第20頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天嘧啶堿合成的元素來(lái)源

第21頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天合成嘧啶的原料主要是CO2、NH3和天冬氨酸。生物體先利用小分子化合物形成嘧啶環(huán)，形成乳清酸，然后再與核糖磷酸結(jié)合形成嘧啶核苷酸。首先形成的是尿苷酸，然后再轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌奏ず塑账?。嘧啶核苷酸“從頭合成”途徑第22頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天

先合成嘧啶環(huán)，再與PRPP連接；先合成UMP，再轉(zhuǎn)變成其他嘧啶核苷酸。嘧啶核苷酸合成特點(diǎn)第23頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天

氨甲酰磷酸合成第24頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天

氨基甲酰磷酸合成酶I、II的區(qū)別CPSⅠCPSⅡ分布

線粒體（肝臟)

胞液(所有細(xì)胞)

氮源

NH3

Gln

別構(gòu)激活劑

N-乙酰谷氨酸

無(wú)

反饋抑制劑

無(wú)

UMP(哺乳類動(dòng)物)

功能

尿素合成

嘧啶合成

第25頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天

第26頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天嘧啶核苷酸的補(bǔ)救合成

第27頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月25日，星期天脫氧核糖核苷酸是由相應(yīng)的核糖核苷酸還原形成的。在核糖核苷酸還原酶作用下，核糖核苷二磷酸（NDP）核糖部分的2′-羥基被氫原子取代，轉(zhuǎn)變成脫氧核糖核苷二磷酸（dNDP）。核糖核苷酸還原酶是由核苷二磷酸還原酶、硫氧還蛋白和硫氧還蛋白還原酶組成。脫氧核糖核苷酸的生物合成第28頁(yè),共32頁(yè)，2024年2月