動(dòng)物細(xì)胞工程制藥研究現(xiàn)狀和展望

第第10頁動(dòng)物細(xì)胞工程制藥爭(zhēng)論現(xiàn)狀和展望：當(dāng)前動(dòng)物細(xì)胞工程所涉及的主要技術(shù)領(lǐng)域包括細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞器特別是細(xì)胞核移植技術(shù)、染色體改造技術(shù)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物技術(shù)和細(xì)胞大量培育技術(shù)等方面[1].本文綜合論述了動(dòng)物細(xì)胞工程制藥的進(jìn)展簡(jiǎn)史,爭(zhēng)論近況和制造實(shí)例,并在此根底上探討了動(dòng)物細(xì)胞工程制藥的將來進(jìn)展趨勢(shì)和前景.:動(dòng)物細(xì)胞工程制藥;細(xì)胞融合;細(xì)胞大規(guī)模培育;核移植21世紀(jì),生物技術(shù)制藥是制藥行業(yè)的亮點(diǎn),近25年來,世界生物技術(shù)工業(yè)飛速進(jìn)展,制造了35種重要的治療性生物技術(shù)藥物.中國(guó)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)是緊跟世界產(chǎn)業(yè)同步進(jìn)展的.2023年全球生物技術(shù)藥物市場(chǎng)銷售額已到達(dá)828億美元.基因工程、細(xì)胞工程和酶工程組成三駕馬車行駛在現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)展大道的前列.動(dòng)物細(xì)胞工程在生物制藥的爭(zhēng)論和應(yīng)用中起關(guān)鍵作用,目前全世界生物技術(shù)藥物中使用動(dòng)物細(xì)胞工程生產(chǎn)的已超過80%,例如蛋白質(zhì)、單克隆抗體、疫苗等.所以對(duì)動(dòng)物細(xì)胞工程制藥的爭(zhēng)論具有重要意義.一、進(jìn)展簡(jiǎn)史開頭疫苗是動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)的開頭,在疫苗產(chǎn)業(yè)早期,往往利用動(dòng)物來生產(chǎn)疫苗,如用家兔人工感染狂犬病毒生產(chǎn)狂犬疫苗,用奶牛來生產(chǎn)天花疫苗,用某些細(xì)菌接種到動(dòng)物身上來生產(chǎn)抵抗該種細(xì)菌的疫苗.在1920年至1950年,已經(jīng)開發(fā)了多種病毒或細(xì)菌疫苗,如傷寒疫苗、肺結(jié)核疫苗、破傷風(fēng)疫苗、1950年月,已經(jīng)能夠利用動(dòng)物細(xì)胞培育技術(shù)來生產(chǎn)病毒.先在反響器中大規(guī)模培育動(dòng)物細(xì)胞,待細(xì)胞長(zhǎng)到肯定密度后,接種病毒,病毒利用培育的細(xì)胞進(jìn)展復(fù)制,從而生產(chǎn)大量的病毒,這一突破是動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)或細(xì)胞工程的真正開頭.基于動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)的病包括減毒的活病毒,或是滅活的病毒.在過去的30多年時(shí)間內(nèi),用動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)生產(chǎn)的疫苗挽救了幾百萬人和動(dòng)物的生命.1950年至1985年期間,細(xì)胞工程及其他技術(shù)的進(jìn)步,生產(chǎn)了多種人用疫苗來預(yù)防脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹、乙肝和帶狀皰疹等,并用于生產(chǎn)多種獸用疫苗[2].但是,這段時(shí)期對(duì)細(xì)胞表達(dá)水平的爭(zhēng)論仍舊很低,因而用這種工藝生產(chǎn)蛋白制品產(chǎn)量低、本錢高,因此早期的動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)只用于疫苗及少量的干擾素和尿激酶的生產(chǎn).進(jìn)展1970年月的兩項(xiàng)劃時(shí)代的科學(xué)覺察基因重組技術(shù)和雜交瘤技術(shù)大大促進(jìn)了動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步以及在工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用,使得動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培育技術(shù)在生產(chǎn)疫苗,尤其在生產(chǎn)自然的用于診斷和治療疾病的生物制品中具有舉足輕重的作用.動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)還用于生產(chǎn)很多診斷和治療疾病的單克隆抗體.用于生化檢測(cè)的單抗有幾千種,而單抗用于人體疾病治療是近幾年來生物制藥的一個(gè)重要領(lǐng)域,有幾十種單抗藥物正處于臨床試驗(yàn)中.從1986年FDA批準(zhǔn)第一種單抗治療藥物用于器官移植治療、可以抑制排斥反響的抗CD3單克隆OK-T39FDA外,很多將病毒的抗原打算簇基因轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞體內(nèi),用于生產(chǎn)安全性更高、療效更好的基因工程疫苗也正在開發(fā)之中.二、爭(zhēng)論現(xiàn)狀動(dòng)物細(xì)胞工程制藥主要涉及細(xì)胞融合技術(shù)、細(xì)胞器移植尤其是核移植技術(shù)、染色體改造技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)和細(xì)胞大規(guī)模培育技術(shù)等.細(xì)胞融合是用自然或人工的方法使兩個(gè)或幾個(gè)不同細(xì)胞融合為一個(gè)細(xì)胞的過程.可用于產(chǎn)生的物種或品系及產(chǎn)生單克隆抗體等.在我國(guó)目前動(dòng)物細(xì)胞工程的進(jìn)展中,技術(shù)最成熟的當(dāng)數(shù)細(xì)胞融合.其中淋巴細(xì)胞雜交瘤在國(guó)內(nèi)已普遍開展,并培育了很多具有很高有用價(jià)值的雜交瘤細(xì)胞株系,它們能分泌產(chǎn)生在診斷和治療病癥方面發(fā)揮重要作用的單克隆抗體.如甲肝病毒單克隆抗體[3]、抗人IgM單克隆抗體[4]、腫瘤疫苗[5]等可用于治療疾病;抗人結(jié)腸癌雜交瘤細(xì)胞系分泌的單克隆抗體[6],巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體)胞外區(qū)的單克隆抗體等[7]則對(duì)診斷疾病具有重要價(jià)值.由于技術(shù)已趨成熟,目前很多單克隆抗體已經(jīng)進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)階段.細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植就是將一個(gè)動(dòng)物的細(xì)胞核,移植到卵細(xì)胞中,并發(fā)育生長(zhǎng).核移植技術(shù)可用于具有良好進(jìn)展前景的生物反響器的制備.其中乳腺生物反響器的研制是最為看好的一個(gè)轉(zhuǎn)基因制藥方向.利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺作為生物反響器,生產(chǎn)基因工程人類蛋白質(zhì)藥物[8],其本錢較微生物發(fā)酵、動(dòng)物細(xì)胞培育生產(chǎn)基因工程藥物大大降低.但十幾年來,顯微注射技術(shù)始終是生產(chǎn)乳腺生物反響器的唯一有用手段,由于它本身固有的缺點(diǎn),使得乳腺生物反響器未能有長(zhǎng)足的步.基因打靶與核移植相結(jié)合很可能成為生產(chǎn)乳腺生物反響器更有效的途徑,它在外源基因定點(diǎn)整合、消退位點(diǎn)效應(yīng)、降低生產(chǎn)本錢、節(jié)約時(shí)間方面具有明顯的優(yōu)勢(shì).核移植技術(shù)在我國(guó)特別是培育魚類品種方面已有多年的爭(zhēng)論根底.目前我國(guó)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞核移植方面的爭(zhēng)論也開展得很好,除了傳統(tǒng)的胚胎細(xì)胞核移植外[9],體細(xì)胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物種上均獲得了成功.如2023年6月,西北農(nóng)林科技大學(xué)先后培育出了世界上第一只成年體細(xì)胞克隆山羊“元元“和其次只成年體細(xì)胞克隆山羊“陽陽“[10].另外,在利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為生物反響器生產(chǎn)基因工程藥物方面,上海人類遺傳病爭(zhēng)論所、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院發(fā)育所、揚(yáng)州大學(xué)、疆畜牧科學(xué)院、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院和軍需大學(xué)等都先后獲得了可能有潛在生產(chǎn)人用藥物蛋白價(jià)值的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指經(jīng)人的有意干預(yù),通過試驗(yàn)手段將外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞中并穩(wěn)定地整合到動(dòng)物基因組中,且能遺傳給子代的動(dòng)物.讓動(dòng)物成為制藥工廠、制造人類急需的生物制品,這始終是人們夢(mèng)寐以求的.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的消滅使得這一夢(mèng)想正逐步成為現(xiàn)實(shí).在21世紀(jì)制藥工業(yè)中,最具迷人前景的無疑是應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因藥物.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物與以往的制藥技術(shù)相比,具有不行比較的優(yōu)越性.哺乳動(dòng)物生物反響器好比在動(dòng)物身上建藥廠.動(dòng)物的乳汁或者血液可以源源不斷地為我們供給目的基因的產(chǎn)品.它的優(yōu)越性還有穩(wěn)定的生物活性.另外,作為生物反響器的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物又可無限生殖,故具有投資本錢低、藥物開發(fā)周期短和經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)點(diǎn).可以說轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的問世,為利用基因工程手段獲得低本錢、高活性和高表達(dá)的藥物開拓了一條重要途徑.作為生物反響器的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,主要是利用其乳腺組織和血液組織進(jìn)展定位表達(dá),特別是用乳腺組織生產(chǎn)具有生物活性的多肽藥物和具有特別養(yǎng)分意義的蛋白質(zhì),已成為一個(gè)興的轉(zhuǎn)基因制藥業(yè).至今已在以下動(dòng)物的乳汁中生產(chǎn)出一些人類蛋白質(zhì)藥物:牛奶中有抗凝血酶、纖維蛋白原、人血清白蛋白、膠原蛋白、生育激素、乳缺蛋白、糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋白C等,山羊奶中有抗凝血酶原、抗胰蛋白酶、生育激素、血清白蛋白、組織型纖維溶原激活因子、單克隆抗體,綿羊奶中有抗胰蛋白酶、凝血因子IX、纖維蛋白原、蛋白質(zhì)C,豬奶中亦有蛋白質(zhì)CIX[11].我國(guó)在這方面的爭(zhēng)論也很活潑,并取得了一些成果.早在2023年黃淑幀等成功制備了5IX基因)整合的轉(zhuǎn)基因羊(32120239月產(chǎn)下小羊羔,進(jìn)入泌乳期,其乳汁中含有活性的人凝血因子IX蛋白,這種凝血因子是治療血友病的貴重藥物[12].而近幾年來的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物更是如雨后春筍般的涌現(xiàn)出來,如潘玲、黃俊成和黃英等,分別在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中成功地表達(dá)了人促紅細(xì)胞生成素、人胰島素原和人血清白蛋白.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物除了可在生產(chǎn)基因工程藥物方面發(fā)揮重要作用外,還可用于建立診斷和治療人類疾病的動(dòng)物模型、生產(chǎn)可用于人體器官移植的動(dòng)物器官等方面.863高科技展覽中展現(xiàn)的長(zhǎng)有“人耳“的小鼠顯示了這方面的良好前景,這將有效地解決器官異體移植的生理適應(yīng)難度大的問題和大幅度地降低器官異體移植的本錢.動(dòng)物細(xì)胞培育動(dòng)物細(xì)胞培育是指離散的動(dòng)物活細(xì)胞在體外人工條件下的生長(zhǎng)、增殖的過程.動(dòng)物細(xì)胞培育開頭于本世紀(jì)初.1962年,其規(guī)模開頭擴(kuò)大,進(jìn)展至今已成為生物、醫(yī)學(xué)爭(zhēng)論和應(yīng)用中廣泛承受的技術(shù)方法,利用動(dòng)物細(xì)胞培育生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價(jià)值的酶、生長(zhǎng)因子、疫苗和單抗等,已成為醫(yī)藥生物高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要局部[13].利用動(dòng)物細(xì)胞培育技術(shù)生產(chǎn)的生物制品已占世界生物高技術(shù)產(chǎn)品市場(chǎng)份額的50%[14].大量資料說明,生物技術(shù)藥物是當(dāng)前藥開發(fā)的重要領(lǐng)域,生物技術(shù)制藥工業(yè)是下一個(gè)10年制藥工業(yè)的重要門類,期間將有數(shù)百種生物技術(shù)藥上市[15].動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培育技術(shù)是生物技術(shù)制藥中格外重要的環(huán)節(jié).目前,動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培育技術(shù)水平的提高主要集中在培育規(guī)模的進(jìn)一步擴(kuò)大、優(yōu)化細(xì)胞培育環(huán)境、轉(zhuǎn)變細(xì)胞特性、提高產(chǎn)品的產(chǎn)率與保證其質(zhì)量上[16].三、制造實(shí)例如今,利用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的生物制品已日益增多.美國(guó)自20233325下面就幾個(gè)在動(dòng)物細(xì)胞工程制藥的進(jìn)展史上具有重要意義的產(chǎn)品進(jìn)展介紹.類淋巴細(xì)胞干擾素類淋巴細(xì)胞干擾素是由一株從Burkitt淋巴瘤的患者獵取Namalva細(xì)胞生產(chǎn)的干擾素,它含80%左右的IFN-α,20%左右的IFN-β.該干擾素首先由英國(guó)的Wellcome公司的Fante和Finter8000L1986先在英國(guó)獲準(zhǔn)進(jìn)入市場(chǎng),商品名為“Wellferon“.2023Wellferon獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入美國(guó).該干擾素獲準(zhǔn)生產(chǎn)在動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)展技術(shù)史上是一個(gè)很重要的里程碑,由于這是第一個(gè)獲準(zhǔn)用腫瘤細(xì)胞系生產(chǎn)的人用藥品.類淋巴細(xì)胞干擾素的生產(chǎn)工藝大致如下:先將細(xì)胞逐級(jí)放大4000L8000LRPMI164010%小牛血清.培育方式主要是攪拌式批次培育,當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)1×106/ml2nmol/L48h,接著用仙臺(tái)病毒(50HAU/ml)誘生,18h后冷卻至5~10℃,收集培育液,連續(xù)離心分別細(xì)胞,對(duì)上清液進(jìn)展分別純化.類淋巴細(xì)胞干擾素已被廣泛應(yīng)用于臨床治療多種病毒性疾病,如乙型肝炎、丙型肝炎,以及多種腫瘤病的治療,如毛細(xì)血管白血病、Kaposi肉瘤等.組織型纖溶酶原激活劑據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),各種血栓病已成為很多國(guó)家人口死亡和致殘的第一位緣由.我國(guó)患各種血栓病的患者估量在1300萬以上.對(duì)于血栓病的治療方法多種多樣,但目前主要的療法仍是溶血栓法.組織型纖溶酶原激活劑做為其次代特異性的溶栓藥1987年被FDA批準(zhǔn)上市.它是由美國(guó)Genetich公司用CHO細(xì)胞表達(dá)的,也是第一個(gè)用動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培育生產(chǎn)的基因工程產(chǎn)品.尿激酶原作為其次代的又一個(gè)特異性的溶栓藥,單鏈尿型纖溶酶原激活劑-尿激酶原目前在很多國(guó)家進(jìn)展臨床Ⅲ期試驗(yàn),估量不久即可上市.在國(guó)內(nèi),南京大學(xué)是用大腸桿菌表達(dá)的,而軍事科學(xué)院生物工程爭(zhēng)論所則是用CHO細(xì)胞表達(dá)的,目前正和天津天士力公司一起進(jìn)展試驗(yàn).尿激酶原是一種堿性蛋白,具有特異的溶血栓作用,具有很好的進(jìn)展前景.促紅細(xì)胞生成素促紅細(xì)胞生成素,又稱血細(xì)胞生成素、紅細(xì)胞刺激因子,是一種酸性糖蛋白,是第一個(gè)被覺察并批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床的造血生長(zhǎng)因子,也是迄今為止產(chǎn)值最高的基因工程產(chǎn)品.它主要用于多種貧血,包括慢性腎衰性貧血、惡性腫瘤放療和化療引起的貧血等.由于該藥的用量很小,因此有的單位仍承受傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝.也有單位為了到達(dá)高產(chǎn)目的,承受了固定化灌流培育的生產(chǎn)工藝.凝血因子Ⅷ由先天性缺乏凝血因子Ⅷ而引起的出血稱為甲型血友病,早期治療承受輸入全血或血漿,但由于血漿內(nèi)凝血因子Ⅷ的濃度很低,因此效果不抱負(fù).20世紀(jì)80年月以后,承受單克隆抗體親和層析,使產(chǎn)品的純度進(jìn)一步提高.尤其是由于爭(zhēng)論成功了一系列血漿的病毒滅菌法后,使由血漿制備的“極純“產(chǎn)品,如Monoclate乙型肝炎疫苗乙型肝炎是由乙肝病毒引起的,約占全部病毒性肝炎的40%,它可以急性發(fā)病也可以形成慢性肝炎,并進(jìn)而引發(fā)肝硬化、肝癌,而其中很大的一局部人是安康的病毒攜帶者,不消滅病癥,但外表抗原陽性,常常是重要的傳染源.在我國(guó),這樣的慢性病毒攜帶者約有一億人,是對(duì)公共衛(wèi)生的一個(gè)重要威逼.至今已被批準(zhǔn)的乙肝工程疫苗有兩種宿主細(xì)胞的,一種是酵母表達(dá)的,另一種是CHO細(xì)胞表達(dá)的.我國(guó)病毒爭(zhēng)論所的任貴方等在1987年就爭(zhēng)論成功了用CHO細(xì)胞表達(dá)的疫苗.他們用的是NBS公司生產(chǎn)的微載體籃式生物反響器連續(xù)灌注培育CHO細(xì)胞,然后以14000r/min連續(xù)離心去除細(xì)胞殘骸提取上清,再ButylSSepharoseFastFlow-SephadexG25脫鹽-DEAESepharoseFastFlow陰離子交換柱層析-Sepharose4FastFlow[17].四、展望動(dòng)物細(xì)胞工程制藥是從疫苗開頭的,迄今已有悠久的歷史.動(dòng)物細(xì)胞工程制藥中目前運(yùn)用的主要手段有:細(xì)胞融合、核移植、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、細(xì)胞培育等.隨著細(xì)胞工程技術(shù)爭(zhēng)論的不斷深入,我們必能開發(fā)出更具有安全性,有效性的技術(shù)手段.目前已研發(fā)的細(xì)胞產(chǎn)品實(shí)例主要有類淋巴細(xì)胞干擾素,組織型纖溶酶原激活劑,尿激酶原,促紅細(xì)胞生成素,凝血因子Ⅷ,乙型肝炎疫苗.隨著連續(xù)深入的爭(zhēng)論,更多的不同構(gòu)造的細(xì)胞產(chǎn)品將應(yīng)用于臨床.動(dòng)物細(xì)胞工程不僅可大量工業(yè)生產(chǎn)自然稀有的藥物,而且其產(chǎn)品具有高效性和對(duì)疾病鮮亮的針對(duì)性.因而,動(dòng)物細(xì)胞工程藥物的進(jìn)展必將給制藥工業(yè)帶來一次革命性飛躍,在人類的醫(yī)療保健中發(fā)揮越來越重要的作用.作為現(xiàn)代生物技術(shù)之一的細(xì)胞工程技術(shù)在近半個(gè)世紀(jì)來突如通過細(xì)胞融合技術(shù)形成的雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體已廣泛用于臨床治療,并顯示出獨(dú)特的療效,獲得了很好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益.隨著細(xì)胞工程技術(shù)爭(zhēng)論的不斷深入,它的前景及其產(chǎn)生的影響將會(huì)日益地顯示出來.[1]李剛,劉鵬,劉誠(chéng)迅等.我國(guó)細(xì)胞工程制藥的爭(zhēng)論現(xiàn)狀和進(jìn)展前景[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志.2023,8,19(4):278.[2]胡顯文,肖成祖.細(xì)胞工程在生物制藥工業(yè)中的地位[J].生物技術(shù)通訊.2023,5,12(2):118.[3]唐祖明,鄭紀(jì)山,肖中黨等.甲肝病毒單克隆抗體的研制與應(yīng)用[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2023,30(5):21.[4]姚彩霞,李滬霞.抗人IgM單克隆抗體的爭(zhēng)論-脾內(nèi)免疫建立抗人IgM單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株[J].微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展,2023,26(1):66.劉彥君,王皓,衛(wèi)立辛等.人肝癌細(xì)胞與自體激活B淋巴細(xì)胞融合制備腫瘤疫苗[J].其次軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2023,19(6