發(fā)酵機(jī)制及控制

關(guān)于發(fā)酵機(jī)制及控制§4-1糖的代謝與調(diào)節(jié)本節(jié)主要介紹糖代謝的幾條代謝途徑，和其調(diào)節(jié)機(jī)制，并簡(jiǎn)單介紹糖代謝厭氧發(fā)酵產(chǎn)物乙醇的發(fā)酵生產(chǎn)。第2頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、糖代謝的途徑糖代謝的主要途徑有：1、糖的酵解途徑——EMP途徑2、TCA循環(huán)3、HMP途徑（磷酸戊糖途徑）4、ED途徑第3頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、糖的酵解途徑——EMP途徑

其產(chǎn)物是：丙酮酸

丙酮酸有氧氧化生成：乙酰輔酶A

丙酮酸無(wú)氧代謝：脫羧，生成乙醛，乙醛還原生成乙醇第4頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、TCA循環(huán)

丙酮酸在有氧的條件下，在丙酮酸氧化脫羧酶系（脫氫酶）的作用下，氧化脫羧生成乙酰輔酶A（CH3-CO-SCoA）進(jìn)入TCA循環(huán)，徹底氧化成CO2和H2O?？偟姆磻?yīng)式：

C6H12O6=6CO2+6H2O+32ATP第5頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天TCA一圈，即每分子乙酰輔酶A氧化，有：

2.5ATP*3+1.5+1+2.5

總計(jì)：2*（2.5ATP*3+1.5+1+2.5）+2.5*2+2=32ATP第6頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

將葡萄糖徹底氧化成CO2和H2O，并有29分子的ATP生成

特點(diǎn)：（1）中間代謝產(chǎn)物中有，C7

、C5

、C4

有利于微生物的合成代謝。（2）只有NADP參入氧化脫氫反應(yīng)，可以產(chǎn)生大量的NADPH

（3）是一條高產(chǎn)能的氧化途徑。反應(yīng)式：C6H12O6=6CO2+6H2O+29ATP3、HMP途徑（磷酸戊糖途徑）第7頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天常見的是細(xì)菌的ED途徑，發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。反應(yīng)式：

C6H12O6=2丙酮酸+2TP+NADPH+NADH例如：在谷氨酸發(fā)酵中，菌體生長(zhǎng)期：EMP/HMP=38%GA合成期：EMP/HMP=26%4、ED途徑第8頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1.糖代謝的能荷調(diào)節(jié)

能荷=[ATP]+1/2[ADP]/[ATP]+[ADP]+[AMP]

顯然，能荷在0—1之間糖原←葡萄糖→產(chǎn)生ATP關(guān)鍵酶：G磷酸化酶磷酸果糖激酶（PFK)

異檸檬酸脫氫酶檸檬酸合成酶因此，能荷對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)是方向性的。二、糖代謝的調(diào)節(jié)機(jī)制第9頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、生物素的調(diào)節(jié)

生物素對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)與能荷的調(diào)節(jié)是不同的，后者是對(duì)糖代謝流的調(diào)節(jié)，而生物素的主要作用是對(duì)糖降解速率的調(diào)節(jié)，通常生物素能夠促進(jìn)糖的EPM途徑，對(duì)TCA循環(huán)也有促進(jìn)作用，對(duì)糖的HMP途徑也有促進(jìn)作用，但是，對(duì)上述三條途徑的促進(jìn)作用的大小卻不同，對(duì)EMP途徑的促進(jìn)作用較大……。3、磷酸鹽的調(diào)節(jié)作用三、酵母菌的酒精發(fā)酵生產(chǎn)簡(jiǎn)介第10頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天§4-2酵母菌的甘油發(fā)酵一、行業(yè)簡(jiǎn)介

1、應(yīng)用化工領(lǐng)域：環(huán)氧氯丙烷，改性醇酸樹脂、酚醛樹脂等醫(yī)藥工業(yè)：添加劑，潤(rùn)滑劑等食品工業(yè)：甜味劑、保濕劑，對(duì)風(fēng)味也有獨(dú)特的影響在造紙、皮革、玻璃、化妝品等行業(yè)：約1700多種產(chǎn)品需要。第11頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、生產(chǎn)方法：（1）天然油脂為原料：天然油脂肥皂，廢水回收甘油原煙臺(tái)第二化工廠生產(chǎn)軍用甘油，其副產(chǎn)品……（2）以丙烯為原料合成殼牌的氯化法，過(guò)乙酸法（3）發(fā)酵法甘油生產(chǎn)：厭氧發(fā)酵、好氧發(fā)酵第12頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、我國(guó)發(fā)酵甘油在技術(shù)上與國(guó)外主要存在以下差距：

（1）殘?zhí)歉撸?/p>

（2）規(guī)?；^少，……4、我國(guó)甘油市場(chǎng)的構(gòu)成與西方發(fā)達(dá)國(guó)家相比也有較大的差異：

中國(guó)：涂料，49%；醫(yī)藥食品，10%

美國(guó)：涂料，10%；醫(yī)藥食品，54%以上第13頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、甘油的厭氧發(fā)酵1、酵母菌代謝合成機(jī)制第14頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

1,6—二磷酸果糖丙酮酸葡萄糖（磷酸化，葡萄糖激酶）（磷酸果糖激酶）ATPATP3-磷酸甘油醛磷酸烯醇式丙酮酸NADH磷酸二羥丙酮NAD+NADH乙醛α-磷酸甘油NADH（甘油激酶）乙醇甘油（乙醇脫氫酶）醛縮酶第15頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、亞硫酸鹽法甘油發(fā)酵酵母菌在酒精發(fā)酵時(shí)，如加入亞硫酸氫鈉等鹽類，它能與乙醛起加成作用，生成難溶的結(jié)晶狀亞硫酸納加成物，這樣就使乙醛不能作為受氫體，而迫使磷酸二羥丙酮作為受氫體，在α-磷酸甘油脫氫酶（NAD為輔酶）催化下生成α-磷酸甘油，后者在α-磷酸甘油磷酸酯酶催化下生成α-甘油。CH2OHOH││C6H12O6+NaHSO3→CHOH+CH3-

C-OSO2Na+CO2↑

││

CH2OH

O

H第16頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、堿法甘油發(fā)酵雙分子歧化反應(yīng)乙醛+乙醛==乙醇+乙酸則，NADH沒(méi)有受體，使得菌體的代謝流轉(zhuǎn)向合成甘油的方向進(jìn)行，從而生產(chǎn)大量的甘油。第17頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

4、厭氧甘油發(fā)酵的能量和轉(zhuǎn)化率的問(wèn)題：以葡萄糖為原料的甘油的厭氧發(fā)酵，產(chǎn)率不可能突破50%的轉(zhuǎn)化率。

5、厭氧甘油發(fā)酵的缺點(diǎn)：（1）堿性條件、無(wú)能量產(chǎn)生，導(dǎo)致菌體死亡率較高，……。（2）轉(zhuǎn)化率較低。第18頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、甘油的好氧發(fā)酵在甘油發(fā)酵過(guò)程中通風(fēng)，以減少酵母細(xì)胞的死亡率；另一方面，在適當(dāng)?shù)难醯拇嬖谙?，酵母?xì)胞可以進(jìn)行有限的有氧代謝，為其自身的生長(zhǎng)提供必需的ATP。

這種有限的好氧發(fā)酵，使得丙酮酸進(jìn)行TCA循環(huán)的同時(shí)，也增加了TCA循環(huán)過(guò)程中的許多中間性產(chǎn)物，對(duì)于甘油的提取帶來(lái)了不利的影響。第19頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天§4-3檸檬酸發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控一、行業(yè)簡(jiǎn)介1.我國(guó)的檸檬酸發(fā)酵采用的菌種（黑曲霉）具有雙重功能。2.盡管采用邊糖化邊發(fā)酵的工藝，但發(fā)酵周期只有64小時(shí)。3.檸檬酸的產(chǎn)酸速度大大地高于國(guó)外水平。平均產(chǎn)酸速率是國(guó)外的2倍。第20頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

葡萄糖

丙酮酸+丙酮酸乙酰輔酶A(CH3CO-CoA)

CO2固定反應(yīng)草酰乙酸+

（檸檬酸合成酶）

檸檬酸第21頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、檸檬酸的生物合成途徑用圖示之：特點(diǎn)：順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶酶的活性喪失或非常微弱三、檸檬酸生物合成中的代謝調(diào)節(jié)與控制

1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的調(diào)節(jié)研究表明，微生物體內(nèi)的NH4+，可以解除檸檬酸對(duì)PFK的這種反饋抑制作用，在較高的NH4+的濃度下，細(xì)胞可以大量形成檸檬酸，那么NH4+濃度是如何升高的呢？第22頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

Mn2+

缺乏如何會(huì)使NH4+濃度升高呢？外源氮源分解產(chǎn)生氨基酸 菌體生長(zhǎng)合成蛋白質(zhì)）氨基化合成氨基酸（消耗NH4+）第23頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.順烏頭酸酶活性的控制該酶的喪失或失活是阻斷TCA循環(huán)，大量生成檸檬酸的必要條件。通常檸檬酸產(chǎn)生菌體內(nèi)該酶的活性本身就要求很弱，但在發(fā)酵過(guò)程中仍需要控制它的活性。由于該酶的活性受到Fe2+的影響，控制培養(yǎng)基中的Fe2+的濃度，可以使該酶失活。但是在檸檬酸發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基中的Fe2+的濃度有要求不能夠低于0.1mg/L，原因目前尚沒(méi)有搞清楚。第24頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.能荷調(diào)節(jié)對(duì)檸檬酸發(fā)酵的影響側(cè)系呼吸鏈：NAD(P)H經(jīng)過(guò)該呼吸鏈，可以正常的傳遞H+，將其氧化為H2O，但是并沒(méi)有氧化磷酸化生成ATP，能夠正常產(chǎn)生ATP的呼吸鏈稱之為標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈。只長(zhǎng)菌不產(chǎn)酸：第25頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、檸檬酸發(fā)酵的產(chǎn)率

1.無(wú)CO2固定反應(yīng)的產(chǎn)率

192/(180*1.5)==71.1%2.通過(guò)CO2固定反應(yīng)提供C4二羧酸

192/180==106.6%C6H12O6C6H8O7(C沒(méi)有增加)

可見，CO2固定反應(yīng)堆與檸檬酸發(fā)酵的重要性。第26頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

在檸檬酸產(chǎn)生菌內(nèi)，存在下列CO2固定反應(yīng)

1）磷酸烯醇式丙酮酸+CO2==草酰乙酸（C4二羧酸）酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（2）丙酮酸+CO2===草酰乙酸（C4二羧酸）酶：丙酮酸羧化酶以上兩種CO2固定反應(yīng)所需要的輔酶都是生物素。第27頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天在檸檬酸發(fā)酵過(guò)程中，存在三個(gè)控制要點(diǎn)：（1）點(diǎn)：EMP暢通無(wú)阻控制Mn2+NH4+濃度升高，解除檸檬酸對(duì)PFK的抑制；防止側(cè)系呼吸鏈?zhǔn)Щ?。?）點(diǎn)：通過(guò)CO2固定反應(yīng)生成C4二羧酸，強(qiáng)化這一反應(yīng)的方法和意義？…………（生物素、錳離子、鎂離子、罐壓等）（3）點(diǎn)：檸檬酸后述的酶的酶活性喪失或很低：方法：控制培養(yǎng)基中的Fe2+的濃度第28頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、檸檬酸產(chǎn)生菌的育種

1.透明圈大的菌株平板：10%甘薯+2%的瓊脂+0.5%CaCO3

誘變后，涂布，透明圈大的則好，為何？淀粉的水解能力。2.顯色圈大小平板：麥汁培養(yǎng)基+pH值指示劑誘變后，33℃培養(yǎng)3天，顯色圈大的則好。

第29頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天3.不分解檸檬酸的菌株不利用檸檬酸為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)的菌株，說(shuō)明其TCA循環(huán)中檸檬酸后述的酶的活性較低，或者喪失，這有利于檸檬酸的積累。方法：以檸檬酸為唯一的碳源的培養(yǎng)基上，選擇生長(zhǎng)不好的突變株。4.選育不長(zhǎng)孢子、少長(zhǎng)孢子、遲長(zhǎng)孢子的菌株在培養(yǎng)基中如果菌株能夠大量合成積累檸檬酸，自然會(huì)使TCA循環(huán)中的中間產(chǎn)物濃度降低，這樣不利于孢子的形成。第30頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天§4-4GA的生物合成機(jī)制與代謝調(diào)節(jié)一、GA的生物合成途徑二、GA生物合成的內(nèi)在因素三、GA生物合成的最理想途徑與轉(zhuǎn)化率四、生物素在GA發(fā)酵中的作用五、細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)六、GA發(fā)酵的外在因素七、GA發(fā)酵生產(chǎn)中的異?，F(xiàn)象及其處理第31頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、GA的生物合成途徑（1）EMP:丙酮酸，ATP,NADH（2）HMP:6－磷酸果糖

3－磷酸甘油酸

NADPH:

－酮戊二酸還原氨基化必需的供氫體。（3）TCA循環(huán):生成谷氨酸前體物質(zhì)－酮戊二酸。（4）CO2固定反應(yīng):補(bǔ)充草酰乙酸。（5）乙醛酸循環(huán):使琥鉑酸、延胡索酸和蘋果酸的量得到補(bǔ)充，維持TCA循環(huán)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

谷氨酸脫氫酶（6）還原氨基化反應(yīng):－酮戊二酸─────→谷氨酸第32頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天第33頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天葡萄糖中間產(chǎn)物a－酮戊二酸谷氨

酸谷氨酸脫氫酶NH4＋抑制谷氨酸的生物合成模式第34頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、GA生物合成的內(nèi)在因素--產(chǎn)生菌的生化特點(diǎn)1、α—KGA脫氫酶酶活性微弱或喪失2、GA產(chǎn)生菌體內(nèi)的NADPH的在氧化能力欠缺或喪失3、產(chǎn)生菌體內(nèi)必須有乙醛酸循環(huán)（DCA）的關(guān)鍵酶——異檸檬酸裂解酶。4、菌體有強(qiáng)烈的L—谷氨酸脫氫酶活性

α-KGA+NH4++NADPH→GA+NADP反應(yīng)機(jī)制如下：第35頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

異檸檬酸α—KGANADPHNADPα—KGAGA第36頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、GA生物合成的最理想途徑與轉(zhuǎn)化率1、在前述GA合成所必需的條件的基礎(chǔ)上（……，封閉乙醛酸循環(huán)）體系不存在CO2固定反應(yīng)，則有：則有：

3/2C6H12O6+NH4+→C5H9O4+4CO2

（來(lái)自何方？）產(chǎn)率：147/（180*3/2）=54.4%第37頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天3/2Glucose丙酮酸丙酮酸丙酮酸++++乙酰輔酶A乙酰輔酶ACO2乙酰輔酶A檸檬酸（DCA循環(huán)封閉）

谷氨酸第38頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

2、在前述GA合成所必需的條件的基礎(chǔ)上（封閉乙醛酸循環(huán)），存在CO2固定反應(yīng)，則有：

C6H12O6+NH4+→C5H9O4+CO2

（來(lái)自何方？）產(chǎn)率：147/180=81.7%第39頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天Glucose丙酮酸丙酮酸++C4二羧酸CO2乙酰輔酶A檸檬酸（DCA循環(huán)封閉）

谷氨酸CO2第40頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天在GA產(chǎn)生菌菌體內(nèi)CO2固定反應(yīng)有以下兩條途徑：（1）磷酸丙酮酸羧化酶的作用下

磷酸丙酮酸+CO2+GTP→草酰乙酸+GDP

(2)蘋果酸合成酶的作用下

丙酮酸+CO2+NADH→蘋果酸+NAD上述反應(yīng)需要Mg2+、Mn+做催化劑，所以，在GA發(fā)酵過(guò)程中需要向培養(yǎng)基中補(bǔ)充Mn+第41頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、生物素在GA發(fā)酵中的作用1、生物素對(duì)發(fā)酵液pH值的影響

2、乙醛酸循環(huán)的封閉

DCA循環(huán)的關(guān)鍵酶是異檸檬酸裂解酶，研究表明，該酶受以下幾個(gè)因素的影響：為醋酸誘導(dǎo)受琥珀酸的阻遏，其活性受琥珀酸的抑制第42頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天當(dāng)VH缺乏時(shí)：（1）丙酮酸的有氧氧化就會(huì)減弱(由于VH對(duì)TCA循環(huán)的促進(jìn)作用)，則：乙酰輔酶A的生成量就會(huì)少，醋酸濃度降低，它的誘導(dǎo)作用降低；（2）VH對(duì)TCA循環(huán)的促進(jìn)作用的降低，使得其中間產(chǎn)物琥珀酸的氧化速度降低，其濃度得到積累，這樣它的阻遏和抑制作用加強(qiáng)；兩者綜合的作用使得，異檸檬酸裂解酶的活性喪失，DCA循環(huán)得到封閉。第43頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、生物素對(duì)菌體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用一方面提供了大量的“中間性產(chǎn)物”——菌體增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)另一方面，菌體的能和水平得到提高?！w增殖的能量的保證

以上分析說(shuō)明，GA發(fā)酵過(guò)程中，前期，菌體的增殖期，一定的量的生物素是菌體增殖所必需的；而在產(chǎn)物合成期，則要限制生物素的濃度，以保證產(chǎn)物的正常合成。第44頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天五、菌體細(xì)胞膜滲透性的調(diào)節(jié)與控制意義：細(xì)胞膜滲透性的調(diào)節(jié)對(duì)于GA發(fā)酵時(shí)非常重要的，正如前述，當(dāng)菌體進(jìn)入產(chǎn)物合成期時(shí)，開始有GA的產(chǎn)生，這是如果能夠大量的把產(chǎn)物及時(shí)的排泄到細(xì)胞膜外，可以解除GA對(duì)L—谷氨酸脫氫酶活性的抑制作用，從而實(shí)現(xiàn)由Glucose→GA的高效率轉(zhuǎn)化；反之，如果……第45頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

控制細(xì)胞膜的滲透性的途徑(1)通過(guò)生理學(xué)手段控制細(xì)胞膜滲透性(2)通過(guò)細(xì)胞膜缺損突變控制細(xì)胞膜滲透性生物素谷氨酸細(xì)胞膜滲透性青霉素谷氨酸油酸缺陷型油酸第46頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、VH對(duì)菌體細(xì)胞膜滲透性的影響葡萄糖丙二酰輔酶A丙酮酸丙酮酸++CO2乙酰輔酶AC4CO2乙酰輔酶A乙酰輔酶A羧化酶CO2C6丙二酰輔酶A第47頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

脂肪酸＋甘油磷酸磷脂＋蛋白質(zhì)生物膜因此，脂肪酸是組成細(xì)胞膜類脂的必要成分。生物素限量，不利于脂肪酸的合成，有利于谷氨酸透過(guò)細(xì)胞膜分泌至體外。第48頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

其中，將乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A的酶是乙酰輔酶A羧化酶，該酶的輔酶是VH，VH在此反應(yīng)過(guò)程中起到傳遞CO2的作用。當(dāng)培養(yǎng)基中VH的濃度較低時(shí)，細(xì)胞膜的合成就會(huì)受影響。

92%培養(yǎng)基中生物素限量時(shí)，胞內(nèi)AA──→胞外

12%培養(yǎng)基中生物素豐富時(shí)，胞內(nèi)AA──→胞外第49頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、使之合成不完整的細(xì)胞膜，造成膜的缺損，提高細(xì)胞膜的滲透性

甘油、油酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選育3、青霉素的使用

抑制肽聚糖合成中的轉(zhuǎn)肽酶的活性，引起肽聚糖結(jié)構(gòu)中肽橋無(wú)法交聯(lián)，造成細(xì)胞壁缺損，在膨脹壓的作用下代謝物外滲，從而提高細(xì)胞膜的滲透性4、表面活性劑等第50頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天六、GA發(fā)酵的外在因素1、培養(yǎng)基成分：主要是玉米漿

2、供氧濃度

過(guò)量：

NADPH的再氧化能力會(huì)加強(qiáng)，使α—KGA的還原氨基化受到影響，不利于GA的生成。供氧不足：

積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于GA的產(chǎn)生，同時(shí)，一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸，影響了糖酸轉(zhuǎn)化率，降低了產(chǎn)物的提出率。第51頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

3、NH4+濃度

（1）影響到發(fā)酵液的pH值（2）與產(chǎn)物的形成有關(guān)：過(guò)低，不利于α—KGA的還原氨基化;過(guò)高，產(chǎn)生谷氨酰胺（在谷氨酰胺合成酶的作用下，谷氨酰胺的缺點(diǎn)？）

NH4+的供給方式：（1）液氨（2）流加尿素，條件和優(yōu)缺點(diǎn)？副反應(yīng)：第52頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、磷酸鹽不足：……過(guò)量：（1）促進(jìn)EMP途徑，打破EMP與TCA之間的平衡，積累丙酮酸，產(chǎn)生乳酸等……

（2）產(chǎn)生并積累Val。帶來(lái)的問(wèn)題是：（1）可以抑制葡萄糖→丙酮酸，進(jìn)而使GA的生物合成受到阻止（2）消耗了丙酮酸，降低了糖酸轉(zhuǎn)化率（3）發(fā)酵液中的Val存在，嚴(yán)重的影響GA的結(jié)晶、提出。第53頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天焦磷酸硫胺素（TPP）葡萄糖活性乙醛丙酮酸丙酮酸+Valα—乙酰乳酸第54頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、金屬離子（1）Mg2+

（2）Mn2+第55頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天七、GA發(fā)酵生產(chǎn)中的異?，F(xiàn)象及其處理1、發(fā)酵前期pH值過(guò)高危害：影響因素：（1）耗糖速度過(guò)慢，就是糖的代謝速度過(guò)慢。（2）初脲量大、菌種脲酶活力高導(dǎo)致銨離子濃度高（3）前期感染phqge（4）培養(yǎng)基中缺乏磷酸鹽等。第56頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天處理方法：（1）耗糖速度慢，通過(guò)測(cè)定糖的含量確定，可以強(qiáng)化通風(fēng)、適當(dāng)添加生物素等。（2）初脲量大，停止通風(fēng)，或者小通風(fēng)，以使尿素緩慢釋放銨離子。（3）感染phqge，（4）缺乏磷酸鹽……第57頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天2、初期pH值偏低（1）初脲添加量不夠，提前酌情流加尿素。（2）跑尿：（3）培養(yǎng)基中的磷酸鹽過(guò)高，代謝平衡被打破，酸性產(chǎn)物的積累（4）供氧不足第58頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、接種后菌體生長(zhǎng)不良、OD值偏低、耗糖速度緩慢危害：發(fā)酵周期長(zhǎng)、菌體活力低、糖酸轉(zhuǎn)化率偏低（1）可能感染phage（2）培養(yǎng)基存在問(wèn)題：缺乏生物素缺乏磷酸鹽存在抑制性物質(zhì)：淀粉水解產(chǎn)生的抑制性物質(zhì)：培養(yǎng)基滅菌產(chǎn)生的第59頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天（3）通風(fēng)量過(guò)大，溶氧水平高。使得菌體耗糖速度降低。（能荷的問(wèn)題）（4）種子不良，種子衰老；接種溫度過(guò)高，導(dǎo)致菌體被燙死。（5）前期通風(fēng)較少，pH值偏低，代謝產(chǎn)物積累較多的酸性物質(zhì)，不利于菌體的生長(zhǎng)。第60頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、中后期，OD值繼續(xù)升高，好糖快，但是產(chǎn)酸很低危害：生生產(chǎn)上說(shuō)的：只長(zhǎng)菌、不產(chǎn)酸產(chǎn)生原因：（1）生物素濃度過(guò)高（2）可能是感染了雜菌鏡檢初步判斷是否感染了雜菌第61頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天5、發(fā)酵中后期pH值低，耗糖快，但是產(chǎn)酸低或者不產(chǎn)酸（1）可能是感染了雜菌，上述情況。（2）供氧不足，導(dǎo)致酸性產(chǎn)物的積累（3）生物素濃度過(guò)高、磷酸鹽濃度過(guò)高，導(dǎo)致OD值增長(zhǎng)太快，這些都是菌體大量增殖的有利條件。處理方法：大量的通風(fēng)、提前流加尿素，迅速提升發(fā)酵液的pH值。第62頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天6、發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液泡沫太多危害：……（1）淀粉質(zhì)量差、雜質(zhì)多，蛋白質(zhì)含量高（2）糖化不完全，糖化液中含有糊精（3）糖化工藝不合理，復(fù)合物形成過(guò)多（4）可能是感染雜菌（5）泡敵選擇不理想第63頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天7、發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)酸后，GA又下降危害：……原因：（1）pH值過(guò)高，谷氨酰胺合成酶活性加強(qiáng)，使得GA+NH4+

谷氨酰胺（2）感染雜菌：？8、谷氨酸濃度急劇的增加危害：感染了phage第64頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天§4-5Lys的生物合成機(jī)制與代謝調(diào)節(jié)一、行業(yè)簡(jiǎn)介我國(guó)的Lys生產(chǎn)與國(guó)外的差距主要表現(xiàn)在：（1）菌種性能的差異，Lys是菌體代謝過(guò)程中的中間性產(chǎn)物，但不是主鏈上的產(chǎn)物，其生成機(jī)制很復(fù)雜，對(duì)菌種的要求很高，國(guó)內(nèi)菌種的產(chǎn)酸水平為：35—55g/L，轉(zhuǎn)化率為：20—25%。遠(yuǎn)低于國(guó)外的生產(chǎn)水平。（2）提出率較低。（3）生產(chǎn)規(guī)模較小。第65頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、賴氨酸的生物合成機(jī)制細(xì)菌類發(fā)酵與酵母菌發(fā)酵的比較：

優(yōu)點(diǎn)：（1）菌體體積較小，相對(duì)增殖所用的底物較少，產(chǎn)率高。（2）細(xì)菌的繁殖速度快，在合適的生長(zhǎng)條件下，其繁殖速度只有幾分鐘，而酵母的增殖速度最少在一個(gè)小時(shí)以上，這就為細(xì)菌發(fā)酵縮短發(fā)酵周期創(chuàng)造了條件。（3）細(xì)菌的細(xì)胞膜的通透性易于調(diào)節(jié)，對(duì)于胞外產(chǎn)品，可以通過(guò)其細(xì)胞膜的通透性控制來(lái)促進(jìn)產(chǎn)物的分泌，例如，GA的發(fā)酵；對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，其細(xì)胞壁比酵母的細(xì)胞壁易于破碎。第66頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天缺點(diǎn)：（1）細(xì)菌菌體較小，當(dāng)需要從發(fā)酵液中把菌體分離出來(lái)（有利于產(chǎn)物的結(jié)晶提出，或產(chǎn)物就是菌體或菌體內(nèi)的胞內(nèi)物），細(xì)菌比酵母菌難以分離。（2）細(xì)菌發(fā)酵過(guò)程中的無(wú)菌程度要求非常嚴(yán)格，發(fā)酵過(guò)程中大部分的細(xì)菌對(duì)于溶氧的要求也很高，這就增加了細(xì)菌發(fā)酵的生產(chǎn)成本。（3）細(xì)菌發(fā)酵易感染噬菌體，……第67頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天1、大腸桿菌中的Lys的生物合成與代謝調(diào)控大腸桿菌賴氨酸代謝特點(diǎn)：關(guān)鍵酶：處于分枝代謝的分支點(diǎn)上，對(duì)于整個(gè)反應(yīng)起到限速作用的，酶活性往往受到后續(xù)產(chǎn)物的反饋抑制的酶。對(duì)于賴氨酸的上述代謝途徑，天冬氨酸激酶則是一個(gè)關(guān)鍵酶。第68頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

二羥吡啶羧酸天冬氨酸磷酸（asp-p）琥珀酰高絲氨酸LysEMPGlucose丙酮酸草酰乙酸Asp天冬氨酸β-半醛（同功酶）(天冬氨酸激酶AK，同功酶)高絲氨酸（Hos）O-磷酸高絲氨酸ThrMet第69頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天同功酶：催化同一反應(yīng)，但其活性受不同代謝產(chǎn)物體調(diào)節(jié)的酶，這種酶往往有多個(gè)不同的活性中心。上述代謝途徑中，天冬氨酸激酶是一個(gè)同功酶，分別受三個(gè)代謝產(chǎn)物的抑制，這三個(gè)終產(chǎn)物分別是：Lys、Met和Thr，只有當(dāng)這三個(gè)代謝產(chǎn)物同時(shí)過(guò)量時(shí)，Asp激酶的活性才能完全被抑制。

第70頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天根據(jù)上述代謝特點(diǎn)，要使菌體合成并積累Lys，可以選育Hos-：（1）既可以解除β—天冬氨酸的代謝支路，使代謝流向Lys的方向進(jìn)行，提高了從底物葡萄糖到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率；（2）更重要的是由于Hos-，使得代謝過(guò)程中不可能產(chǎn)生過(guò)量的Met、Thr，盡管產(chǎn)生了大量的Lys，Lys可以抑制關(guān)鍵酶——天冬氨酸激酶1，但是天冬氨酸激酶2、3的活性由于Met、Thr的限量，并沒(méi)有受到抑制，也就是說(shuō)，天冬氨酸β—半醛，仍可以大量的生成，這就保證了Lys的生物合成途徑的暢通無(wú)阻。第71頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.黃色短桿菌Lys生物合成的調(diào)控兩者代謝區(qū)別：（1）在黃色短桿菌中，天冬氨酸激酶（AK）仍然是一個(gè)關(guān)鍵酶，但是該酶是一個(gè)變構(gòu)酶，有兩個(gè)活性中心，分別受Lys、Thr的協(xié)同反饋抑制，

協(xié)同反饋抑制：該酶往往有多個(gè)活性中心，抑制物可以分別和某一個(gè)特定的活性中心結(jié)合，但是并不影響該酶的活性，只有當(dāng)該酶的所有的活性中心都被抑制物結(jié)合后，其酶活性才會(huì)受到完全抑制。（2）黃色短桿菌中，存在兩個(gè)分支點(diǎn)的優(yōu)先合成機(jī)制

第72頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天

天冬氨酸磷酸（asp-p）琥珀酰高絲氨酸LysEMPGlucose丙酮酸草酰乙酸Asp天冬氨酸β-半醛（優(yōu)先合成）(天冬氨酸激酶，AK)高絲氨酸（Hos）二羥吡啶羧酸O-磷酸高絲氨酸ThrMet第73頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天阻遏：當(dāng)代謝產(chǎn)物過(guò)量時(shí)，能夠?qū)υ撁傅纳锖铣善鸬椒忾]作用，使得該酶的合成受阻。黃色短桿菌生產(chǎn)Lys，選育Hos-，其意義在于：（1）解除了Hos的優(yōu)先合成機(jī)制，阻斷了代謝向Met、Thr的方向進(jìn)行，節(jié)省了原料，可以使Asp-β-半醛這個(gè)中間代謝產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)入Lys的生物合成上。（2）在培養(yǎng)基中限量的供給Met、Thr（或者Hos）對(duì)于AK酶活性的調(diào)節(jié)有著重要意義。因?yàn)锳K酶是一個(gè)協(xié)同反饋抑制的變構(gòu)酶，限制了其中某一個(gè)抑制物（Thr），則Lys的濃度再高，也不會(huì)影響到AK酶的活性，那么，代謝一直向著賴氨酸合成的方向進(jìn)行，使得產(chǎn)物的合成暢通無(wú)阻。

第74頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天脫敏：使該酶具有抗反饋抑制或阻遏的能力，從而解除代謝產(chǎn)物對(duì)該酶的反饋抑制或者阻遏作用。如何使其脫敏呢？

通常可以采用抗性突變株：

選育結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株？（X

r）

(1)S-L-半胱氨酸抗性突變株AECr(2)γ-甲基賴氨酸抗性突變株MLr（3）L-賴氨酸氧肟酸鹽抗性突變株LysHxr（4）蘇氨酸氧肟酸鹽抗性突變株ThrHxr第75頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天§4-6次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成機(jī)制與代謝調(diào)節(jié)一、基本概念

1、初級(jí)代謝：是指微生物合成它們生長(zhǎng)所必需的物質(zhì)的諸如：糖、氨基酸等以及由這些化合物形成的高分子物質(zhì)如：多糖、蛋白質(zhì)、核酸等的代謝，稱之為初級(jí)代謝。那么，這些化合物統(tǒng)稱之為：初級(jí)代謝產(chǎn)物。

2、次級(jí)代謝：是指微生物在生長(zhǎng)后期進(jìn)行的與他們的生長(zhǎng)無(wú)明顯關(guān)系的代謝，這一類的物質(zhì)統(tǒng)稱之為：次級(jí)代謝產(chǎn)物。例如：抗生素、激素、某些酶制劑等。第76頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天3、分叉中間體從下圖可以看出，許多物質(zhì)處于代謝的分叉點(diǎn)上，例如：CH3CO-SCoA，是葡萄糖糖經(jīng)HMP、EMP生成的中間物質(zhì)，經(jīng)羧化后可形成丙二酰輔酶A，丙二酰輔酶A可用于脂肪酸的合成上，進(jìn)而又可經(jīng)多次重復(fù)縮合、環(huán)化等形成四環(huán)類或其他抗菌素等次級(jí)代謝產(chǎn)物，而CH3COSCoA又可以進(jìn)入TCA循環(huán)。這類物質(zhì)稱之為：分叉中間體。如：丙酮酸、乙酰輔酶A、草酰乙酸等這些個(gè)分叉中間體把微生物的次級(jí)代謝和初級(jí)代謝緊密地聯(lián)系起來(lái)第77頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天Met次級(jí)代謝產(chǎn)物GlucoseC3絲氨酸甘氨酸丙酮酸ValTCA循環(huán)莽草酸芳香族氨基酸芳香類次級(jí)代謝產(chǎn)物丙二酰輔酶A乙酰輔酶A脂肪酸次級(jí)代謝產(chǎn)物草酰乙酸、α-KGA谷氨酸天冬氨酸第78頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天4、發(fā)酵逆轉(zhuǎn)的概念：

發(fā)酵中期當(dāng)微生物群體進(jìn)入產(chǎn)物合成期時(shí)，如果向發(fā)酵液中流加氮源或者改變……，使微生物群體返回到生長(zhǎng)期而停止產(chǎn)物的合成，這種現(xiàn)象稱之為發(fā)酵逆轉(zhuǎn)，在次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵過(guò)程中是非常普遍的。具體例子：耐高溫α—淀粉酶發(fā)酵中，流加：G、GA，停電等第79頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天4-7微生物代謝產(chǎn)物的過(guò)量生產(chǎn)一、提高初級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法

1.使用誘導(dǎo)物

對(duì)于許多酶類的發(fā)酵，特別是淀粉、蛋白質(zhì)的水解酶，其大部分是誘導(dǎo)酶，(意義？)

對(duì)于這一類的酶類的發(fā)酵，向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)物，可以促進(jìn)酶的合成與分泌，有利于提高產(chǎn)量。第80頁(yè),共90頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.選育組成型突變株誘導(dǎo)機(jī)制：目前最清楚的是大腸桿菌的乳糖操縱子：無(wú)誘導(dǎo)物