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第三部分微生物工程生產(chǎn)設(shè)備18培養(yǎng)基滅菌及滅菌設(shè)備11、由于雜菌的污染,使生物反應(yīng)中的基質(zhì)或產(chǎn)物因雜菌的消耗而損失,造成生產(chǎn)能力的下降;2、由于雜菌所產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物,或在染菌后改變了培養(yǎng)液的某些理化性質(zhì),使產(chǎn)物的提取和分離變得困難,造成收率降低或使產(chǎn)品的質(zhì)量下降;3、雜菌會(huì)大量繁殖,會(huì)改變反應(yīng)介質(zhì)的PH值,從而使生物反應(yīng)發(fā)生異常變化;4、雜菌可能會(huì)分解產(chǎn)物,從而使生產(chǎn)過(guò)程失??;
5、發(fā)生噬菌體污染,微生物細(xì)胞被裂解,而使生產(chǎn)失敗,等等
在發(fā)酵生產(chǎn)中,為什么要進(jìn)行滅菌操作?問(wèn)題121、為防止雜菌的污染,哪些需要滅菌?培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備、空氣問(wèn)題2滅菌的定義滅菌利用物理和化學(xué)的方法殺滅或除去物料及設(shè)備中一切生命物質(zhì)的過(guò)程。。消毒是指用物理或化學(xué)的方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物,一般只能殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死芽孢。3
消毒與滅菌在發(fā)酵工業(yè)中均有廣泛應(yīng)用。消毒是指用物理或化學(xué)方法殺死物料、容器、器具內(nèi)外的病源微生物。一般只能殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞而不能殺死細(xì)菌芽孢。例如,用于消牛奶、啤酒和釀酒原汁等的巴氏消毒法,是將物料加熱至60℃維持30min,以殺死不耐高溫的物料中的微生物營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。滅菌是用物理或化學(xué)方法殺死或除去環(huán)境中所有微生物,包括營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌芽孢和孢子。消毒不一定能達(dá)到滅菌要求,而滅菌則可達(dá)到消毒的目的
消毒與滅菌的區(qū)別4一、常用滅菌方法的基本原理(一)化學(xué)試劑滅菌法(二)射線滅菌法(三)干熱滅菌法化學(xué)試劑:甲醛、乙醇或新潔爾滅、高錳酸鉀等適用范圍:環(huán)境空氣、皮膚及器械的表面消毒電磁波、紫外線或放射性物質(zhì)適用范圍:無(wú)菌室、接種箱常用烘箱,滅菌條件為在160℃下保溫1h
適用范圍:金屬或玻璃器皿5消毒劑用途常用濃度使用方法1氧化劑:高錳酸鉀漂白粉
皮膚消毒發(fā)酵工廠環(huán)境消毒
0.1-0.25%2-5%
環(huán)境消毒可直接用于粉體2醇類:乙醇
皮膚及器物的消毒
70-75%
器物消毒浸泡30min3酚類:石碳酸來(lái)蘇爾
浸泡衣物、擦拭房間桌面、噴霧消毒皮膚、桌面、器械消毒
1-5%3-5%
4甲醛空氣消毒1-2%(10-15ml/m3)加熱熏蒸4h5銨鹽新潔而滅
皮膚、器械、環(huán)境消毒
0.1-0.25%
浸泡30min◎常用化學(xué)消毒劑及其使用方法6◎.電磁波、射線滅菌法.原理:利用高能電磁波、紫外線或放射性物質(zhì)產(chǎn)生的高能粒子可以起到滅菌的作用。波長(zhǎng)在(2.1-3.1)×10-7m的紫外線表面或空氣滅菌。波長(zhǎng)在(0.06-1.4)×10-7m的X射線/γ射線(Co60)
在工業(yè)上還少采用。穿透力差設(shè)備投資高7(四)濕熱滅菌法(五)過(guò)濾除菌法(六)火焰滅菌法
利用飽和蒸汽進(jìn)行滅菌、條件為:121℃,30min。由于蒸汽有很強(qiáng)的穿透力,冷凝時(shí)放出大量的潛熱,來(lái)源方便,價(jià)格低廉,滅菌效果好,是目前最基本的適合培養(yǎng)基和設(shè)備的滅菌方法。適用范圍:廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)設(shè)備及培養(yǎng)基的滅菌。例:高壓滅菌鍋利用過(guò)濾方法阻留微生物
適用范圍:制備無(wú)菌空氣酒精燈火焰。方法簡(jiǎn)單、滅菌徹底,但適用范圍有限適用范圍:接種針、玻璃棒、三角瓶口
8接種針、試管口皮膚表面無(wú)菌室、接種箱培養(yǎng)基的滅菌空氣過(guò)濾除菌法火焰滅菌法濕熱滅菌法射線滅菌法化學(xué)試劑滅菌法營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、芽孢、病毒或孢子?比較各種微生物對(duì)熱的抵抗能力大小滅菌方法連線題91.熱滅菌的原理濕熱滅菌原理滅菌條件滅菌不利方面同時(shí)也會(huì)破壞培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分,甚至?xí)a(chǎn)生不利于菌體生長(zhǎng)的物質(zhì)。因此,在工業(yè)培養(yǎng)過(guò)程中,除了盡可能殺死培養(yǎng)基中的雜菌外,還要盡可能減少培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的損失由于蒸汽具有很強(qiáng)的穿透能力,而且在冷凝時(shí)會(huì)放出大量的冷凝熱,很容易使蛋白質(zhì)凝固而殺死各種微生物。121℃,30min。10衡量熱滅菌指標(biāo)
致死溫度:殺死微生物的極限溫度。致死時(shí)間:在此溫度下,殺死全部微生物所需要的時(shí)間。熱阻:對(duì)熱的抵抗力,指微生物在某一特定條件(主要是溫度和加熱方式)下的致死時(shí)間。相對(duì)熱阻:幾種微生物對(duì)熱的相對(duì)抵抗能力。指微生物在某一特定條件下的致死時(shí)間與另一微生物在相同條件下的致死時(shí)間的比值。
11微生物相對(duì)熱阻細(xì)菌和酵母的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞1細(xì)菌芽孢3×106霉菌孢子2-10病毒及噬菌體1-5微生物對(duì)熱的抵抗力稱為熱阻(heatresistance)12某些微生物的相對(duì)熱阻。滅菌方式大腸桿菌霉菌孢子細(xì)菌芽孢噬菌體或病毒干熱滅菌12-1010001濕熱滅菌12-103×1051-5苯酚11-21×10930甲醛12-102502紫外線15-1002-55-10說(shuō)說(shuō)芽孢或孢子的熱阻要比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的熱阻大的原因?13芽孢或孢子的熱阻要比生長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的熱阻大得多,這是由于芽孢或孢子內(nèi)吡啶二羧酸含量對(duì)熱阻的增加有關(guān)。另外,芽孢子中蛋白質(zhì)含水量較營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞低(特別是游離水分少),也是芽孢耐熱強(qiáng)的一個(gè)原因。圖FS7954芽孢桿菌的芽孢在不同溫度下的死亡情況。10t(min)N/N010-110-210-310-4510152025121116110108105嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢在不同溫度下的死亡曲線14微生物的熱死規(guī)律和影響滅菌的因素在發(fā)酵工業(yè)中,對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備的滅菌,廣泛使用濕熱滅菌法。工廠里,蒸汽比較容易獲得,控制操作條件方便,是一種簡(jiǎn)單而又價(jià)廉、有效的滅菌方法。用濕熱滅菌的方法處理培養(yǎng)基,其加熱受熱時(shí)間與滅菌程度和營(yíng)養(yǎng)成分的破壞都有關(guān)系。營(yíng)養(yǎng)成分的減少將影響菌種的培養(yǎng)和產(chǎn)物的生成,所以滅菌程度和營(yíng)養(yǎng)成分的破壞成為滅菌工作中的主要矛盾,恰當(dāng)掌握加熱受熱時(shí)間是滅菌工作的關(guān)鍵。受熱時(shí)間如何確定?151、微生物的死亡速率:對(duì)數(shù)殘留定律
微生物受熱死亡的原因,主要是因高溫使微生物體內(nèi)的一些重要蛋白質(zhì),如酶等,發(fā)生凝固、變性,從而導(dǎo)致微生物無(wú)法生存而死亡。微生物受熱而喪失活力,但其物理性質(zhì)不變。
16在一定溫度下,微生物的受熱死亡遵照分子反應(yīng)速度理論。在滅菌過(guò)程中,微生物的死亡速率與任一瞬時(shí)殘存的活菌數(shù)成正比,對(duì)數(shù)殘留定律.數(shù)學(xué)表達(dá)式:-dN/d=NN:培養(yǎng)基中活的微生物個(gè)數(shù);
:時(shí)間(s);
:比死亡速率(s-1)(死亡速率常數(shù))dN/d
:微生物的瞬間變化率,即死亡速率17若開(kāi)始滅菌(
=0)時(shí),培養(yǎng)基中活的微生物數(shù)為N0
=(2.303logN0/N)/
-dN/d=NlnN/N0=-
積分2.303logN0/N=
or18各種微生物在同樣的溫度下K值是不同的,K值愈小,則此微生物愈耐熱在121度,枯草桿菌FS5230的K為0.047s-1,梭狀芽孢桿菌PA3679的K值為0.03s-1
,請(qǐng)問(wèn)哪一種微生物更耐熱?上式是計(jì)算滅菌的基本公式,滅菌速度常數(shù)K是判斷微生物受熱死亡難易程度的基本依據(jù)。10t(min)N/N0大腸桿菌在不同溫度下的死亡曲線10-110-210-310-424681060585654
=(2.303logN0/N)/
19可見(jiàn)滅菌時(shí)間取決于污染程度(N0)、滅菌程度(殘留菌數(shù)N)和
值在培養(yǎng)基中有各種各樣的微生物,不可能逐一加以考慮。一般只考慮芽孢細(xì)菌和細(xì)菌的芽孢數(shù)之和作為計(jì)算依據(jù)。滅菌程度,即殘留菌數(shù),如果要求完全徹底滅菌,即N=0,則為∞,上式無(wú)意義,事實(shí)上也不可能。一般取N=0.001,即1000次滅菌中有1次失敗。
=(2.303logN0/N)/
20例:有一發(fā)酵罐內(nèi)裝40m3培養(yǎng)基,在121溫度下進(jìn)行實(shí)罐滅菌。原污染程度為每1mL有2*105個(gè)耐熱細(xì)菌芽孢,121度時(shí)滅菌速度常數(shù)為1.8min-1。求滅菌失敗機(jī)率為0.001時(shí)所需要的滅菌時(shí)間。解:N0=40×106×2×105=8×1012(個(gè))
Ns=0.001(個(gè))K=1.8min-121連續(xù)滅菌(連消)連續(xù)滅菌的滅菌時(shí)間,仍可用滅菌公式計(jì)算,但培養(yǎng)基中的含菌數(shù),應(yīng)改為每單位體積(1mL)培養(yǎng)基的含菌數(shù),則滅菌公式變換為下式式中c0—單位體積培養(yǎng)基滅菌前的含菌數(shù),個(gè)/mL;cs—單位體積培養(yǎng)基滅菌后的含菌數(shù),個(gè)/mL。22【例】若將上例中的培養(yǎng)基采用連續(xù)滅菌,滅菌溫度為131℃,此溫度下滅菌速率常數(shù)為15min-1,求滅菌所需的維持時(shí)間。解232、滅菌的溫度和時(shí)間
上面說(shuō)過(guò),當(dāng)培養(yǎng)基被加熱滅菌時(shí),常會(huì)出現(xiàn)這樣的矛盾,這就是,加熱時(shí),微生物固然會(huì)被殺死,但培養(yǎng)基中的有用成分也會(huì)隨之遭到破壞,那么有何良策可以既達(dá)到滅菌要求,同時(shí)又不破壞或盡可能少破壞培養(yǎng)基中的有用成分呢?
實(shí)踐證明,在高壓加熱的情況下,培養(yǎng)基中的氨基酸和維生素極易被破壞,如在121℃,僅20min,就有59%的賴氨酸和精氨酸及其他堿性氨基酸被破壞,蛋氨酸和色氨酸也有相當(dāng)數(shù)量被破壞。因此,必須選擇一個(gè)既能滿足滅菌需要,又可使培養(yǎng)基的破壞盡可能養(yǎng)活的滅菌工藝條件。
24微生物的受熱死亡屬于單分子反應(yīng),其滅菌速率常數(shù)K與溫度之間的關(guān)系可用阿累尼烏斯公式表示:K—滅菌速度常數(shù)(s-1),也稱反應(yīng)速度常數(shù)或比死亡速度常數(shù).=AeRT-—EA—比例常數(shù);E—?dú)⑺兰?xì)菌所需的活化能,(
E)(×4.18J/mol);T—絕對(duì)溫度,(K)R—?dú)怏w常數(shù),[1.978×4.18J/(mol·K)]e—2.71(exp)25
′=A′eRTE′-—A′—比例常數(shù);E′—分解活化能,(
E′)(×4.18J/mol);T—絕對(duì)溫度,(K)R—?dú)怏w常數(shù),[1.978×4.18J/(mol·K)]e—2.71(exp)滅菌時(shí),培養(yǎng)基成分分解速率常數(shù)K`與溫度之間的關(guān)系也可用阿累尼烏斯公式表示:26
1=AeRT1E-—
2=Ae-—ERT2相除取對(duì)數(shù)ln
2
1=E11RT1T2-〔〕在滅菌時(shí),當(dāng)溫度變化,菌死亡速率常數(shù)和培養(yǎng)基成分破壞速率常數(shù)′都變化。溫度由T1升高到T2,值分別為:同樣,滅菌時(shí)培養(yǎng)基成分的破壞也可得類似關(guān)系:ln
2′
1′=〔〕RT1T2E′1127ln(
2
/1)ln(
2′
/1′)=EE′上面兩式相除,得28名稱E(J/mol)葉酸泛酸維生素B12維生素B1嗜熱脂肪芽孢桿菌枯草桿菌肉毒梭菌70.387.996.792.128331834329通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定可知:
滅菌時(shí)殺死微生物的活化能大于培養(yǎng)基成分的破壞活化能值,因此:
結(jié)論1:當(dāng)滅菌溫度上升時(shí),微生物殺死速率的提高要超過(guò)培養(yǎng)基成分的破壞速率的增加。
30從上述的分析可知,在熱滅菌過(guò)程中,同時(shí)會(huì)發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞這兩種過(guò)程,且這兩種過(guò)程的進(jìn)行速度都隨溫度的升高而加速,但微生物的死亡速率隨溫度的升高更為顯著。因此,可選擇合適的滅菌溫度和時(shí)間來(lái)調(diào)和二者之間的矛盾。滅菌溫度℃滅菌時(shí)間(分)營(yíng)養(yǎng)成分破壞量%10040099.31103667.01151550.0120427.01300.58.01450.082.01500.011.0再看表滅菌溫度、時(shí)間與營(yíng)養(yǎng)成分破壞量的關(guān)系(N/No=0.001)據(jù)測(cè)定,每升高10℃時(shí)一般化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率的增加倍數(shù)是1.5-2.0,而殺死芽孢為5-10,殺死微生物細(xì)胞為35左右。31
由此可見(jiàn),若要減少營(yíng)養(yǎng)成分的破壞,可升高溫度滅菌。結(jié)論2:在滅菌時(shí)選擇較高的溫度、較短的時(shí)間,這樣便既可達(dá)到需要的滅菌程度,同時(shí)又可減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。問(wèn)題滅菌要達(dá)到殺死99.99%的細(xì)菌芽孢,有兩種方法可以采用,一種是118滅菌15min,另一種是128滅菌5min。哪一種方法好,為什么?
答:從理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐都可證明,在滅菌過(guò)程中,同時(shí)會(huì)發(fā)生微生物死亡和培養(yǎng)基破壞這兩種過(guò)程,且這兩種過(guò)程的進(jìn)行速度都隨溫度的升高而加速,但微生物的死亡速率隨溫度的升高更為顯著。因此,對(duì)于同一滅菌效果,選擇較高的溫度、較短的時(shí)間,這樣便既可達(dá)到需要的滅菌程度,同時(shí)又可減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。323、影響滅菌的因素培養(yǎng)基中氫離子濃度對(duì)滅菌的影響
培養(yǎng)基中氫離子濃度直接影響滅菌的效果。培養(yǎng)基的酸堿度越大,所需殺滅微生物的溫度越低。溫度/℃孢子數(shù)/(個(gè)/ml)滅菌時(shí)間/minpH值6.1pH值5.3pH值5.0pH值4.7pH值4.5120100008753311510000252512131311010000706535302410010000740720180150150pH6.0~8.0,微生物最耐熱;pH<6.0,氫離子易滲入微生物細(xì)胞內(nèi),從而改變細(xì)胞的生理反應(yīng),促使其死亡。所以,培養(yǎng)基pH值愈低,滅菌所需的時(shí)間愈短。33微生物細(xì)胞中水分對(duì)滅菌的影響細(xì)胞含水越多,蛋白質(zhì)變性的溫度越低微生物細(xì)胞菌齡對(duì)滅菌的影響老細(xì)胞水分含量低、低齡細(xì)胞水分含量高培養(yǎng)基的物理狀態(tài)對(duì)滅菌的影響培養(yǎng)基中微生物數(shù)量對(duì)滅菌的影響34
為什么說(shuō)培養(yǎng)基中脂肪、糖分和蛋白質(zhì)的含量越高,滅菌溫度就得相應(yīng)高些?問(wèn)題問(wèn)題滅菌的徹底與否應(yīng)以殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞為準(zhǔn)還是殺死細(xì)菌孢為標(biāo)準(zhǔn),為什么?環(huán)境耐熱性大腸桿菌水60~65℃便死亡10%糖液70℃,4~6min30%糖液70℃,30min答:培養(yǎng)液中油脂、糖類及一定濃度的蛋白質(zhì)會(huì)增加微生物的耐熱性,高濃度有機(jī)物會(huì)包于細(xì)胞周圍形成一層薄膜,影響熱的傳遞;因此,在固形物含量高的情況下,滅菌溫度可高些。高濃度鹽類、色素能削減其耐熱性。35答:泡沫中的空氣形成隔熱層,使傳熱困難,熱難穿透過(guò)去殺滅微生物。因而有時(shí)需要在培養(yǎng)基中加入消泡沫劑以減少泡沫的產(chǎn)生,或適當(dāng)提高滅菌溫度,延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。問(wèn)題在滅菌過(guò)程中,為什么說(shuō)培養(yǎng)基發(fā)生泡沫對(duì)滅菌很不利?液膜空氣空氣36問(wèn)題答:蒸汽滅菌過(guò)程中,溫度的控制是通過(guò)控制罐內(nèi)的蒸汽壓力來(lái)實(shí)現(xiàn)。壓力表顯示的壓力應(yīng)與罐內(nèi)蒸汽壓力相對(duì)應(yīng),即壓力表的壓力所對(duì)應(yīng)的溫度應(yīng)是罐內(nèi)的實(shí)際溫度。但是如果罐內(nèi)空氣排除不完全,壓力表所顯示的壓力就不單是罐內(nèi)蒸汽壓力,還包括了空氣分壓,因此,此時(shí)罐內(nèi)的實(shí)際溫度就低于壓力表顯示壓力所對(duì)應(yīng)的溫度,以致造成滅菌溫度不夠而滅菌不徹底在滅菌過(guò)程中,為什么要排除罐內(nèi)空氣?蒸汽壓力與溫度的關(guān)系蒸汽壓力(atm)相應(yīng)的溫度(℃)空氣完全驅(qū)除程度罐內(nèi)實(shí)際溫度(℃)0.3107.7完全驅(qū)除121.60.7115.5驅(qū)除2/3115.01.0121.6驅(qū)除1/2112.01.3126.6驅(qū)除1/3109.01.5130.5全未驅(qū)除100.037培養(yǎng)基的PH值越低,滅菌所需的時(shí)間就愈短。()問(wèn)題判斷在實(shí)際生產(chǎn)中,不宜采用嚴(yán)重霉腐的腐敗的水質(zhì),是因?yàn)槠湮⑸飻?shù)量多,影響滅菌效果。()微生物含水量越多,滅菌時(shí)間就得越長(zhǎng)。()年輕細(xì)胞比年老細(xì)胞更易殺死。()在滅菌過(guò)程中,充分?jǐn)嚢韪欣跍缇?。(?8二生產(chǎn)上培養(yǎng)基的滅菌方法(一)分批滅菌
概念:先將輸料管內(nèi)的污水放凈并沖洗干凈將配制好的培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐、種子罐或補(bǔ)料罐,用蒸汽直接加熱,達(dá)到滅菌要求的溫度和壓力后維持一定時(shí)間,再冷卻至發(fā)酵要求的溫度,這一工藝過(guò)程稱分批滅菌(實(shí)罐滅菌)
優(yōu)點(diǎn):設(shè)備要求低,操作簡(jiǎn)便
缺點(diǎn):營(yíng)養(yǎng)成份有損失罐利用率低不能采用高溫快速滅菌工藝39操作1、在進(jìn)行培養(yǎng)基滅菌之前,通常應(yīng)先把發(fā)酵罐的分空氣過(guò)濾器滅菌并用無(wú)菌空氣吹干。若已先行空罐滅菌,此步可不進(jìn)行2、預(yù)熱向夾套或蛇管中通入蒸汽,間接將培養(yǎng)基加熱至70℃左右。作用:
利于糊化;減少冷凝水的生成;減輕噪音403、開(kāi)啟蒸汽管,向培養(yǎng)基中通入蒸汽,升溫。4、罐壓達(dá)1kg/cm2(0.1MPa)時(shí),按裝在發(fā)酵罐封頭的接種管、補(bǔ)料管、消泡劑管等應(yīng)排汽。5、保溫調(diào)節(jié)好各進(jìn)汽和排汽閥門,使罐壓和溫度保持在一穩(wěn)定水平,維持一定時(shí)間。在保溫階段,凡進(jìn)口在培養(yǎng)基液面下的各管道都應(yīng)通入蒸汽;在液面上的其余管道則應(yīng)排放蒸汽,這樣才能保證滅菌徹底,不留死角。416、保溫結(jié)束后,依次關(guān)閉各排汽、進(jìn)汽閥;待罐內(nèi)壓力降至0.5kg/cm2左右時(shí),向罐內(nèi)通入無(wú)菌空氣,向夾套或蛇管中通入冷水,使培養(yǎng)基降至所需溫度。通入無(wú)菌空氣的作用:加速降溫;保持罐內(nèi)正壓42事故2002年9月5日衡陽(yáng)市某啤酒廠釀造車間一臺(tái)容積100m3的不銹鋼發(fā)酵糖在清洗過(guò)程中發(fā)生收縮變形而吸癟,造成直接經(jīng)濟(jì)損失22萬(wàn)元的重大設(shè)備事故。4350m3發(fā)酵罐失穩(wěn)事故分析1事故情況
1998年安陽(yáng)市某化工廠車間一臺(tái)50m3發(fā)酵罐在空罐消毒后水冷卻過(guò)程中突然失穩(wěn)。無(wú)傷亡事故,直接經(jīng)濟(jì)損失20余萬(wàn)元。2事故原因分析
現(xiàn)場(chǎng)勘察發(fā)現(xiàn),該罐進(jìn)汽口和出汽門閥門關(guān)閉。冷卻水閥門敞開(kāi)。這說(shuō)明,失穩(wěn)是在冷卻過(guò)程中發(fā)生的。
許用壓力計(jì)算
100℃以下罐體就會(huì)承受外壓。外壓值等于大氣壓與水的飽和蒸汽壓之差。70℃以下水的飽和蒸汽壓與罐內(nèi)負(fù)壓值見(jiàn)附表。實(shí)測(cè)筒體許用外壓力0.0832MPa。比較上表不難看出,當(dāng)罐內(nèi)溫度降到60℃以下后,罐體失穩(wěn)隨時(shí)都有可能發(fā)生。443、分批滅菌的注意事項(xiàng)1)各路蒸汽進(jìn)口要暢通,防止短路逆流;罐內(nèi)液體翻動(dòng)要?jiǎng)×?,以使罐?nèi)物料達(dá)到均一的滅菌溫度。2)排氣量不宜過(guò)大,以節(jié)約蒸汽3)滅菌將要結(jié)束時(shí),應(yīng)立即引入無(wú)菌空氣以保持罐壓,然后開(kāi)夾套或蛇管冷卻,以避免罐壓迅速下降產(chǎn)生負(fù)壓而吸入外界空氣,或引起發(fā)酵罐破壞。4)在引入無(wú)菌空氣前,罐內(nèi)壓力必須低于過(guò)濾器壓力,否則培養(yǎng)基將倒流入過(guò)濾器。45過(guò)程包括:升溫、保溫和冷卻等三個(gè)階段。各階段對(duì)滅菌的貢獻(xiàn):20%、75%、5%024016012080時(shí)間(min)50100150溫度升溫冷卻保溫圖為培養(yǎng)基間歇滅菌過(guò)程中的溫度變化情況46V=V加熱
+V維持
+V冷卻
RT2(E–2RT)V加熱
=————————·t加熱
(T-T0)E2
RT2(E–2RT)V冷卻
=————————·t冷卻
(T-T0)E247R:氣體常數(shù);=1.986[卡/克分子·K]E:耐熱孢子致死的活化能;=65000[卡/克分子]T:滅菌維持溫度;121℃(393K)T0:開(kāi)始計(jì)算滅菌效果的溫度;100℃(373K)48例1)小型發(fā)酵罐在120℃滅菌維持15分鐘,由100℃(100℃以下滅菌效果不計(jì))加熱至120℃的時(shí)間為5分鐘,由120℃冷卻到100℃的時(shí)間為3分鐘,計(jì)算總的滅菌時(shí)間。
1.986×3932(65000–2×1.986×393)V加熱
=————————————————×5=1.15(393-373)×650002
RT2(E–2RT)V加熱
=————————·t加熱
(T-T0)E249
1.986×3932(65000–2×1.986×393)V冷卻
=————————————————×3=0.69(393-373)×650002V=V加熱
+V維持
+V冷卻
=1.15+15+0.69=16.6(min)
RT2(E–2RT)V冷卻
=————————·t冷卻
(T-T0)E250例2)
如果滅菌條件不變,大罐由100℃加熱到120℃需24分鐘;冷卻至100℃的時(shí)間為16分鐘;求大罐的維持時(shí)間。
1.986×3932(65000–1.986×393)V加熱+V冷卻=————————————————×(24+16)
(393-373)×650002
=9.2min則大罐維持時(shí)間V維持
=V-(V加熱+V冷卻)=16.6–9.2=7.4min51在不同規(guī)模的發(fā)酵罐中達(dá)到同樣滅菌效果所需時(shí)間發(fā)酵罐規(guī)模(升)120℃維持時(shí)間(分)
20017.5
50012.6
500011.3500008.852在實(shí)際生產(chǎn)中,也可能遇到所供蒸汽不足、溫度不夠高的情況,這時(shí)可以適當(dāng)延長(zhǎng)滅菌時(shí)間。生產(chǎn)上甚至有100℃蒸煮而達(dá)到徹底滅菌的實(shí)例。如要做固體曲而沒(méi)有高溫蒸汽時(shí),可將原料用100蒸汽蒸30min,殺死其中的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞,但孢子與細(xì)菌的芽孢沒(méi)有被殺死。將蒸過(guò)的原料置于室溫下過(guò)夜,未被殺死的孢子便發(fā)芽生長(zhǎng),芽孢發(fā)育成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞,再30min便可殺死。如此連續(xù)反復(fù)進(jìn)行2-3次,亦可達(dá)到徹底滅菌的目的。從以上分析可知,滅菌過(guò)程中加熱和保溫階段的滅菌作用是主要的,而冷卻階段的滅菌作用是次要的,一般很小。此外,還應(yīng)指出的是,應(yīng)當(dāng)避免長(zhǎng)時(shí)間的加熱階段,因?yàn)榧訜釙r(shí)間過(guò)長(zhǎng),不僅破壞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),而且也有可能引起培養(yǎng)液中某些有害物質(zhì)的生成,從而影響培養(yǎng)過(guò)程的順利進(jìn)行。53問(wèn)題在實(shí)際生產(chǎn)中,如果遇到所供蒸汽不足,如何有用100℃蒸煮而達(dá)到徹底滅菌?家用土蒸鍋對(duì)食用菌三級(jí)種進(jìn)行滅菌?54(二)、培養(yǎng)基的連續(xù)滅菌將配置好的培養(yǎng)基在向發(fā)酵罐等培養(yǎng)裝置輸送的同時(shí)進(jìn)行加熱、保溫、和冷卻而進(jìn)行滅菌。連續(xù)滅菌可在短時(shí)間內(nèi)加熱到保溫的溫度,并且能很快地冷卻,因此可在比間歇滅菌更高的溫度下進(jìn)行滅菌,有利于減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的損失。培養(yǎng)基連續(xù)滅菌過(guò)程中的溫度的變化55●配料罐將培養(yǎng)基預(yù)熱60-70℃,防止培養(yǎng)基在殺菌時(shí)料液與蒸汽溫度相差過(guò)大而產(chǎn)生水汽撞擊聲?!襁B消塔(加熱塔)使培養(yǎng)基迅速(20s)升溫(126-132℃)?!窬S持罐:使培養(yǎng)基溫度保持在滅菌溫度下一段時(shí)間。2-7min.●冷卻管:將培養(yǎng)基迅速冷卻到40-50℃,輸送到滅菌后的發(fā)酵罐內(nèi)1、連消塔式滅菌流程56①、預(yù)熱可在專門的預(yù)熱罐,也可用配料罐兼作溫度:一般預(yù)熱至70℃左右預(yù)熱的物料用泵泵入連消裝置輸料泵:常用旋渦泵、往復(fù)泵、螺桿泵57旋渦泵往復(fù)泵螺桿泵58②、加熱物料泵入加熱器,培養(yǎng)基與蒸汽混合,溫度迅速上升至130~140℃常用連消裝置有三類:套管式連消器汽液混合式連消器噴射式加熱器59套管式連消塔上疏下密,45°小孔,孔徑6毫米左右培養(yǎng)液流動(dòng)線速度小于0.1m/s;在管內(nèi)逗留時(shí)間為15~20秒60
汽液混合式連消器611噴嘴2吸入口3吸入室4混合噴嘴5混合段6擴(kuò)大管噴射加熱器62③、保溫保溫設(shè)備(維持設(shè)備)保溫材料包裹兩種形式:罐式;管式63維持罐64培養(yǎng)基的平均停留時(shí)間
=V/FM---平均停留時(shí)間(s)V---維持罐的體積(m3)FM---培養(yǎng)基的流量(m3/s)65Note:
培養(yǎng)基在維持罐的流動(dòng)不可能非常均勻,可能產(chǎn)生溝流,造成一部分培養(yǎng)基在罐內(nèi)的停留時(shí)間少于平均值。為保證滅菌徹底,在設(shè)計(jì)罐式維持器時(shí),通常取平均停留時(shí)間的3~5倍。經(jīng)驗(yàn):
在滅菌溫度為130℃時(shí),實(shí)際平均時(shí)間可取10分鐘;在140℃時(shí)則可取3~4分鐘。66④、冷卻噴淋冷卻器板式冷卻器真空冷卻器67噴淋冷卻器結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單;廣泛使用68流程中采用了蒸汽噴射器,它使培養(yǎng)液與高溫蒸汽直接接觸,從而在短時(shí)間內(nèi)可將培養(yǎng)液急
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