臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)新技術(shù)

熒光定量PCR

所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒

光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析

的方法。

技術(shù)原理：將標(biāo)記有蓑光素的Taqman探針與模板DNA混合后，完成高溫變

性，低溫復(fù)性，適溫延伸的熱循環(huán)，并遵守聚合酶鏈反應(yīng)規(guī)律,與模板DNA互補(bǔ)

配對的Taqman探針被切斷，熒光素游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下發(fā)出熒

光，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實(shí)時(shí)檢

測與之對應(yīng)的隨擴(kuò)增而變化熒光信號強(qiáng)度，求得CT值，同時(shí)利用數(shù)個(gè)已知模板

濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作對照，即可得出待測標(biāo)本目的基因的拷貝數(shù)。

臨床應(yīng)用：各型肝炎、艾滋病、禽流感、結(jié)核、性病等傳染病診斷和療效評

價(jià)；地中海貧血、血友病、性別發(fā)育異常、智力低下綜合癥、胎兒畸形等優(yōu)生優(yōu)

育檢測；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測實(shí)現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實(shí)現(xiàn)遺傳病診

斷。檢測種類涉及多種病原體，從細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體、真菌、立克次

體、螺旋體到寄生蟲。

流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是一種在功能水平上對單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量

分析和分選的檢測手段，它可以高速分析上萬個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測

得多個(gè)參數(shù)，與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn),

成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。

技術(shù)原理：將待測細(xì)胞經(jīng)特異性熒光染料染色后放入樣品管中，在氣體的壓

力下進(jìn)入充滿鞘液的流動(dòng)室。在液的約束下細(xì)胞排成單列由流動(dòng)室的噴嘴噴出，

形成細(xì)胞柱,后者與入射的激光束垂直相交,液柱中的細(xì)胞被激光激發(fā)產(chǎn)生熒光。

儀器中一系列光學(xué)系統(tǒng)（透鏡、光闌、濾片和檢測器等）收集熒光、光散射、光

吸收或細(xì)胞電組抗等信號，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行收集、儲存、顯示并分析被測定的各

種信號，對各種指標(biāo)做出統(tǒng)計(jì)分析。

臨床應(yīng)用：可用于白血病的分型、腫瘤細(xì)胞染色體的異倍性測定，以及免疫

學(xué)研究，并已開始用于細(xì)菌鑒定，病毒感染細(xì)胞的識別和艾滋病感染者T4、T8

細(xì)胞的記數(shù)。

FCM通過熒光抗原抗體檢測技術(shù)對細(xì)胞表面抗原分析，進(jìn)行細(xì)胞分類和亞群

分析。這一技術(shù)對于人體細(xì)胞免疫功能的評估以及各種血液病及腫瘤的診斷和治

療有重要作用。目前FCM用的各種單克隆抗體試劑已經(jīng)發(fā)展到了百余種，可以對

各種血細(xì)胞和組織細(xì)胞的表型進(jìn)行測定分析。

一、在血液病診斷和治療中的應(yīng)用

FCM通過對外周血細(xì)胞或骨髓細(xì)胞表面抗原和DNA的檢測分析，對白血病等

各種血液病的診斷、預(yù)后判斷和治療起著舉足輕重的作用。

二、在血栓與出血性疾病中的應(yīng)用

FCM可以通過單抗免疫熒光標(biāo)記（血小板膜糖蛋白Hb/HIa,CD62,CD63等）

監(jiān)測血小板功能及活化情況，有利于血栓栓塞性疾病的診斷和治療。而用FCM

測定鈣離子濃度，可以作為活化血小板監(jiān)測的非免疫性指標(biāo)。

FCM可以測定血小板相關(guān)抗體含量，用于診斷及治療監(jiān)測，具有檢測速度快、

靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

酶聯(lián)免疫分析技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA)技術(shù)自

20世紀(jì)70年代初問世以來，發(fā)展非常迅速，目前被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、醫(yī)學(xué)、

生物學(xué)等許多領(lǐng)域。ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)

與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。

技術(shù)原理：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是一種固相免疫測定技術(shù)，其先將抗體或抗原

包被到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。測定時(shí)，將待檢樣本和酶標(biāo)抗原

或抗體按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，后加入酶標(biāo)抗體

與免疫復(fù)合物結(jié)合，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離的未結(jié)合成分，最

后加入酶反應(yīng)底物，根據(jù)底物被酶催化產(chǎn)生的顏色及其吸光度(A)值的大小進(jìn)行

定性或定量分析的方法。

根據(jù)檢測目的和操作步驟不同，有雙抗體夾心法、間接法、競爭法三種類型

的常用方法。

臨床應(yīng)用：ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病

原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。

1、病原體及其抗體的檢測病毒感染如肝炎病毒，巨細(xì)胞病毒，風(fēng)疹病毒,

皰疹病毒，輪狀病毒，艾滋病病毒(HIV)等。細(xì)菌感染如鏈球菌，布氏桿菌等。

寄生蟲感染如阿米巴、弓形蟲、錐蟲等。

2、蛋白質(zhì)如各種免疫球蛋白，腫瘤標(biāo)志物如甲胎蛋白、癌胚抗原、前列

腺堿性磷酸酶，激素如hCG,FSH,TSH,hGH,酶如肌酸激酶-MB,其他蛋白質(zhì)如

鐵蛋白等。

3、非肽類激素如T3,T4,雌二醇，皮質(zhì)醇等。

4、藥物治療心臟病藥物如地高辛，抗哮喘藥物如茶堿，抗生素如慶大霉

素等。

免疫印跡技術(shù)

免疫印跡法(Westernblotting)是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)

分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)

基本原理：免疫印跡與DNA的Southern印跡技術(shù)相對應(yīng)，兩種技術(shù)均把電

泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相載體(通常為NC膜)，然后用探針檢測特異

性組分。不同的是，Westernblot所檢測的是抗原類蛋白質(zhì)成分，所用的探針

是抗體，它與附著于固相載體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。該技

術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測定特異敏感等諸多優(yōu)點(diǎn)，具有從復(fù)雜混

合物中對特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測，以及從多克隆抗體中檢測出單克隆抗體

的優(yōu)越性。

臨床應(yīng)用：免疫印跡法具有分析容量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是檢

測蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用的方法，如組織抗原的定性定量檢測、

多肽分子的質(zhì)量測定及病毒的抗體或抗原檢測等。用免疫印跡技術(shù)可定性、定量

地檢測出待檢樣品中含量很低的特定病原體的抗原成分，對于一些能感染細(xì)胞而

細(xì)胞病變不易觀察的病原體的檢測也很有用。用單克隆抗體做為第一抗體進(jìn)行免

疫印跡，還可以對毒株做分型研究。

時(shí)間分辨熒光分析法

時(shí)間分辨熒光分析法（Timeresolvedfluoroisnmunoassay,TRFIA）是近

十年發(fā)展起來的非同位素免疫分析技術(shù)，是目前最先進(jìn)的免疫檢測技術(shù)。

技術(shù)原理：使用三價(jià)稀土離子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）作為示蹤物，

通過這些稀土離子與具有雙功能結(jié)構(gòu)的螯合劑以及抗原形成稀土離子-螯合劑-

抗原螯合物。當(dāng)標(biāo)記抗原、待測抗原共同競爭抗體，形成免疫復(fù)合物，由于免疫

復(fù)合物中抗原抗體結(jié)合部分就含有稀土離子，當(dāng)采取一些辦法將結(jié)合部分與游離

部分分開后，利用時(shí)間分辨熒光分析儀，即可測定復(fù)合物中的稀土離子發(fā)射的熒

光強(qiáng)度，從而確定待測抗原的量。

正常情況下，免疫復(fù)合物中的稀土離子自身熒光信號很微弱，若加入一種酸

性增強(qiáng)液，稀土離子從免疫復(fù)合物中解離出來，和增強(qiáng)液中的B-二酮體、三正

辛基氧化瞬、TritonX-100等成分形成一種微囊。后者被激發(fā)光激發(fā)后，則稀

土離子可以發(fā)出長壽命的極強(qiáng)的熒光信號，使原來微弱的熒光信號增強(qiáng)將近100

萬倍o

采用時(shí)間分辨技術(shù)測量熒光，采用了門控技術(shù)，它是使背景熒光信號降低到

零以后，再測定長壽命標(biāo)記物的熒光。

臨床應(yīng)用：時(shí)間分辨熒光免疫分析可用來檢測生物活性物質(zhì)。在內(nèi)分泌激素

的檢測，腫瘤標(biāo)志物的檢測，抗體檢測，病毒抗原分析，藥物代謝分析以及各種

體內(nèi)或外源性超微量物質(zhì)的分析中，應(yīng)用TRFIA法越來越普遍。近年來，已將這

項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于核酸探針分析和細(xì)胞活性分析、生物大分子分析，發(fā)展十分迅速。

一、TRFIA法在內(nèi)分泌學(xué)中的應(yīng)用

內(nèi)分泌激素是一些活性小分子,它們能與適當(dāng)?shù)目贵w反應(yīng)，具有免疫反應(yīng)性，

但不能產(chǎn)生抗體，不具有免疫原性，它們屬于半抗原。對這些半抗原的測定，一

般多用競爭性時(shí)間分辨熒光免疫法測定。這方面的測定主要有血清中孕酮、雌二

醇、睪酮、甲狀腺激素、前列腺素的測定等等。

二、TRFIA在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用

對一些完全抗原，它們大多是既有免疫反應(yīng)性又有免疫原性的蛋白質(zhì)類，主

要包括促甲狀腺激素、血清胰島素、血清癌胚抗原、血清甲胎蛋白、乙型肝炎表

面抗原等，主要采用非競爭性TRFIA法進(jìn)行測定。

三、TRFIA法在免疫學(xué)中的應(yīng)用

某些免疫細(xì)胞（如NK、LAK、T殺傷細(xì)胞等）的活性，可以用TRFIA法來檢

測。

四、TRFIA法在微生物學(xué)中的應(yīng)用

目前TRFIA已廣泛應(yīng)用于乙型肝炎病毒、腦炎病毒、流感病毒、呼吸道合胞

體病毒（RSV）、副粘病毒、風(fēng)疹病毒、馬鈴薯病毒、輪狀病毒、人類免疫缺陷

病毒（HIV）、出血熱病毒和梅毒螺旋體的抗原抗體以及某些細(xì)菌和寄生蟲抗體

的檢測。最近,潘利華等用TRFIA法進(jìn)行了人血清中丙型肝炎病毒抗體（Anti-HCV）

的檢測，效果明顯高于酶聯(lián)免疫法。

飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)

飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，給臨床腫瘤早期標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)帶來了劃時(shí)代的革

命，它將傳統(tǒng)的通常一次只能測定一個(gè)蛋白標(biāo)志物革命性地發(fā)展到一次可測定數(shù)

十個(gè)，甚至數(shù)百個(gè)蛋白，同時(shí)極大的提高了診斷的靈敏度和特異性。

技術(shù)原理：質(zhì)譜儀需要在真空情況下運(yùn)轉(zhuǎn)，用以保護(hù)檢測器，同時(shí)提高測量

精度。在實(shí)際使用中，一個(gè)微孔需要被使用。儀器中氣體樣本首先通過微孔取樣,

然后到達(dá)離子源，有脈沖電場送入飛行時(shí)間模塊。然后使用垂直于送入方向的脈

沖電場對離子進(jìn)行加速。這樣做的主要目的是確定所有離子在水平方向沒有初速

度。在u型飛行之后，達(dá)到傳感器。不同離子到達(dá)傳感器的時(shí)間不同，借此來選

擇m/z。通常的假設(shè)認(rèn)為離子只能帶一個(gè)電荷，如此，得到的信號，直接對應(yīng)檢

測到離子的相對原子質(zhì)量。

臨床應(yīng)用：在腫瘤早期診斷中的研究進(jìn)展——液體芯片一飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)

利用磁珠俘獲腫瘤患者與健康對照體液中低豐度特異蛋白或多肽，經(jīng)飛行時(shí)間質(zhì)

譜測定和軟件分析，建立由兩者差異表達(dá)蛋白或多肽組成的質(zhì)譜圖模型，可對潛

在的生物標(biāo)記物進(jìn)行鑒定。

化學(xué)發(fā)光免疫分析

化學(xué)發(fā)光免疫分析（chemiluminescenceimmunoassay,CLIA）,是將具有高靈

敏度的化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合的檢測分析技術(shù)。是繼放

免分析、酶免分析、熒光免疫分析和時(shí)間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項(xiàng)

最新免疫測定技術(shù)。靈敏度高是化學(xué)發(fā)光免疫分析關(guān)鍵的優(yōu)越性。

技術(shù)原理：化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)經(jīng)催化劑的催化和氧化劑

的氧化，形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間體，當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)，同

時(shí)發(fā)射出光子（hM）,利用發(fā)光信號測量儀器測量光量子產(chǎn)額。免疫反應(yīng)系統(tǒng)將發(fā)

光物質(zhì)（在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體）直接標(biāo)記在抗原（化學(xué)發(fā)光免疫分析）

或抗體（免疫化學(xué)發(fā)光分析）上，或酶作用于發(fā)光底物。

臨床應(yīng)用：用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥

物腫瘤標(biāo)記物、內(nèi)分泌功能、傳染性疾病等多種檢測項(xiàng)目。

生物芯片

生物芯片技術(shù)起源于核酸分子雜交。所謂生物芯片一般指高密度固定在互相

支持介質(zhì)上的生物信息分子（如基因片段、DNA片段或多肽、蛋白質(zhì)、糖分子、

組織等）的微陣列雜交型芯片，陣列中每個(gè)分子的序列及位置都是已知的，并且

是預(yù)先設(shè)定好的序列點(diǎn)陣。

技術(shù)原理：生物芯片是根據(jù)生物分子間特異相互作用的原理，將生化分析過

程集成于芯片表面，從而實(shí)現(xiàn)對DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)以及其他生物成分

的高通量快速檢測。狹義的生物芯片概念是指通過不同方法將生物分子（寡核甘

酸、cDNA、genomicDNA、多肽、抗體、抗原等）固著于硅片、玻璃片（珠）、

塑料片（珠）、凝膠、尼龍膜等固相遞質(zhì)上形成的生物分子點(diǎn)陣。

臨床應(yīng)用：從正常人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出

標(biāo)準(zhǔn)圖譜。從病人的基因組中分離出DNA與DNA芯片雜交就可以得出病變圖

譜。通過比較、分析這兩種圖譜，就可以得出病變的DNA信息。這種基因芯片

診斷技術(shù)以其快速、高效、敏感、經(jīng)濟(jì)、平行化、自動(dòng)化等特點(diǎn)，將成為一項(xiàng)現(xiàn)

代化診斷新技術(shù)。

免疫濁度法

免疫濁度法本質(zhì)上屬于液體內(nèi)沉淀反應(yīng)，其特點(diǎn)是將現(xiàn)代光學(xué)測量儀器、自

動(dòng)化檢測系統(tǒng)和免疫沉淀反應(yīng)相結(jié)合，可進(jìn)行液體中微量抗原、抗體及小分子半

抗原定量檢測。

技術(shù)原理：當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體在兩者比例合適時(shí)，抗原抗體在特殊緩

沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度，如形成的復(fù)合物增加，反

應(yīng)液的濁度隨之增加，與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可計(jì)算出受檢物的含量。

臨床應(yīng)用：

1、免疫功能監(jiān)測：免疫球蛋白G、A、M,免疫球蛋白輕鏈K、入，補(bǔ)體C3、

C4測定。

2、心血管疾病監(jiān)測:載脂蛋白A、B,脂蛋白(a),C-反應(yīng)蛋白等。

3、炎癥狀況監(jiān)測:C-反應(yīng)蛋白，a-酸性糖蛋白，觸珠蛋白，銅藍(lán)蛋白等。

4、風(fēng)濕性疾病檢測：ASO、RF、CRP

5、腎臟功能檢測：尿微量白蛋白，a-微球蛋白，B-微球蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，

免疫球蛋白G等。

6、營養(yǎng)狀態(tài)監(jiān)測：白蛋白，前白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白等。

7、凝血及出血性疾病的檢測：抗凝血酶ni,轉(zhuǎn)鐵蛋白，觸珠蛋白等。

8、血腦屏障監(jiān)測：腦脊液白蛋白，免疫球蛋白G、A、Mo

免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

技術(shù)原理：利用物質(zhì)吸收光能后，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)而發(fā)光的特性。將具有這種特

性的熒光素（異硫氟熒光黃或羅丹明B200）用化學(xué)方法結(jié)合在特異的抗體或抗原

上，又不損害其抗體或抗原活性的一種熒光顯微鏡下的示蹤技術(shù)?？贵w與抗原的

結(jié)合是高度特異的，所以只要知道其中的一種因子，也就知道了另一種因子。

技術(shù)特點(diǎn)：

1、特異的抗原抗體反應(yīng)，并與形態(tài)學(xué)相結(jié)合，增加試驗(yàn)的特異性和敏感性。

2、利用了物理、化學(xué)、組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物學(xué)等綜合性技術(shù)，使免疫熒

光技術(shù)成為一種獨(dú)立完整的一門方法學(xué)。

3、一種熒光抗體可以檢查多種抗原抗體復(fù)合物。

4、只要知道一種抗體或抗原，就可以知道其對應(yīng)的抗原或抗體。

臨床應(yīng)用：

1、在細(xì)菌診斷中的應(yīng)用：主要用于鑒定細(xì)菌和對抗原結(jié)構(gòu)的研究。如對甲

型鏈球菌的快速診斷和分型鑒定，腦膜炎雙球菌的快速診斷等。

2、在寄生蟲學(xué)診斷中的應(yīng)用：可用已知的寄生蟲抗原，檢查血清中的抗體,

用于寄生蟲病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。也可用于寄生蟲感染的免疫學(xué)和發(fā)病機(jī)理

等方面的研究。

3、在病毒學(xué)診斷中的應(yīng)用：快速診斷中對流感病毒、乙腦、狂犬病、脊髓

灰白質(zhì)炎、恙蟲病等的快速檢出；也可用來檢查血清中的抗病毒抗體。

4、在免疫病理方面的應(yīng)用：檢查球蛋白的沉積，特別是對于復(fù)合物病如：

腎小球腎火、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等利用補(bǔ)體熒光法測定復(fù)合物沉著的位

置，以了解病變侵犯部位和病變基礎(chǔ)。

5、血液中B及T細(xì)胞的鑒定。

6、激素和酶的局部組織定位。

7、一些器官移植抗原鑒定。

8、組織中免疫球蛋及補(bǔ)體組分的檢測。

9、在診斷自身免疫病方面的應(yīng)用：

（1）抗核抗體（ANA）：是自身免疫性疾病最常出現(xiàn)的一種抗體，特別是系統(tǒng)

性紅斑狼瘡，陽性率更高。其它如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病、慢性肝炎等血中亦

可出現(xiàn)較高效價(jià)的抗體。

（2）抗線粒體抗體：在慢性活動(dòng)性肝炎患者中，如抗體效價(jià)在1：256以上

可以認(rèn)為是自身免疫性肝炎。原發(fā)性膽汁性肝硬化約有98%出現(xiàn)線粒體抗體，

慢性活動(dòng)性肝炎在31%左右。線粒體抗體在膠原性疾病中可見（2-8%）且效價(jià)

遠(yuǎn)較自身免疫性肝炎低。

（3）抗平滑肌抗體：這是對平滑肌組織的特異性抗體，沒有器官和種屬特

異性。其臨床意義對于自身免疫性肝炎約82%,急性肝炎早期也可出現(xiàn)抗平滑

肌抗體，有人報(bào)告早于HBsAg