酶工程動植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

酶工程動植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細胞結(jié)構(gòu)第2頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

植物、動物、微生物細胞的特性比較細胞種類植物細胞微生物細胞動物細胞細胞大小/um200～3001～1010～100倍增時間/h﹥120.3-6﹥15營養(yǎng)要求簡單簡單復雜光照要求大多數(shù)要求不要求不要求對剪切力敏感大多數(shù)不敏感非常敏感主要產(chǎn)物色素、藥物、香精、酶等醇、有機酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、酶等疫苗、激素、單克隆抗體、酶等第3頁,共25頁，2024年2月25日，星期天三者之間的差異主要有：植物細胞>動物細胞>微生物細胞。動物細胞、植物細胞的生產(chǎn)周期比微生物長。植物細胞和微生物細胞的營養(yǎng)要求較簡單。植物細胞的生長以及次級代謝物的生產(chǎn)要求一定的光照。植物細胞和動物細胞對剪切力敏感。植物、微生物和動物細胞的主要目的產(chǎn)物各不相同。第4頁,共25頁，2024年2月25日，星期天一、植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶從外植體中→選育植物細胞→高產(chǎn)穩(wěn)定細胞→培養(yǎng)→各種產(chǎn)物

1.植物細胞培養(yǎng)的特點提高產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量縮短周期易于管理

第5頁,共25頁，2024年2月25日，星期天2.培養(yǎng)基特點

①需要大量無機鹽②需多種維生素和激素③氮源一般為無機氮④一般以蔗糖為碳源應用最廣的是MS培養(yǎng)基和LS培養(yǎng)基

MS培養(yǎng)基是1962年為煙草細胞培養(yǎng)而設計的培養(yǎng)基。LS培養(yǎng)基是在其基礎上演變而來的。P82表3-3第6頁,共25頁，2024年2月25日，星期天3.培養(yǎng)工藝：——懸浮細胞培養(yǎng)⑴工藝流程外植體→細胞的獲取→細胞培養(yǎng)→分離→純化產(chǎn)物①外植體選擇和處理選取那些無病蟲害、生長旺盛、生長規(guī)則植株，把莖、葉、根、芽，花、果實等切成小片段或小塊。用70%-75%乙醇，0.1%升汞消毒，無菌水漂洗。第7頁,共25頁，2024年2月25日，星期天外植體：

從植株取出，經(jīng)過預處理后，用于植物組織培養(yǎng)的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實、種子等）的片段或小塊。愈傷組織：

將上述外植體植入誘導培養(yǎng)基中，于25℃左右培養(yǎng)一段時間，從外植體的切口部位長出小細胞團。第8頁,共25頁，2024年2月25日，星期天水稻的外植體（幼胚）和愈傷組織外植體愈傷組織第9頁,共25頁，2024年2月25日，星期天②植物細胞獲取直接分離法愈傷組織誘導法原生質(zhì)體再生法③細胞懸浮培養(yǎng)：轉(zhuǎn)新培養(yǎng)基，在生物反應器中進行培養(yǎng)④分離純化：生化技術(shù)機械法酶法第10頁,共25頁，2024年2月25日，星期天⑵培養(yǎng)條件的影響與控制①溫度：室溫25℃②pH：微酸性范圍。即pH

5.0-6.0③通氣與攪拌④光照的控制：強度和時間有一定要求⑤前體的添加（飼喂）⑥刺激劑的應用第11頁,共25頁，2024年2月25日，星期天4.植物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶實例以大蒜細胞培養(yǎng)生產(chǎn)超氧化物歧化酶（SOD）為例(1)大蒜愈傷組織的誘導

選取結(jié)實、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后無菌水漂洗3次。在無菌條件下，切成0.5cm3的小塊，植入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的半固體MS培養(yǎng)基中，在25℃，600lux，12h/d光照條件下培養(yǎng)18d，誘導得到愈傷組織，每18天繼代一次。第12頁,共25頁，2024年2月25日，星期天(2)大蒜懸浮細胞培養(yǎng)

將上述在半固體MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)18d的愈傷組織，在無菌條件下轉(zhuǎn)入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA（芐基腺嘌呤）的液體MS培養(yǎng)基中，加入滅菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照條件下震蕩培養(yǎng)18d，使愈傷組織分散成為小細胞團或單細胞。然后在無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小細胞團或單細胞轉(zhuǎn)入含有3mg/L2,4-D和1.2mg/L6-BA的液體MS培養(yǎng)基中，25℃,600lux，12h/d光照條件下震蕩培養(yǎng)18d。第13頁,共25頁，2024年2月25日，星期天(3)酶的分離純化細胞培養(yǎng)完成后，收集細胞，經(jīng)過細胞破碎、提取、分離得到超氧化物歧化酶。第14頁,共25頁，2024年2月25日，星期天二、動物細胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

1.動物細胞培養(yǎng)的特點動物細胞可以產(chǎn)生各種有效高價值的物質(zhì)需添加抗生素（常用青霉素和鏈霉素聯(lián)合）細胞生長速度慢細胞體積大，無細胞壁保護，對剪切力敏感。反應過程成本高，產(chǎn)品價格貴細胞具有錨地依賴性。宜采用貼壁培養(yǎng)原代細胞一般繁殖50代第15頁,共25頁，2024年2月25日，星期天2.培養(yǎng)方式

(1)懸浮培養(yǎng)(2)貼壁培養(yǎng)

滾瓶培養(yǎng)

微載體培養(yǎng)(microcarrierculture)(3)固定化細胞培養(yǎng)包埋(entrapment)和中空纖維(microencapsulation)培養(yǎng)第16頁,共25頁，2024年2月25日，星期天3.工藝控制

⑴工藝流程種質(zhì)細胞（體細胞；雜交瘤細胞）分散成懸浮細胞細胞懸浮或貼壁培養(yǎng)收集分離純化產(chǎn)物胰蛋白酶消化第17頁,共25頁，2024年2月25日，星期天⑵培養(yǎng)條件的影響與控制①溫度：一般控制在36.5℃.②pH值：一般控制在7.0-7.6的微堿性范圍內(nèi)。③滲透壓:應與細胞內(nèi)滲透壓相同。④溶解氧：根據(jù)情況隨時調(diào)節(jié)。第18頁,共25頁，2024年2月25日，星期天4.產(chǎn)酶實例以人黑色素瘤細胞培養(yǎng)生產(chǎn)組織纖溶酶原激活劑為例纖溶酶原纖溶酶纖溶酶原激活劑第19頁,共25頁，2024年2月25日，星期天①種質(zhì)細胞用胰蛋白酶處理，分散，pH7.4磷酸鹽洗滌。稀釋成細胞懸浮液②接種到反應器中，與37℃CO2培養(yǎng)箱中，長成致密單層③去培養(yǎng)液，用pH7.4磷酸鹽沖洗細胞④換無血清Eagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)⑤每3-4天，取出培養(yǎng)液分離純化⑥再加新鮮Eagle培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)⑦親和層析進行分離第20頁,共25頁，2024年2月25日，星期天細胞生產(chǎn)滾瓶培養(yǎng)裝置第21頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第22頁,共25頁，2024年2月25日，星期天

第一章

作業(yè)：1.概念酶活力單位酶比活力2.酶工程的主要任務和主要內(nèi)容是什么？3.寫出酶活力測定的一般步驟。

第23頁,共25頁，2024年2月25日，星期天第二章

作業(yè)：1.概念：產(chǎn)物阻遏；分解代謝物阻遏；酶合成的誘導2.提高酶產(chǎn)量的策措施有哪些？3.試述發(fā)酵過程中對溶解氧進行控制的必要性及其依據(jù)。4.影響酶生物合成模式的主要因素是什么？5.優(yōu)良產(chǎn)酶菌種應具備哪些條件？第24