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文檔簡介
關(guān)于免疫組化(2)理論課免疫組化技術(shù)操作并不困難,雖然染色過程包括很多步驟,但只要注意一些主要問題,就能完成一張質(zhì)量好的免疫組化切片。第2頁,共82頁,2024年2月25日,星期天內(nèi)容1.染色前需注意的問題2.染色中需注意的問題
3.如何進(jìn)行科研設(shè)計第3頁,共82頁,2024年2月25日,星期天免疫組化基本流程以石蠟組織為例sp法:
取材---固定---脫水---透明---浸蠟包埋---切片---烤片---染色開始,脫蠟---入水---修復(fù)---阻斷內(nèi)源性過氧化物酶---正常羊血清封閉---一抗---二抗---三抗---顯色第4頁,共82頁,2024年2月25日,星期天染色前需注意的問題第5頁,共82頁,2024年2月25日,星期天一、組織和細(xì)胞標(biāo)本類型:二、組織取材對病理組織還應(yīng)做到以下幾點:①
材部位必須是主要病變區(qū)。②必須取病灶與正常組織的交界區(qū)③必要時取遠(yuǎn)離病灶的正常組織做對照。第6頁,共82頁,2024年2月25日,星期天三、組織固定在免疫組化中首選的固定液是10%中性緩沖福爾馬林液(市售甲醛1:9稀釋)為確保離體組織的抗原性,值得高度重視的是離體組織須馬上固定。組織離體后固定一般不要超過15分鐘,固定在常溫條件下時間為8-24小時,同時還要注意的是要避免福爾馬林過度固定造成的組織抗原損失第7頁,共82頁,2024年2月25日,星期天
為確保離體組織的抗原性,值得高度重視的是離體組織須馬上固定。組織離體后固定一般不要超過15分鐘,固定在常溫條件下時間為8-24小時,同時還要注意的是要避免福爾馬林過度固定造成的組織抗原損失,有研究發(fā)現(xiàn)新鮮組織經(jīng)過福爾馬林固定一周后組織抗原丟失嚴(yán)重,抗原幾乎不能被檢出。組織同樣不能長時間放置在70%的乙醇中。脫鈣液對抗原破壞較為嚴(yán)重,所以脫鈣液中酸的濃度與脫鈣時間都必須盡量控制在最低的限度。第8頁,共82頁,2024年2月25日,星期天四、組織脫水五、組織透明六、組織浸蠟及包埋六、切片
第9頁,共82頁,2024年2月25日,星期天舉例:小動物組織脫水、透明和浸蠟時間
75%乙醇30min,85%乙醇30min,95%乙醇Ⅰ1h,Ⅱ1h,Ⅲ過夜或2h;無水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min;二甲苯Ⅰ15min,Ⅱ10min,Ⅲ10min;石蠟Ⅰ30min,石蠟Ⅱ30min,石蠟Ⅲ1-2h。第10頁,共82頁,2024年2月25日,星期天
總之,提高切片質(zhì)量須注意制片過程中的每一個環(huán)節(jié),特別是組織固定,可以說固定是高質(zhì)量制片的基礎(chǔ),脫水更關(guān)鍵,只有充分的固定組織,才不會影響整個脫水、透明、浸蠟以及切片、甚至包括染色的全過程,才能制作出合格的高質(zhì)量的切片。第11頁,共82頁,2024年2月25日,星期天七、防脫片的制備
防脫玻片的處理各個實驗室間一般多采用不同的粘附劑如APES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)、HistogripTM或Poly-L-Lysine。目前通用的是Sigma公司的多聚左旋賴氨酸(Poly-L-lysine)或硅化片,不論是免疫組化還是原位雜交該粘附劑都具有極好的防脫片效果。第12頁,共82頁,2024年2月25日,星期天APES:現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中,停留20-30秒鐘,取出稍停片刻,再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結(jié)合的APES,置通風(fēng)櫥中晾干即可。用此載玻片撈片時應(yīng)注意組織要一步到位,并盡量減少氣泡的存在,以免影響染色結(jié)果。第13頁,共82頁,2024年2月25日,星期天
HistogripTM:將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中,停留1-2分鐘,然后用雙蒸水快速清洗三次,室溫干燥或60℃烤箱烘烤一小時,裝盒備用。
Poly-L-Lysine:將洗凈、干燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中,浸泡5分鐘,60℃烤箱烘烤1小時或室溫過夜干燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃制品。第14頁,共82頁,2024年2月25日,星期天八、烤片
切片在56-60℃恒溫箱里烤片至少1小時才不至于脫片,邁新實驗室推薦58-60℃恒溫箱里烤片2小時。也有的實驗室在58-60℃恒溫箱里過夜烤片。但高溫烤片對抗原有破壞,原因是在高溫干燥條件下可以加速組織切片中抗原的氧化。第15頁,共82頁,2024年2月25日,星期天九、切片保存
切片后的組織在室溫下長期保存抗原可以損失。在實驗中邁新實驗室發(fā)現(xiàn)蠟塊切片后,在室溫下保存三個月以上,免疫組化染色結(jié)果會出現(xiàn)減弱或陰性情況,尤其核表達(dá)的抗原丟失更多。第16頁,共82頁,2024年2月25日,星期天究其原因可能與空氣中的氧化作用有關(guān),所以在實際工作可以采用蠟封切片來避免抗原損失以便長期保存,也可4℃冰箱冷藏保存,提醒科研單位在連續(xù)性課題實驗中注意切片的保存。第17頁,共82頁,2024年2月25日,星期天染色中應(yīng)注意的問題第18頁,共82頁,2024年2月25日,星期天一、脫蠟和水化
免疫組化的脫蠟步驟與常規(guī)H&E脫蠟步驟相同,免疫組化實驗室中脫蠟需與H&E常規(guī)脫蠟分離,以保證脫蠟徹底,否則可能導(dǎo)致染色結(jié)果的異常。第19頁,共82頁,2024年2月25日,星期天二、抗體選擇第20頁,共82頁,2024年2月25日,星期天
首先確定一抗種屬來源能否適應(yīng)標(biāo)本來源(人或動物組織),能否適應(yīng)標(biāo)本處理形式(冰凍、石蠟),一抗單克隆抗體(鼠、兔)和多克隆抗體(兔、馬、羊等)及二,三抗的配套連接,不同方法連接方式不同(S-P、二步法等),購買商品化抗體應(yīng)盡量購買原液,質(zhì)量高,保存時間長,而即用型抗體則現(xiàn)買現(xiàn)用,不可長期保存。第21頁,共82頁,2024年2月25日,星期天多抗和單抗的比較
均一性,單抗的均一性很強穩(wěn)定性,單抗的穩(wěn)定性較差特異性,單抗的特異性強重復(fù)性,單抗的重復(fù)性好第22頁,共82頁,2024年2月25日,星期天抗體的稀釋方法直接測定法從以上結(jié)果分析,可以選擇1:200~1:400之間的濃度
稀釋濃度特異強度背景染色1:50++++++1:100++++++1:200+++++1:400+++﹣第23頁,共82頁,2024年2月25日,星期天
抗體的最佳稀釋度
由于各種抗體效價不同,組織中抗原強弱不一,應(yīng)根據(jù)不同情況作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整,以取得中等陽性稀釋度為最佳,因其既適合于抗原性強和含量多的標(biāo)本,也可用于抗原性弱的標(biāo)本。第24頁,共82頁,2024年2月25日,星期天抗體滴片技術(shù)
所滴的抗體應(yīng)與切片上的組織剛好吻合。滴抗體前需把切片上的水弄干,但不能干片。要領(lǐng):甩凈組織周圍的水??贵w滴片圖示:第25頁,共82頁,2024年2月25日,星期天三、抗原修復(fù)
第26頁,共82頁,2024年2月25日,星期天
常規(guī)甲醛固定的石蠟切片標(biāo)本在固定過程中會形成醛鍵,導(dǎo)致蛋白交聯(lián)封閉了組織中的部分抗原決定簇,染色前需進(jìn)行處理,打開醛鍵暴露抗原,增加細(xì)胞和組織的通透性,以使抗體和抗原最大限度結(jié)合,提高免疫組化檢測陽性率,達(dá)到能真實反映該組織蛋白表達(dá)水平或抗原含量??乖迯?fù)有酶消化、微波修復(fù)、高壓處理等。
第27頁,共82頁,2024年2月25日,星期天1、微波修復(fù)
本實驗室微波修復(fù)應(yīng)用最多,特點是簡單、有效,主要根據(jù)微波發(fā)射高頻能量,組織經(jīng)微波幅射后,會加速組織內(nèi)部分子高速運動,抗原可完全被暴露出來,用于漿或部分核抗原,膜抗原不用或短時間應(yīng)用。在0.01MPH6.0檸檬酸緩沖液微波修復(fù)時,溫度控制在95-100℃之間維持10分鐘,不足或超過100℃達(dá)不到抗原修復(fù)最佳效果。第28頁,共82頁,2024年2月25日,星期天第29頁,共82頁,2024年2月25日,星期天子宮內(nèi)膜PR染色,修復(fù)良好子宮內(nèi)膜PR染色,修復(fù)不足第30頁,共82頁,2024年2月25日,星期天2、酶消化
其作用是以化學(xué)的方式使醛鍵斷裂,暴露抗原決定族,增加細(xì)胞和組織的通透性,以便抗體與抗原最大限度的結(jié)合,增強特異性染色,避免非特異性染色,注意有些抗原顯示必須先行消化,有些不需要反而破壞抗原性,使陽性率下降,須消化的組織或細(xì)胞抗原,也要視抗原在切片中的封閉程度而定。對某些組織抗原經(jīng)一種酶消化后,可能結(jié)果仍不理想,此時可采用雙消化法,消化的時間與固定的時間成反比。第31頁,共82頁,2024年2月25日,星期天胰蛋白酶,用于胞漿抗原,此酶較溫和,濃度及消化時間易控制,常用0.05%~0.1%,PH7.8,37℃消化20~30′或更長,微波37℃可短時消化。胃蛋白酶,用于間質(zhì)抗原,常用0.2%PH2.5左右,消化20~30′或更長,消化后切片應(yīng)充分洗滌,否則對組織中抗原會進(jìn)行緩慢消化,破壞組織結(jié)構(gòu)第32頁,共82頁,2024年2月25日,星期天第33頁,共82頁,2024年2月25日,星期天3、高壓處理家用壓力鍋,大小尺寸根據(jù)需要而定,1000W電爐,多用于核抗原修復(fù),針對微波修復(fù)多陰性,進(jìn)行高壓處理為陽性,如p27、p21WAP1、PR、Ki67效果好。將1500ml~3000ml的檸檬酸鹽緩沖液(工作液)注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置于金屬架上,放入鍋內(nèi),使切片位于液面以下,蓋鍋壓閥。當(dāng)壓力鍋開始慢慢噴氣時(約加熱5~6分鐘后),計時1~2分鐘,然后將壓力鍋端離熱源,冷水沖至室溫后,取下氣閥,打開鍋蓋,取出切片,蒸餾水洗后,PBS洗2分鐘×3,下接免疫組化染色步驟。第34頁,共82頁,2024年2月25日,星期天
加熱處理后免疫組化的染色敏感度大幅度地提高,其機(jī)理推測可能是加熱打開了組織抗原因福爾馬林固定所引起的抗原決定簇的交聯(lián),但機(jī)理目前仍然還不是十分清楚。第35頁,共82頁,2024年2月25日,星期天第36頁,共82頁,2024年2月25日,星期天4.抗原修復(fù)液的選擇
加熱抗原修復(fù)緩沖液有多種,如檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0),Tris(pH7-8),EDTA(pH8.0)等,目前首選檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0),優(yōu)點是染色背景清晰,適合于大多數(shù)抗體,Tris和EDTA兩種修復(fù)液對部分抗原修復(fù)效果較強,但其染色背景同時加深,如使用不當(dāng)易造成假陽性結(jié)果的判斷。第37頁,共82頁,2024年2月25日,星期天值得注意的是沒有一種抗原修復(fù)液能適合于所有的抗體,檸檬酸緩沖液(pH6.0)可作為免疫組化常規(guī)使用的抗原修復(fù)緩沖液,但也不能除外某些抗體適用于EDTA和Tris緩沖修復(fù)液,一般抗原比較難于表達(dá)的抗體多選擇EDTA和Tris緩沖修復(fù)液。第38頁,共82頁,2024年2月25日,星期天四、內(nèi)源性過氧化物酶的滅活
若采用過氧化物酶的檢測系統(tǒng),必須進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶的封閉處理。因壞死組織、中性粒細(xì)胞及紅細(xì)胞等均存在豐富的內(nèi)源性過氧化物酶,其活性穩(wěn)定、強,能與過氧化氫反應(yīng),可使二氨基聯(lián)苯胺(DAB)還原產(chǎn)生棕色反應(yīng)物與免疫HRP標(biāo)記特異性染色相同,稱之為假陽性。故應(yīng)在染色前將內(nèi)源酶封閉、消除,常用3%H2O2,濃度適中,過低達(dá)不到阻斷作用,過高破壞細(xì)胞表面抗原,時間控制在10~15分鐘。
第39頁,共82頁,2024年2月25日,星期天蛻膜組織部分胞核PR陽性,血管內(nèi)紅細(xì)胞過氧化物酶顯色第40頁,共82頁,2024年2月25日,星期天壞死組織著色第41頁,共82頁,2024年2月25日,星期天內(nèi)源性生物素—腎小管
第42頁,共82頁,2024年2月25日,星期天IgG交叉反應(yīng)常引起非特異性背景著色,因不同種系動物分子結(jié)構(gòu)相似,抗一種動物IgG可與另一種動物IgG交叉反應(yīng),如:二抗羊抗鼠或羊抗兔血清可與人組織切片上人IgG結(jié)合,呈假陽性,用二抗同種動物正常血清封閉某些非特異性結(jié)合位點,(正常血清可提供白蛋白,與組織內(nèi)非特異蛋白結(jié)合,含天然抗體中IgG的FC段與待檢標(biāo)本FC段結(jié)合),一般用10%正常血清封閉組織10~15分鐘。五、正常血清封閉
第43頁,共82頁,2024年2月25日,星期天抗體與內(nèi)源性Ig交叉反應(yīng):第44頁,共82頁,2024年2月25日,星期天
六、免疫組化技術(shù)掌握共同條件
1免疫組化染色中PH值和離子濃度對最終結(jié)果有影響,磷酸緩沖液(PBS)PH值中性及弱堿性條件(PH7.8)及低離子強度0.01-0.02M,有利于免疫復(fù)合物形成,而酸性條件及高離子強度有利于分解。通常采用0.01MPH7.2-7.4緩沖液作為反應(yīng)環(huán)境洗滌液。
第45頁,共82頁,2024年2月25日,星期天2.PBS洗滌技術(shù)(1)洗滌的目的①保證離子濃度和PH值。②減少非特異反應(yīng)(抗體不可靠很純)(2)方法:洗三次,每次5分鐘。第46頁,共82頁,2024年2月25日,星期天3、抗體最佳孵育溫度及時間(一抗孵育)濕盒孵育,以防抗體的蒸發(fā)和干片。室溫25℃或37℃孵育45~1h或更長時間或轉(zhuǎn)4℃過夜。通過預(yù)實驗,選擇合適稀釋度,孵育時間與其成正比。孵育時避免干燥,否則會使抗體活性減低或消失。第47頁,共82頁,2024年2月25日,星期天
胞漿著色一抗過濃或交叉反應(yīng):p63(乳腺)第48頁,共82頁,2024年2月25日,星期天七、正確設(shè)計實驗對照
第49頁,共82頁,2024年2月25日,星期天免疫組化染色結(jié)果分析的質(zhì)量取決于正確使用各種對照,進(jìn)行常規(guī)免疫組化鑒別診斷需設(shè)陰性(空白)、陽性、自身、Vimentin陽性對照。
1陰性對照
不含靶抗原的組織切片與待檢切片進(jìn)行同樣處理,結(jié)果應(yīng)呈陰性。用PBS替代第一抗體,即空白對照。第50頁,共82頁,2024年2月25日,星期天2陽性對照
用已證實含有靶抗原組織切片與待檢標(biāo)本進(jìn)行同樣處理進(jìn)行免疫組化染色,結(jié)果應(yīng)為陽性,陽性對照達(dá)到目的有兩點:
(1)預(yù)期得到陰性結(jié)果,必須有陽性對照,對腫瘤鑒別診斷較為重要,當(dāng)病理形態(tài)診斷與免疫組化結(jié)果相反時,需用類似腫瘤標(biāo)本(已知陽性片)作陽性對照。
(2)證明染色技術(shù)可靠性,即陰性可靠性,它不是由于標(biāo)本處理使細(xì)胞內(nèi)抗原喪失,方法錯誤、技術(shù)不熟練造成假陰性。第51頁,共82頁,2024年2月25日,星期天陽性對照的標(biāo)本
1、多組織切片
2、“臘腸”“春卷”切片
3、組織芯片
4、闌尾2mm第52頁,共82頁,2024年2月25日,星期天第53頁,共82頁,2024年2月25日,星期天3自身對照
根據(jù)組織內(nèi)有不同細(xì)胞,抗原成分復(fù)雜特點,抗體只作用于一種細(xì)胞或某種抗原,陰性部位可作為陽性自身對照,應(yīng)陽性部位可作被檢部位陽性對照,如區(qū)別血管源性和非血管源性腫瘤,用第八因子相關(guān)抗原檢測,血管可作陽性對照,正常上皮可作檢測角蛋白自身對照。此對照用途廣,要在結(jié)果陽性、陰性分明,背景清晰情況下才能作自身對照。第54頁,共82頁,2024年2月25日,星期天舉例:Vimentin陽性對照
Vimentin在免疫組化中作為陽性對照是由Battifora提出,他提出在每次實驗中增加Vimentin染色作為對照,目的是觀察組織經(jīng)福爾馬林固定后預(yù)期抗原表達(dá)的敏感性,按福爾馬林固定后抗原損傷的程度來進(jìn)行分析。第55頁,共82頁,2024年2月25日,星期天Vimentin幾乎在任何組織中都有表達(dá),尤其優(yōu)選于活檢組織中的免疫組化染色觀察。在與上皮組織相連接的間質(zhì)中存在著大量的血管Vimentin可陽性表達(dá),如果在同一張切片的間質(zhì)中出現(xiàn)Vimentin染色微弱或部分區(qū)域變?nèi)醯那闆r,表明是過度固定導(dǎo)致抗原破壞。所以在每批次實驗中應(yīng)常規(guī)加入Vimentin染色,用于指導(dǎo)觀察福爾馬林固定后抗原表達(dá)敏感性情況。第56頁,共82頁,2024年2月25日,星期天第57頁,共82頁,2024年2月25日,星期天Vimentin染色結(jié)果第58頁,共82頁,2024年2月25日,星期天八、IHC結(jié)果的呈現(xiàn)方式常用的顯色體系為辣根過氧化物酶(Horseradishperoxidase,HRP)、堿性磷酸酶(Alkalinephasphotase,AP)和葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase,GOD)。常用顯色劑有AEC-磚紅色
NBT/BCIP-藍(lán)紫色
DAB-棕黃色或棕褐色
第59頁,共82頁,2024年2月25日,星期天
HRP的特點是:(1)酶催化的底物H2O2是特異的,所形成的產(chǎn)物易于觀察;(2)反應(yīng)過程和沉淀物是穩(wěn)定的。其余反應(yīng)是非特異的,可用各種電子供體介導(dǎo),所以選用不同的電子供體可使終產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的顏色,如AEC、DAB。第60頁,共82頁,2024年2月25日,星期天DAB顯色原理DABdiaminobenzidine二氨基聯(lián)苯胺
氧化聚合吲哚胺多聚體
氧化環(huán)化苯乙肼聚合體第61頁,共82頁,2024年2月25日,星期天DAB顯色的優(yōu)點:背景清晰,陽性物鮮艷易辨;切片可脫水透明故適合于照相及半永久保存。缺點:容易氧化,需新鮮配置;有一定的致癌性,注意防護(hù)。第62頁,共82頁,2024年2月25日,星期天AEC顯色的優(yōu)缺點AEC(3-amino-9-ethyl-carbazole)即為3-氨基-9-乙基咔唑優(yōu)點:室溫下較穩(wěn)定,較安全缺點:不能進(jìn)行脫水等處理,且時間長易褪色,不宜照相。第63頁,共82頁,2024年2月25日,星期天NBT/BCIP染色NBT(硝基藍(lán)四氮唑)+BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽)是AP的最佳底物組合之一,顯色反應(yīng)產(chǎn)物為藍(lán)紫色。ASO-AP+BCIPPH=9.5BCI-OH+Pi
BCI-OH+NBT
藍(lán)紫色
ASO
等位基因特異的寡核苷酸第64頁,共82頁,2024年2月25日,星期天免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化照片CK10CD44v6ER第65頁,共82頁,2024年2月25日,星期天
應(yīng)用免疫組化進(jìn)行科研設(shè)計第66頁,共82頁,2024年2月25日,星期天1、采用新抗體,這是最簡單的方法
2、舊抗體新用途
3、采用新方法(如量子點免疫熒光技術(shù))
4、同時應(yīng)用多種抗體進(jìn)行普通免疫染色或雙重免疫染色研究兩種或兩種以上的抗原協(xié)同表達(dá),只要選用合理,也會獲得新發(fā)現(xiàn)。第67頁,共82頁,2024年2月25日,星期天思考題
以檢測肝細(xì)胞癌組織某一蛋白的表達(dá)為例,說說怎樣進(jìn)行實驗且實驗結(jié)果理想?第68頁,共82頁,2024年2月25日,星期天雙重和多重標(biāo)記染色的意義在同一組織或細(xì)胞切片上,同時或先后顯示兩種或兩種以上的抗原成分或其它物質(zhì),即為雙重或多重標(biāo)記。采取該方法能同時觀察不同抗原或分泌其它物質(zhì)的各類細(xì)胞、組織之間的相互關(guān)系,以及抗原物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)合成、轉(zhuǎn)運及代謝的途徑,把形態(tài)和功能研究更好地結(jié)合起來。第69頁,共82頁,2024年2月25日,星期天免疫組化的雙重染色技術(shù)可用于顯示某組織中的兩種不同的抗原采用經(jīng)親和層析純化并生物素化的二抗與鏈霉菌素-卵白素-過氧化物酶和鏈霉菌素-卵白素-堿性磷酸酶交聯(lián),其敏感性和特異性均較高。采用兩種不同的底物/色素/酶系統(tǒng)包括BCIP/NBT堿性磷酸酶和AEC/過氧化物酶,前者顯色為紫黑色,后者為深紅色。采用兩種不同激發(fā)波長的量子點如QD605、QD545,前者顯色為橙紅色,后者為深綠色第70頁,共82頁,2024年2月25日,星期天第71頁,共82頁,2024年2月25日,星期天注意事項選擇雙重染色的一抗時,應(yīng)避免兩種一抗的定位(胞核、胞漿、胞膜)重復(fù)。選擇的兩種抗體的抗原修復(fù)的方法(高壓、微波修復(fù)抗原或酶消化等)應(yīng)盡量相同。在進(jìn)行雙重染色之前,必須首先對所選擇的一抗分別進(jìn)行單獨染色的預(yù)實驗。預(yù)實驗的操作條件必須與雙染時的實驗條件相同。觀察實驗結(jié)果,抗體定位正確后,再進(jìn)行雙染實驗。實驗前要脫蠟徹底,實驗中要沖洗充分,嚴(yán)格控制操作步驟,盡量避免非特異性背景著色。第72頁,共82頁,2024年2月25日,星期天一、檢測PCNA抗原的表達(dá)可用免疫組織化學(xué)方法如S-P法檢測大腸癌組織中的抗原表達(dá)
以檢測人大腸癌組織中PCNA抗原和酸性粘液為例第73頁,共82頁,2024年2月25日,星期天二、AB染色檢測粘液的性質(zhì)在動物體和人體中的各種腺體及許多器官組織都能制造或分泌粘液物質(zhì),由于物質(zhì)中含酸基的不同,而又分為中性粘液物質(zhì)(neutralmucosubstan
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