基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定

關(guān)于基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定一、粘性末端的連接DNA連接酶把相互靠近的5’端磷酸與3’-OH連到一起單酶切、雙酶切第一節(jié)DNA的體外重組DNA的體外重組：將目的基因與載體連接，這種重新組合的DNA稱為重組DNA。第2頁,共27頁，2024年2月25日，星期天（一）直接連接T4DNA連接酶雖然能連接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1~10%。5’5’5’5’3’3’3’3’-OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’3’-OH-PP-HO-5’3’二、平末端（bluntend）的連接第3頁,共27頁，2024年2月25日，星期天（1）同聚加尾法（二）人工加尾形成“粘性末端”DNA末端轉(zhuǎn)移酶能在沒有模板的情況下給DNA的3’-OH端加上脫氧核苷酸。①原理：分別給載體和插入片斷加上互補的核苷酸。②加尾－堿基互補第4頁,共27頁，2024年2月25日，星期天④缺點：③優(yōu)點：能把任何片段連接起來操作繁瑣；外源片段難以回收；同聚物尾巴影響外源基因表達。非酶切位點第5頁,共27頁，2024年2月25日，星期天（2）銜接物（linker）連接Linker：用化學(xué)合成法合成的一段10-12bp的，具有一個或數(shù)個限制性內(nèi)切酶識別位點的平末端雙鏈寡核苷酸GGAATTCCCCTTAAGGEcoRIlinker：（二）人工加尾形成“粘性末端”第6頁,共27頁，2024年2月25日，星期天（1）多核苷酸激酶處理（2）T4連接酶連接（3）限制性內(nèi)切酶消化（4）目的片段與載體連接第7頁,共27頁，2024年2月25日，星期天（二）人工加尾形成“粘性末端”（3）DNA接頭（adapter）連接法①adapter一頭平末端、另一頭粘性末端（某種酶切位點序列）Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-OH3’3’HO-GGCC-p5’BamHIadapterP--P5‘p-GATCCCGG-GGCC--CCGG-GGCCCTAG-P5’第8頁,共27頁，2024年2月25日，星期天接頭與接頭以粘末端連接，影響與DNA片段的連接②優(yōu)點：連上后就能用。③缺點：先用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理接頭，水解掉其5’端的磷酸，防止自我連接。④防止自我連接5‘p-GATCCCGG-

GGCC-CCGGGGCCCTAG-p5’第9頁,共27頁，2024年2月25日，星期天Blunt-endedDNA5’p-GATCCCGG-3’

GGCC-p5’BamHIadapterP--P

5’HO-GATCCCGG-GGCC

CCGG-GGCCCTAG-OH5’5’HO-GATCCCGG3’GGCC-OH5’nick缺口nick缺口HO--OHCIP處理T4ligase雖然有缺口，但仍然能與DNA片斷連接T4多核苷酸激酶處理使5’磷酸化第10頁,共27頁，2024年2月25日，星期天三、PCR產(chǎn)物的連接1.在引物的5’端設(shè)計酶切位點符合載體的多克隆位點；（1）設(shè)計原則（2）帶酶切位點的引物的結(jié)構(gòu)3’端15～20bp與模板互補；5’端內(nèi)切酶識別序列＋保護堿基避免與所擴增的DNA片斷內(nèi)部酶切位點重復(fù)。第11頁,共27頁，2024年2月25日，星期天帶酶切位點的PCR產(chǎn)物GCAGAATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’CCTAGGCGC

PCR產(chǎn)物-5’3’-CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoRI位點BamHI位點AATTC

PCR產(chǎn)物5’--3’CCTAG

PCR產(chǎn)物-5’3’-GGEcoRIBamHI兩頭各有一個粘性末端！第12頁,共27頁，2024年2月25日，星期天AAdNTPTTdTTPTaqDNA聚合酶載體PCR產(chǎn)物TATA三、PCR產(chǎn)物的連接2.與T載體直接連接第13頁,共27頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)重組體導(dǎo)入受體細胞一、重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌（一）轉(zhuǎn)化（transformation）大腸桿菌捕獲質(zhì)粒DNA的過程。（三）轉(zhuǎn)染（transfection）受體菌直接捕獲噬菌體DNA的過程。（二）轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）借助噬菌體把外源DNA導(dǎo)入細菌的過程。第14頁,共27頁，2024年2月25日，星期天二、重組DNA導(dǎo)入真核細胞（一）導(dǎo)入酵母細胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化堿金屬離子介導(dǎo)的完整細胞轉(zhuǎn)化PEG1000轉(zhuǎn)化法電擊法（二）導(dǎo)入植物細胞（三）導(dǎo)入動物細胞第15頁,共27頁，2024年2月25日，星期天1.利用原生質(zhì)體進行轉(zhuǎn)化

酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2

PEG插入外源基因的載體共轉(zhuǎn)化：將兩個以上的基因同時導(dǎo)入感受態(tài)細胞的方法轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化細胞達原生質(zhì)體總數(shù)的1%~2%，轉(zhuǎn)化率受再生率影響共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的25%~33%第16頁,共27頁，2024年2月25日，星期天

酵母0.1mol/LLiCl處理感受態(tài)2.堿金屬離子介導(dǎo)的完整細胞轉(zhuǎn)化插入外源基因的載體40%PEG4000熱激涂布選擇性平板，篩選轉(zhuǎn)化子

吸收線性DNA能力明顯大于環(huán)狀DNA，兩者相差80倍轉(zhuǎn)化率：103個

/

g

DNA；共轉(zhuǎn)化現(xiàn)象極少第17頁,共27頁，2024年2月25日，星期天4.電擊轉(zhuǎn)化（1）適于原生質(zhì)體和完整細胞（2）轉(zhuǎn)化率高，105個/

gDNA（3）單鏈轉(zhuǎn)化率高于雙鏈單鏈含有酵母復(fù)制子可轉(zhuǎn)化為雙鏈并復(fù)制，無復(fù)制子可同源整合到受體菌染色體上缺點：需要特定儀器，成本較高3.PEG1000轉(zhuǎn)化PEG處理酵母細胞，可獲得類感受態(tài)，用于轉(zhuǎn)化第18頁,共27頁，2024年2月25日，星期天二、重組DNA導(dǎo)入真核細胞（一）導(dǎo)入酵母細胞載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（農(nóng)桿菌介導(dǎo)）DNA直接導(dǎo)入（基因搶法、電擊法等）種質(zhì)系統(tǒng)法（花粉管通道法等）（二）導(dǎo)入植物細胞（三）導(dǎo)入動物細胞第19頁,共27頁，2024年2月25日，星期天（二）導(dǎo)入植物細胞1.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法將目的基因插入到載體的T-DNA區(qū)，形成重組DNA將重組DNA轉(zhuǎn)入含有Vir致病基因的農(nóng)桿菌通過農(nóng)桿菌侵染植物外植體將含有外源目的基因的T-DNA整合到植物細胞基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因植株第20頁,共27頁，2024年2月25日，星期天在飼養(yǎng)平皿的濾紙上培養(yǎng)2天葉盤法的具體操作第21頁,共27頁，2024年2月25日，星期天又稱生物彈擊法、微彈轟擊法，借助高速金屬微粒將DNA分子引入活細胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)。DNA1.2

m鎢彈頭吸附金屬微粒加速，進入受體細胞基因槍裝入2.基因槍法（genegun）

外植體制備轟擊外植體培養(yǎng)及選擇第22頁,共27頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共27頁，2024年2月25日，星期天具體操作1.DNA微彈的制備2.外植體的制備3.DNA微彈轟擊4.外植體的培養(yǎng)第24頁,共27頁，2024年2月25日，星期天植物細胞原生質(zhì)體纖維素酶和果膠酶DNA混合入電擊緩沖液電擊處理愈傷組織幼苗分化3.電擊法（電穿孔法）選擇培養(yǎng)第25頁,共