動物細胞融合

關于動物細胞融合動物細胞融合細胞融合是正常的生命活動

受精作用兩個細胞正在融合第2頁,共28頁，2024年2月25日，星期天動物細胞融合基本過程：第3頁,共28頁，2024年2月25日，星期天誘導方法：誘導方式物理法：化學法：生物法：滅活的病毒電刺激聚乙二醇PEG第4頁,共28頁，2024年2月25日，星期天

聚乙二醇PEG具有強烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白質(zhì)的作用，能夠有效地促進植物原生質(zhì)體和動物細胞的融合。在不同種類的動物細胞混合液中加入聚乙二醇，就會發(fā)生細胞凝集作用；在稀釋和除去聚乙二醇的過程中，就會發(fā)生細胞融合。聚乙二醇誘導細胞融合的機理，目前還不太清楚。聚乙二醇是化學試劑，使用起來很方便，誘導細胞融合的頻率比較高，但是它有一定毒性，對有些細胞(如卵細胞)不適用。聚乙二醇PEG誘導融合第5頁,共28頁，2024年2月25日，星期天實驗原理：

利用PEG介導的動物細胞融合，其實驗原理到目前為止還沒有完全定論。學者們一般認為，PEG改變各類細胞的膜結構，使兩細胞相互接觸部位的膜脂雙層中磷脂分子發(fā)生疏散、進而使其結構發(fā)生重排，再加上膜脂雙層的相互親合以及彼此間表面張力的作用，引起相臨的重排質(zhì)膜，在修復時相互合并在一起,使兩細胞的胞質(zhì)溝通,從而造成相互接觸的細胞之間發(fā)生融合。第6頁,共28頁，2024年2月25日，星期天

利用PEG介導細胞融合,其融合效果受以下幾種因素的影響：PEG的分子量與濃度:

細胞融合效果與PEG的分子量及其濃度成正比；但PEG的分子量越大、濃度越高,對細胞的毒性也就越大。為了兼顧二者，在實驗時常常采用的PEG分子量一般為1000~4000，濃度一般為40~60%。第7頁,共28頁，2024年2月25日，星期天2.PEG的pH值:

經(jīng)驗證，PEG的pH值在8.0~8.2之間融合效果最好。3.PEG的處理時間:

處理時間越長，融合效果越好,但對細胞的毒害也就越大。故一般將處理時間限制在1分鐘之內(nèi)。本實驗中細胞融合后無需繼續(xù)培養(yǎng),故處理時間可適當放寬至數(shù)分鐘。第8頁,共28頁，2024年2月25日，星期天4.融合時的溫度:

由于生物膜膜的流動性與溫度成正比，故細胞的融合效果也與溫度成正比。因此，為了獲得更好的融合效果,在細胞可能承受的溫度范圍內(nèi)可適當提高處理的溫度。對于哺乳動物的細胞,一般采用的溫度為38~40℃。

而本次試驗基本在37℃的條件下進行。第9頁,共28頁，2024年2月25日，星期天實驗選材：

本次試驗選用雞的外周血做細胞融合材料,這是因為:1.雞血細胞具有細胞核，便于對融合細胞進行鑒別；2.實驗材料便宜、易得，避免了用培養(yǎng)的細胞株做細胞融合實驗材料所耗的實驗成本和精力；3.細胞融合與否，可通過觀察細胞內(nèi)核的數(shù)目來進行鑒別。若細胞內(nèi)只有一個核，定為未融合細胞；有二至多個核，定為融合細胞。第10頁,共28頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟：取新鮮雞血,制成體積分數(shù)10%雞紅細胞懸液。稱0.5gPEG(MW=4000)，熔化。盡快加入0.5ml預熱80℃的Hanks

液，制成質(zhì)量分數(shù)50%PEG，輕輕搖勻，散溫，置37℃恒溫水浴箱中備用（以防冷卻后會形成結晶）。吸取1mL

懸液置刻度離心管中,另加5mLHanks液,混勻,離心（1000r/min）5min

。第11頁,共28頁，2024年2月25日，星期天吸取0.5mlPEG加入雞紅細胞沉淀管內(nèi)，1min內(nèi)加入離心管中，邊滴邊搖晃（此過程必須在37℃水浴箱中進行）。靜置1min后，加入9mlHanks液，輕輕吹打混勻，在37℃水浴箱中放置10min。吸棄上清液，使沉淀物松散，置37℃水浴箱中維持。第12頁,共28頁，2024年2月25日，星期天離心（1000r/min）5min,吸棄上清液，加入1ml不含血清的1640培養(yǎng)液，混勻后取1滴懸液制成臨時裝片。用質(zhì)量分數(shù)為0.12%的次甲基藍染色。鏡檢。離心（1000r/min）5min,吸棄上清液，加入3ml含小牛血清的1640培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，置37℃水浴箱中溫育30min。第13頁,共28頁，2024年2月25日，星期天注意事項：1、注意PEG濃度和作用時間等，即在制備雞紅細胞沉淀物時，一定不要有殘留的液體存在，并且要在37℃水浴鍋中于15min內(nèi)全部滴完PEG，這樣融合的效果最好；2、制備50%PEG完后，需置于37℃恒溫水浴箱中備用，以防冷卻后會形成結晶；第14頁,共28頁，2024年2月25日，星期天討論：

經(jīng)過小組成員內(nèi)部討論和查閱資料，我們對細胞融合實驗的選材有了補充：我們也可以用蟾蜍血紅細胞進行這項實驗，并且蟾蜍血紅細胞也易取得。同時也可做蟾蜍血紅細胞與雞血紅細胞的融合實驗，但實驗試劑需要改變：1、Alsver液：葡萄糖2.05g，檸檬酸鈉0.8g，氯化鈉0.42g，加重蒸水至100mL即可。第15頁,共28頁，2024年2月25日，星期天4、Ringer溶液：二氯化鈉0.25g，氯化鉀0.42g,氯化鈉6.5g,溶于1000mL重蒸水中。3、GKN液：氯化鈉8g,氯化鉀0.4g,磷酸氫二鈉1.77g,磷酸二氫鈉0.69g,葡萄糖2g，酚紅0.01g,溶于1000mL重蒸水中。2、0.85%生理鹽水：0.85g氯化鈉溶于100mL重蒸水中。第16頁,共28頁，2024年2月25日，星期天5、50%PEG混合液：稱取少許PEG（Mv=4000）放入刻度離心管內(nèi)，在沸水浴中加熱，使其熔化，待冷卻至50℃時，放入預熱至50℃的等體積的GKN液，混勻。（注意使用前配置）

但從上述過程看來，實際配制過程較為繁瑣，因此，我們還是選擇雞血紅細胞進行實驗。第17頁,共28頁，2024年2月25日，星期天細胞核的分離和鑒定

實驗原理

一、分離細胞質(zhì)與細胞核

１.破碎細胞細胞破碎的方法機械法高速組織搗碎機玻璃勻漿器研缽物理法超聲勻漿器凍融法化學法自溶法酶處理表面活性劑處理法第18頁,共28頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共28頁，2024年2月25日，星期天細胞內(nèi)各種結構的比重和大小等都不相同，在同一離心場內(nèi)的沉降速度也不相同，根據(jù)這一原理，常用不同介質(zhì)和不同轉速的離心，將細胞各種組分分級分離出來(cellfractionation)。２.離心技術組織細胞勻漿分級分離分析第20頁,共28頁，2024年2月25日，星期天離心方法差速沉降離心法

速率區(qū)帶離心法等密度區(qū)帶離心法密度梯度區(qū)帶離心法

第21頁,共28頁，2024年2月25日，星期天差速離心法differentialcentrifugation原理：由低速到高速逐漸沉降將不同大小的顆粒分離。加速

低速高速

差速沉降離心法一般用于分離沉降速度相差較大（一般為10倍）的顆粒。

第22頁,共28頁，2024年2月25日，星期天二、細胞核的鑒定

本次試驗細胞選擇的是小白鼠的肝細胞，這是因為肝細胞分裂旺盛。鑒定試劑：甲苯胺藍細胞來源：第23頁,共28頁，2024年2月25日，星期天

甲苯胺藍是常用的人工合成染料的一種,屬于醌亞胺染料類,這類染料一般含有兩個發(fā)色團,一個是胺基,一個是醌型苯環(huán),來構成色原顯色。染料除有發(fā)色團外,還要有能使色原對組織及其他被染物產(chǎn)生親和力的原子團即助色。助色團能促使染料產(chǎn)生電離成鹽類,幫助發(fā)色團對組織產(chǎn)生染色力,使切片上的組織細胞著色。甲苯胺藍不僅含有兩個發(fā)色團,還含有兩個助色團,為堿性染料,因此可以和組織細胞的酸性物質(zhì)結合而使其染色。即可染細胞核使之呈藍色。另外，肥大細胞胞質(zhì)內(nèi)含有肝素和組織胺等異色性物質(zhì)遇到甲苯胺藍可呈易染性紫紅色，因此可用于肥大細胞的檢測，例如色素性蕁麻疹。

第24頁,共28頁，2024年2月25日，星期天實驗步驟：1、頸椎脫臼法處死小白鼠。迅速開腹取肝，在盛有生理鹽水的小燒杯中反復洗滌。2、稱取濕重約1g的肝組織，量取8ml預冷的勻漿緩沖液（0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化鈣溶液）并加入燒杯中，盡量剪碎肝組織。3、將剪碎的肝組織倒入勻漿器勻漿（勻漿器下段浸入盛有冰塊的小燒杯中保持低溫），搗毀組織，直至看不到明顯的組織塊。第25頁,共28頁，2024年2月25日，星期天4、勻漿徹底后，8層紗布過濾（先用少量勻漿緩沖液潤濕紗布），濾液轉移至玻璃離心管中。5、平衡離心管，離心10min(2500r/min),將上清移入另一玻璃離心管中。取上清液制一張涂片①,沉淀用殘余液體吹打均勻，制另一張涂片②，自然干燥。6、將涂片①、②染色10min，沖去染液晾干后，在顯微鏡下觀察