細(xì)胞工程第一次課

關(guān)于細(xì)胞工程第一次課12第一節(jié)細(xì)胞工程概述一、細(xì)胞工程概念

細(xì)胞工程是指以細(xì)胞作為研究對(duì)象，應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的原理與方法，在細(xì)胞水平上進(jìn)行的操作，按照人們的意志設(shè)計(jì)改造細(xì)胞的某些遺傳性狀，從而培育出新的生物改良品種或通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)獲得自然界中難以獲得的珍貴產(chǎn)品的新興生物技術(shù)。第2頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天3二、細(xì)胞工程發(fā)展史上的主要事件1902年，Haherlandt預(yù)言了植物細(xì)胞的全能性；1907，美國(guó)Harrison培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)組織；1934，荷蘭溫特發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素；1960，英國(guó)諾丁汗大學(xué)科金教授使用酶解方法從番茄幼苗根部制備得到大量原生質(zhì)體；1972，美國(guó)卡爾森等用NaNO3為融合誘導(dǎo)劑，將來(lái)自不同種的煙草原生質(zhì)體進(jìn)行融合，獲得世界上第一個(gè)體細(xì)胞雜種植株；1977，英國(guó)胚胎工程技術(shù)，首例試管嬰兒；1997，多莉克隆羊；2001，首例克隆豬…第3頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天4第4頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天5第5頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天61927-2002賽瑟·米爾斯坦CésarMilsteinGeorgesK?hler1946-1995喬治·可雷爾第6頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天7第二節(jié)細(xì)胞工程的基本技術(shù)細(xì)胞工程的分類(lèi)①按遺傳操作的對(duì)象結(jié)構(gòu)層次分細(xì)胞工程染色體工程染色體組工程細(xì)胞質(zhì)工程細(xì)胞融合工程第7頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天8根據(jù)研究對(duì)象不同植物細(xì)胞工程動(dòng)物細(xì)胞工程微生物細(xì)胞工程第8頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天9一、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1.概念

細(xì)胞培養(yǎng)是將生物體內(nèi)的某一塊組織取出，在體外經(jīng)過(guò)表面消毒處理后，用酶消化法將組織塊分散成單個(gè)的細(xì)胞，然后放置在人工配制的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并使它們?cè)隗w外生長(zhǎng)繁殖的技術(shù)。第9頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天102.細(xì)胞生長(zhǎng)所需的培養(yǎng)條件必須供給足夠的營(yíng)養(yǎng)主要包括糖、氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽等；必須保證一定的生長(zhǎng)環(huán)境，如合適的溫度、pH值以及無(wú)菌條件。第10頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天11第11頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天12第12頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天13第13頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天14第14頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天15第15頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天16第16頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天17第17頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天18二、細(xì)胞融合技術(shù)1.概念

細(xì)胞融合又稱為體細(xì)胞雜交，由法國(guó)的Barski等于1960年首先創(chuàng)立。它是指在離體條件下用人工方法將兩個(gè)或多個(gè)不同種的細(xì)胞通過(guò)無(wú)性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的過(guò)程。融合后的細(xì)胞含有兩個(gè)或多個(gè)不同的細(xì)胞核，稱為異核體。第18頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天19融合的過(guò)程第19頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天201、病毒誘導(dǎo)融合：仙臺(tái)病毒、腺病毒等2、化學(xué)誘導(dǎo)融合：PEG、聚賴氨酸等3、物理誘導(dǎo)融合：電場(chǎng)脈沖、激光等細(xì)胞融合的方法第20頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天21細(xì)胞融合儀電誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合第21頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天22三、細(xì)胞重組技術(shù)細(xì)胞重組就是在體外條件下運(yùn)用一定的實(shí)驗(yàn)技術(shù)從活細(xì)胞中分離出各種細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或組成“部件”，再把它們?cè)诓煌募?xì)胞之間重新進(jìn)行裝配，從而得到新的生物活性細(xì)胞。第22頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天231.核移植技術(shù)核移植技術(shù)是借助顯微操作儀，利用微吸管將一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核吸出并移植到另一個(gè)去核的細(xì)胞中，從而可能創(chuàng)造出新生物品種的一項(xiàng)技術(shù)。2.細(xì)胞器移植細(xì)胞器種類(lèi)很多，分離與純化也比較容易，不過(guò)研究較多的是葉綠體和線粒體的移植。第23頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天24第三節(jié)植物細(xì)胞工程植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物細(xì)胞培養(yǎng)與次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)植物原生質(zhì)體培養(yǎng)植物原生質(zhì)體融合技術(shù)人工種子單倍體植物的誘發(fā)與利用體細(xì)胞遺傳變異及其利用第24頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天25一、植物組織培養(yǎng)技術(shù)1.概念植物細(xì)胞全能性細(xì)胞分化和脫分化植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)外植體愈傷組織形態(tài)發(fā)生第25頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天26細(xì)胞全能性指植物體的每個(gè)細(xì)胞在離體條件下都具有誘導(dǎo)生長(zhǎng)分化形成完整植株的潛在能力，這是因?yàn)槊總€(gè)細(xì)胞都具有一套完整的基因組。細(xì)胞的全能性是植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)的主要依據(jù)。細(xì)胞全能性第26頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天27細(xì)胞分化（differentiation），是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過(guò)程。細(xì)胞脫分化(dedifferentiation)培養(yǎng)條件下使一個(gè)已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無(wú)分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過(guò)程。細(xì)胞分化和脫分化第27頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天28植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)是指將植物的器官、組織、細(xì)胞或細(xì)胞器進(jìn)行離體、無(wú)菌的培養(yǎng)，并重新生成細(xì)胞或植物的過(guò)程。植物器官培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)離體胚胎培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)花粉培養(yǎng)第28頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天29外植體植物組織培養(yǎng)中，作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織的片段統(tǒng)稱為外植體（explant)，如植物的根、莖、葉、花、果、穗、胚珠、胚乳、花藥、花粉等均可作為外植體。外植體的脫分化因植物種類(lèi)、器官來(lái)源及其生理狀況的不同而有很大差別。例如，煙草、胡蘿卜等植物的脫分化比較容易，禾本科植物的脫分化比較難；花的脫分化比較容易，莖、葉的脫分化比較難；幼嫩組織的脫分化比較容易，成熟的老組織脫分化比較難。外植體選取合理與否，不僅影響培養(yǎng)的難易，而且有時(shí)甚至影響分化的程度和器官類(lèi)型。第29頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天30愈傷組織外植體經(jīng)過(guò)培養(yǎng)所形成的脫分化的植物細(xì)胞團(tuán)稱為愈傷組織。在植物組織培養(yǎng)中，主要目標(biāo)是誘導(dǎo)愈傷組織形成和形態(tài)發(fā)生，使一個(gè)離體的細(xì)胞、一塊組織或一個(gè)器官的細(xì)胞，通過(guò)脫分化形成愈傷組織，并由愈傷組織再分化形成植物體。第30頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天31形態(tài)發(fā)生植物的離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過(guò)程。植物的離體體細(xì)胞胚胎發(fā)生指各種外植體、培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體在培養(yǎng)條件下形成胚的類(lèi)似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體）的過(guò)程。第31頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天322.植物細(xì)胞全能性的實(shí)現(xiàn)條件與過(guò)程條件：使植物細(xì)胞處于體外條件下（解除植株其余部分的影響）一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和培養(yǎng)條件，適當(dāng)?shù)拇碳さ?2頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天33外植體愈傷組織生長(zhǎng)點(diǎn)根、芽或胚狀體小植株脫分化再分化器官發(fā)生營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程胚胎發(fā)生第33頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天343.植物組織/細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)要求和培養(yǎng)條件（1）培養(yǎng)基成分無(wú)機(jī)鹽碳源和能源維生素氮源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)子第34頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天35MS組成配制1升（1000毫升）培養(yǎng)基硝酸銨1.65克硝酸鉀1.9克氯化鈣0.44克硫酸鎂0.37克磷酸二氫鉀0.17克碘化鉀0.83毫克硼酸5.2毫克硫酸鎂22.3毫克硫酸鋅3.6毫克鉬酸鈉0.25毫克硫酸銅0.025毫克氯化鈷0.025毫克硫酸鐵27.8毫克蔗糖30克瓊脂7克。其他生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)要根據(jù)花卉的種類(lèi)和培養(yǎng)目的而確定第35頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天36（2）培養(yǎng)條件要求光照：強(qiáng)度、光質(zhì)和光周期濕度：容器內(nèi)的濕度幾乎是100%的相對(duì)濕度，二是環(huán)境的相對(duì)濕度一般要求70～80%。溫度：通常24-28℃pH值：5.6-6.0之間氣體滲透壓第36頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天374.植物組織培養(yǎng)五階段預(yù)備階段：培養(yǎng)室、培養(yǎng)容器、接種工具的準(zhǔn)備，培養(yǎng)基制備，選擇合適的外植體、表面殺菌。誘導(dǎo)去分化階段：接種，外植體在含有生長(zhǎng)素類(lèi)激素的培養(yǎng)基中形成愈傷組織（光照非必需）繼代增殖階段：將愈傷組織移植到含有細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中，愈傷組織細(xì)胞數(shù)大大擴(kuò)增生根發(fā)芽階段：將愈傷組織移植到含有細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基中，使其重新分化成胚狀體，繼而長(zhǎng)成小植株（光照必需）移栽成活階段第37頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天38第38頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天395.植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用（1）植物脫毒植物脫毒：馬鈴薯、大蒜、甘薯、草莓及許多果樹(shù)和花卉，由于多代營(yíng)養(yǎng)繁殖，植株體內(nèi)積累了大量的病毒，種性退化嚴(yán)重，表現(xiàn)為作物生長(zhǎng)受到抑制，形態(tài)畸變，產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣等；而利用莖尖組織培養(yǎng)輔以化學(xué)或高溫處理，可以較好地起到植株脫毒作用，培養(yǎng)出來(lái)的種苗稱作脫毒苗。第39頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天40大田作物：馬鈴薯、甘薯、甘蔗、煙草蔬菜：白菜、大蒜、蔥、番茄、蘿卜。果樹(shù)：柑橘、蘋(píng)果、草莓、香蕉?；ɑ埽合闶?、各種菊花、天竹葵、紫羅蘭等大蒜：留種量占產(chǎn)量的五到八分之一。馬鈴薯：留種量占產(chǎn)量的十分之一。貝母：留種量占產(chǎn)量的三分之一。第40頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天41脫毒技術(shù)在感染病毒的植株中，病毒的分布是不一致的。在老葉片及成熟組織和器官中，病毒含量較高，但幼嫩的和未成熟的植物部位，病毒的含量較低，而在生長(zhǎng)點(diǎn)約0.1～1毫米時(shí)，則幾乎不含病毒顆粒。這是由于病毒的繁殖運(yùn)輸速度與莖尖細(xì)胞生長(zhǎng)速度不同所致。在莖尖分生組織中，細(xì)胞繁殖十分迅速，病毒還來(lái)不及侵入，因此就成為植物體相對(duì)無(wú)病毒`的特殊區(qū)域。第41頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天42植物的去病毒技術(shù)，實(shí)質(zhì)上就是采取不含病毒顆?；虿《绢w粒含量甚少的0.1～0.5毫米帶1～2個(gè)葉原基的莖尖作為外植體，進(jìn)行微繁殖，使其培養(yǎng)成完整的無(wú)病毒小植株的技術(shù)。由于所取的外植體很小，分離難度大，一般在解剖鏡下操作。培養(yǎng)無(wú)病毒所用的器具必須嚴(yán)格消毒，克服培養(yǎng)中的污染也是成敗的關(guān)鍵。第42頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天43脫毒效果檢測(cè)指示植物鑒定(testplants)所謂指示植物是指具有能夠辨別某種病毒的專(zhuān)化性癥狀的寄主植物。血清鑒定(serologictest)試管沉淀反應(yīng)；免疫雙擴(kuò)散；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。第43頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天44（2）快速繁殖技術(shù)快速繁殖技術(shù)：植物的一個(gè)細(xì)胞或很小的一塊組織通過(guò)組織培養(yǎng)就可以長(zhǎng)成一株幼苗。因這些幼苗多在試管里形成，人們又常常稱它們?yōu)椤霸嚬苊纭薄Ｅ嘤龅挠酌邕€可以繼續(xù)切割再次進(jìn)行培養(yǎng)，這樣一變十，十變百，就可繁殖出大量的幼苗。第44頁(yè),共54頁(yè)，2024年2月25日，星期天45用于加速某些難繁殖或繁殖速度很低的植物，或某些需要