短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備技術(shù)的制作方法

短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備技術(shù)的制作方法專利名稱：短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備技術(shù)的制作方法技術(shù)領(lǐng)域：本發(fā)明屬于基因工程，具體地說涉及一種短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備技術(shù)，該技術(shù)可應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)、遺傳學(xué)和腫瘤學(xué)等領(lǐng)域的個(gè)體識(shí)別、親權(quán)鑒定以及遺傳和腫瘤病的診斷等方面。人類基因組DNA有3×109bp，其中10％是串聯(lián)重復(fù)序列，被稱為衛(wèi)星DNA。按重復(fù)單位的長(zhǎng)短，又可分為大衛(wèi)星、中衛(wèi)星、小衛(wèi)星和微衛(wèi)星。其中重復(fù)單位僅由2-7bp組成的叫微衛(wèi)星，所以又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(Shorttandemrepeat，SIR)。不同人體基因組的衛(wèi)星DNA重復(fù)單位的數(shù)目是可變的，因此形成了極其復(fù)雜的等位基因片段長(zhǎng)度多態(tài)性。根據(jù)這一規(guī)律，近幾年在法醫(yī)學(xué)、考古學(xué)、遺傳學(xué)和腫瘤學(xué)等領(lǐng)域建立了一種嶄新的對(duì)人體進(jìn)行個(gè)體識(shí)別、親權(quán)鑒定以及對(duì)遺傳和腫瘤病進(jìn)行診斷的STR-PCR(短串聯(lián)重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng))技術(shù)，從而給這些領(lǐng)域的發(fā)展帶來了新的革命性變化。在這一技術(shù)中，為了準(zhǔn)確地給各等位基因進(jìn)行定位和識(shí)別，必須設(shè)置與各等位基因相對(duì)應(yīng)的等位基因階梯(AlleleLadder)為標(biāo)準(zhǔn)參照物(Markers)。因等位基因階梯中的每一基因片段的長(zhǎng)度均是已知的，將它與各待測(cè)樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物在相同電泳條件下的相鄰泳道上進(jìn)行電泳分離，染色后進(jìn)行對(duì)比，就很容易判斷待測(cè)樣品的基因型，所以，等位基因階梯在STR-PCR的結(jié)果判斷中至關(guān)重要。目前國(guó)內(nèi)制備各STR位點(diǎn)等位基因階梯的方法有兩種一種是從人基因組的每個(gè)位點(diǎn)上篩選能代表各等位基因片段的幾種擴(kuò)增產(chǎn)物，混合后直接用于AlleleLadder；另一種方法是將能代表某位點(diǎn)上所有等位基因的擴(kuò)增產(chǎn)物混合物，稀釋后再次擴(kuò)增，將再次擴(kuò)增的產(chǎn)物用作等位基因階梯。按上述方法制備的等位基因階梯有很多不足之處(1)、直接選擇人基因組作為擴(kuò)增模板時(shí)，往往出現(xiàn)有些帶是重復(fù)擴(kuò)增，而有些帶確很難找到相應(yīng)的的擴(kuò)增模板，由此制備的等位基因階梯的各條帶的顏色深淺不一，甚至出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象。(2)、要批量生產(chǎn)，必須要經(jīng)常去挑選和制備能代表所有等位基因片段的模板，不但工作量大，而且每次用的同一模板的純度及含量等均有出入，使其擴(kuò)增條件難以標(biāo)準(zhǔn)化。(3)、人基因組DNA的分子量太大，結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜，難以線性化和解鏈，所以擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量較低，而且非特異擴(kuò)增較嚴(yán)重，對(duì)產(chǎn)物的純化較困難，不適合批量生產(chǎn)。(4)、若用人基因DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物混合后再次進(jìn)行擴(kuò)增，其非特異擴(kuò)增更加嚴(yán)重，擴(kuò)增產(chǎn)物中各條帶的顏色更不均一，此法更不適合批量生產(chǎn)。(5)、將擴(kuò)增產(chǎn)物的混合物直接用于等位基因階梯時(shí)，在短時(shí)間內(nèi)可能出現(xiàn)降解，使其各條帶模糊不清，或者構(gòu)型有所改變，使其電泳遷移率發(fā)生變化。由于這些原因引起的質(zhì)量變化均不能作為標(biāo)準(zhǔn)參照物使用。由于上述原因，至今尚無任何單位可以批量生產(chǎn)一種穩(wěn)定的STR等位基因階梯供給有關(guān)部門使用。本發(fā)明的目的就是為了提供一種短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備技術(shù)，該技術(shù)能批量生產(chǎn)穩(wěn)定性好的(即在常溫以下至少在一年之內(nèi)不出現(xiàn)降解和構(gòu)型改變，在各種濃度的變性或非變性膠中均保持與擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳遷移率一致)，既可用于銀染法，也可用于熒光法的等位基因階梯試劑。一種短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備技術(shù)，其特征在于包括以下生產(chǎn)順序步驟1、從人的有核細(xì)胞中提取DN/A取抗凝血20μl，加紅細(xì)胞裂解液D.5ml左右，充分混勻后，5000rpm離心5分鐘，再用紅細(xì)胞裂解液洗兩遍，沉淀加20μl白細(xì)胞裂解液，混勻后，100℃煮10分鐘，取1μl進(jìn)行STR-PCR擴(kuò)增；2、按國(guó)內(nèi)外公開發(fā)表的各STR位點(diǎn)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，以尋找各位點(diǎn)的等位基因型；3、按德國(guó)QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAquickGelExtractionKit(或其它公司的同類產(chǎn)品)說明書，快速純化PCR產(chǎn)物；4、按Promega公司生產(chǎn)的pGEM-TVectorSystems(或其它公司的同類產(chǎn)品)說明書將純化的PCR產(chǎn)物連接到T載體上；5、按《分子克隆》第二版中文版第19頁的方法提取質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行純度和定量測(cè)試；6、用STR-PCR技術(shù)分別制備各等位基因片段，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化和定量測(cè)定；7、將各位點(diǎn)的等位基因片段進(jìn)行序列分析，以測(cè)定各片段的bp數(shù)及串聯(lián)重復(fù)單位數(shù)；8、將各片段等量混合后，加入穩(wěn)定劑，并按適當(dāng)量分裝；9、出廠前再次進(jìn)行電泳檢測(cè)。本發(fā)明有如下的特點(diǎn)1、用于擴(kuò)增各等位基因的模板是通過分子克隆技術(shù)制備的，該模板的DNA序列與人基因組DNA上同一位點(diǎn)的序列完全相同，因此用這兩種不同模板得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA序列及構(gòu)型完全一致，從而確保了這兩種擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳遷移率保持不變。2、通過分子克隆技術(shù)得到的模板的長(zhǎng)度遠(yuǎn)小于人基因組DNA的長(zhǎng)度，容易線性化和解鏈，在相同條件下，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物遠(yuǎn)高于用人基因組DNA擴(kuò)增的量，而且非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物也遠(yuǎn)少于人基因組DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物，所以容易批量生產(chǎn)。3、各等位基因片段是一條一條的制備，然后分別測(cè)定其含量，再等量混合后制成等位基因階梯，這樣就確保了每條帶顏色的深淺是均一的。4、用分子克隆技術(shù)制備的模板更容易作到定性定量測(cè)定，一次標(biāo)化好的模板可用好幾年，這不但大大地減化了反復(fù)從人的有核細(xì)胞中去尋找和提取各等位基因模板的煩瑣工作，更主要的是盡可能地避免了因?yàn)槊颗０遒|(zhì)量的差異，給生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化和產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性帶來的負(fù)面影響。5、在批量生產(chǎn)等位基因階梯時(shí)，所用引物之一的5’端標(biāo)上熒光素后，便可得到可供熒光檢測(cè)的等位基因階梯。6、按本專利制備等位基因階梯不但可批量化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，而且產(chǎn)品的穩(wěn)定性特別好，在常溫以下至少在一年之內(nèi)產(chǎn)品不存在降解和構(gòu)型改變等，其質(zhì)量完全可以達(dá)到同類進(jìn)口試劑的水平。下面詳細(xì)說明。本發(fā)明包括以下生產(chǎn)順序步驟1、從人的有核細(xì)胞中提取DNA取抗凝血20μl，加紅細(xì)胞裂解液0.5ml左右，充分混勻后，5000rpm離心5分鐘，再用紅細(xì)胞裂解液洗兩遍，沉淀加20μl白細(xì)胞裂解液，混勻后，100℃煮10分鐘，取1μl進(jìn)行STR-PCR擴(kuò)增。2、按國(guó)內(nèi)外公開發(fā)表的各STR位點(diǎn)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，以尋找各位點(diǎn)的等位基因型。以VWA位點(diǎn)為例說明如下引物序列分別為5’-GGGATTTCCCTATGGATTGG-3’和5’-GCGAAAGAATGAGGACTACAT-3’。如果用熒光法進(jìn)行檢測(cè)，需在其中一條引物的5’端標(biāo)上熒光素。每一擴(kuò)增樣品包含2-40ng人類基因組DNA，1×Taq緩沖液，1.5mmol/LMgcl，每種核苷酸150μmol/L，1UTaq聚合酶，每種引物0.25μmol/L，反應(yīng)體積25μl。在熱循環(huán)儀中先95℃預(yù)變性2分鐘，然后循環(huán)30次，每次94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘。用7.5％聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳，然后銀染。通過比較樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與人類VWA位點(diǎn)AlleleLadde的電泳譜帶位置確定VWA基因型。3、按德國(guó)QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAquickGelExtractionKit(或其它公司的同類產(chǎn)品)說明書，快速純化PCR產(chǎn)物。具體方法如下加5倍體積的PE至1體積的PCR產(chǎn)物中，混合后加到QIAquick柱中，將該柱置于2ml收集管之上，快速離心30-60秒，棄去離心液，用0.75mlBufferPE加到柱中再快速離心30-60秒，棄去離心液，將柱置于新的1.5ml離心管之上，加適量的水到柱中，快速離心1分鐘，收集離心液備用。4、按Promega公司生產(chǎn)的pGEM-TVectorSystems(或其它公司的同類產(chǎn)品)說明書將純化的PCR產(chǎn)物連接到T載體上，即2×T4DNAligasebeffer5μl，pGEM-T1μl，T4DNAliggase1μl，經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物適量，然后加水至10μl4℃連接過夜，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，然后從選擇培養(yǎng)基平板上挑取單菌落，從中挑選所需要的重組菌。5、按《分子克隆》第二版中文版第19頁的方法提取質(zhì)粒DNA，即將LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的重組菌轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，5000rpm離心5分鐘，棄上清，加100μl預(yù)冷的溶液I，劇烈振蕩使其充分懸浮；然后再加200μl新配制的溶液II；蓋緊管口，快速顛倒離心管5次后置于冰上；再加150μl冰冷的溶液III，溫和振蕩10秒鐘后，再置于冰上3-5分鐘，4℃12000rpm離心10分鐘；將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加等體積的酚/氯仿，振蕩均勻后，4℃12000rpm離心2分鐘；將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加2倍體積的乙醇，充分混勻后，室溫下放2分鐘，4℃12000rpm離心5分鐘；再用1ml70％乙醇洗一次質(zhì)粒DNA，然后去掉上清，在空氣中使其干燥；加適量的無DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE重新溶解質(zhì)粒DNA。然后用分光光度法測(cè)定其純度及含量，并保存在-20℃?zhèn)溆谩?、用STR-PCR技術(shù)分別制備各等位基因片段，在制備帶熒光基團(tuán)的等位基因階梯時(shí)，需在其中一條引物的5’端先標(biāo)上熒光素。然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化和定量測(cè)定。7、將各位點(diǎn)的等位基因片段進(jìn)行序列分析，以測(cè)定各片段的bp數(shù)及串聯(lián)重復(fù)單位數(shù)。8、將各片段等量混合后，加入穩(wěn)定劑，并按適當(dāng)量分裝。9、出廠前再次進(jìn)行電泳檢測(cè)。權(quán)利要求一種短串聯(lián)重復(fù)序列等位基因階梯的制備技術(shù)，其特征在于包括以下生產(chǎn)順序步驟1、從人的有核細(xì)胞中提取DNA取抗凝血20μl，加紅細(xì)胞裂解液0.5ml左右，充分混勻后，5000rpm離心5分鐘，再用紅細(xì)胞裂解液洗兩遍，沉淀加20μl白細(xì)胞裂解液，混勻后，100℃煮10分鐘，取1μl進(jìn)行STR-PCR擴(kuò)增；2.按國(guó)內(nèi)外公開發(fā)表的各STR位點(diǎn)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，以尋找各位點(diǎn)的等位基因型；3.按德國(guó)QIAGEN公司生產(chǎn)的QIAquickGelExtractionKit(或其它公司的同類產(chǎn)品)說明書，快速純化PCR產(chǎn)物；4.按Promega公司生產(chǎn)的pGEM-TVectorSyslems(或其它公司的同類產(chǎn)品)說明書將純化的PCR產(chǎn)物連接到T載體上；5.按《分子克隆》第二版中文版第19頁的方法提取質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行純度和定量測(cè)試；6.用STR-PCR技術(shù)分別制備各等位基因片段，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化和定量測(cè)定；7.將各位點(diǎn)的等位基因片段進(jìn)行序列分析，以測(cè)定各片段的bp數(shù)及串聯(lián)重復(fù)單位數(shù)；8.將各片段等量混合后，加入穩(wěn)定劑，并按適當(dāng)量分裝；9.出廠