微生物檢驗方法驗證

關于微生物檢驗方法驗證重點議題一、法規(guī)要求二、驗證目的三、檢驗概述四、總菌落數(shù)檢查方法驗證五、控制菌檢查方法驗證六、無菌檢查方法驗證第2頁,共17頁，2024年2月25日，星期天一、法規(guī)要求第二百二十六條試劑、試液、培養(yǎng)基和檢定菌的管理應當至少符合以下要求：（一）試劑和培養(yǎng)基應當從可靠的供應商處采購，必要時應當對供應商進行評估；（二）應當有接收試劑、試液、培養(yǎng)基的記錄，必要時，應當在試劑、試液、培養(yǎng)基的容器上標注接收日期；（三）應當按照相關規(guī)定或使用說明配制、貯存和使用試劑、試液和培養(yǎng)基。特殊情況下，在接收或使用前，還應當對試劑進行鑒別或其他檢驗；（四）試液和已配制的培養(yǎng)基應當標注配制批號、配制日期和配制人員姓名，并有配制（包括滅菌）記錄。不穩(wěn)定的試劑、試液和培養(yǎng)基應當標注有效期及特殊貯存條件。標準液、滴定液還應當標注最后一次標化的日期和校正因子，并有標化記錄；第3頁,共17頁，2024年2月25日，星期天一、法規(guī)要求第二百二十六條（續(xù)）（五）配制的培養(yǎng)基應當進行適用性檢查，并有相關記錄。應當有培養(yǎng)基使用記錄；（六）應當有檢驗所需的各種檢定菌，并建立檢定菌保存、傳代、使用、銷毀的操作規(guī)程和相應記錄；（七）檢定菌應當有適當?shù)臉俗R，內容至少包括菌種名稱、編號、代次、傳代日期、傳代操作人；（八）檢定菌應當按照規(guī)定的條件貯存，貯存的方式和時間不應當對檢定菌的生長特性有不利影響。第4頁,共17頁，2024年2月25日，星期天二、驗證目的為了使微生物學檢驗方法的結果準確可靠，需要對每個品種的具體檢驗方法進行驗證。第5頁,共17頁，2024年2月25日，星期天三、驗證概述微生物學檢驗方法包括：1.微生物限度檢查2.無菌檢查3.防腐劑抑菌效力測定總菌落數(shù)檢查（回收率）控制菌檢查（專屬性）第6頁,共17頁，2024年2月25日，星期天三、驗證概述微生物學檢驗的影響因素：1.藥品本身的抑菌性2.藥品中防腐劑的抑菌性3.培養(yǎng)基的促菌生長能力4.培養(yǎng)條件（溫度、濕度及需氧或厭氧）5.過濾系統(tǒng)的材質第7頁,共17頁，2024年2月25日，星期天三、驗證概述消除抑菌性的方法:一、化學中和法用化學中和劑中和抑菌劑，消除抑菌作用。二、稀釋法降低抑菌劑的濃度以消除抑菌性。三、薄膜過濾法

抑菌性產品通過濾膜時，微生物被截留在膜上，檢品被過濾掉。

——微生物檢查法準確與否的核心是對抑菌性的有效消除第8頁,共17頁，2024年2月25日，星期天四、總菌落數(shù)檢查方法驗證環(huán)境條件：C級下的局部A級的單向流空氣區(qū)域培養(yǎng)基種類：細菌計數(shù)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基霉菌和酵母菌計數(shù)玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基酵母菌計數(shù)酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基第9頁,共17頁，2024年2月25日，星期天四、總菌落數(shù)檢查方法驗證培養(yǎng)基適用性檢查

被檢培養(yǎng)基培養(yǎng)結果

試驗菌試驗菌被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不得小于對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70%菌落形態(tài)大小應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致50~100cfu50~100cfu適宜培養(yǎng)條件........................第10頁,共17頁，2024年2月25日，星期天四、總菌落數(shù)檢查方法驗證方法驗證——對細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證：——進行3次獨立的平行試驗，分別計算各組回收率。（1）試驗組

平皿法計數(shù)

薄膜過濾法計數(shù)

最低稀釋級供試液1ml+2個瓊脂培養(yǎng)基平皿試驗菌50~100cfu取規(guī)定量的最低稀釋級供試液，過濾，沖洗，在最后一次沖洗液中加試驗菌50~100cfu，過濾。第11頁,共17頁，2024年2月25日，星期天四、總菌落數(shù)檢查方法驗證（2）菌液組直接接種試驗菌（3）供試品對照組取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)。（4）稀釋劑對照組用相應的稀釋劑代替供試品，加入試驗菌。（若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，需增加稀釋劑對照組。）第12頁,共17頁，2024年2月25日，星期天四、總菌落數(shù)檢查方法驗證合格標準：在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應均不低于70%。試驗組的菌數(shù)回收率均不低于70%第13頁,共17頁，2024年2月25日，星期天五、控制菌檢查方法驗證環(huán)境條件：C級下的局部A級的單向流空氣區(qū)域培養(yǎng)基和培養(yǎng)基試驗：無菌性促生長能力——在最短時間內觀察到明顯生長抑制能力——在培養(yǎng)的最長時間內不能觀察到微生物的生長指示能力——在規(guī)定的時間內必須和以前檢驗過并已接受的培養(yǎng)基在外觀和指示反應都具備可比性。第14頁,共17頁，2024年2月25日，星期天五、控制菌檢查方法驗證方法驗證：按照各品種項下規(guī)定檢查的控制菌選擇驗證菌株。規(guī)定量供試液+10~100cfu試驗菌+增菌培養(yǎng)基合格標準：檢出試驗菌第15頁,共17頁，2024年2月25日，星期天六、