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熒光熒光顯微鏡和熒光分光光度計(jì)1熒光和熒光素
利用較短波長(zhǎng)的光(激發(fā)光)照射樣品,使樣品受到高能量激發(fā),產(chǎn)生較長(zhǎng)波長(zhǎng)的熒光(發(fā)射光),用來(lái)觀察和分辨樣品中產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的成分和位置。第2頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天第3頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天2常見(jiàn)熒光素:
(1)異硫氰酸熒光素(fluorescein
isothiocyanate,
FITC)
(2)四乙基羅丹明
(rhodamine,
RB200)
(3)四甲基異硫氰酸羅丹明
(tetramethyl
rhodamine
isothiocynate,
TRITC)
(4)鑭系
(5)藻紅蛋白(P-phycoerythrin,PE)(6)多甲藻葉綠素蛋白
(peridinin
chlorophyll
protein,
PerCP)(7)碘化丙啶(
propidium
iodide,PI)第4頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天第5頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天第6頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天3合適熒光素的選擇:
具有與蛋白質(zhì)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。
熒光效率高,標(biāo)記后下降不明顯。
熒光色澤與背景色澤對(duì)比鮮明。
標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性。標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、快速。
安全無(wú)毒第7頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天4熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)
熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學(xué)顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎(chǔ)上組成的。光源濾光片光路聚光器鏡頭圖像采集系統(tǒng)
第8頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天
熒光光源:高壓汞燈、氙燈或鹵素?zé)?/p>
濾色系統(tǒng):激發(fā)濾色片:置于光源與物鏡之間,用于選擇激發(fā)光范圍,只有能激發(fā)熒光染料發(fā)光的特定波長(zhǎng)的光通過(guò)。阻擋濾色片:物鏡和目鏡之間,選擇性通過(guò)特異的熒光,呈現(xiàn)專(zhuān)一的熒光色彩。第9頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天
透射光:照明光線從標(biāo)本下經(jīng)聚光器透過(guò)標(biāo)本進(jìn)入物鏡。落射光:照明光線從標(biāo)本上經(jīng)垂直照明器落射到標(biāo)本,經(jīng)標(biāo)本反射進(jìn)入物鏡。
透射熒光顯微鏡光路(a)落射熒光顯微鏡光路(b)光路第10頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天5熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求(一)載玻片
載玻片厚度應(yīng)在0.8~1.2mm之間,太厚的坡片,一方面光吸收多,另一方面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔,厚度均勻,無(wú)明顯自發(fā)熒光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。
(二)蓋玻片
蓋玻片厚度在0.17mm左右,光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光,也可用干涉蓋玻片,這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長(zhǎng)的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如氟化鎂)的蓋玻片,它可以使熒光順利通過(guò),而反射激發(fā)光,這種反射的激發(fā)光女可激發(fā)標(biāo)本。
(三)標(biāo)本
組織切片或其他標(biāo)本不能太厚,如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部,而物鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外,細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋,影響判斷。第11頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天(四)封裱劑
封裱劑常用甘油,必須無(wú)自發(fā)熒光,無(wú)色透明,熒光的亮度在pH8.5~9.5時(shí)較亮,不易很快褪去。所以,常用甘油和0.5mol/l
pH9.0~9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。
(五)鏡油
一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí),必須使用鏡油,最好使用特制的無(wú)熒光鏡油,也可用上述甘油代替,液體石蠟也可用,只是折光率較低,對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。第12頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天6使用熒光顯微鏡的注意事項(xiàng)
(1)嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作,不要隨意改變程序。
(2)應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后,接上電源,點(diǎn)燃超高壓汞燈5~15min,待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后,眼睛完全適應(yīng)暗室,再開(kāi)始觀察標(biāo)本。
(3)防止紫外線對(duì)眼睛的損害,在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。
(4)檢查時(shí)間每次以1~2h為宜,超過(guò)90min,超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降,熒光減弱;標(biāo)本受紫外線照射3~5min后,熒光也明顯減弱;所以,最多不得超過(guò)2~3h。
第13頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天(5)熒光顯微鏡光源壽命有限,標(biāo)本應(yīng)集中檢查,以節(jié)
省時(shí)間,保護(hù)光源。天熱時(shí),應(yīng)加電扇散熱降溫,新?lián)Q燈泡應(yīng)從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí),須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。(6)標(biāo)本染色后立即觀察,因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,可延緩熒光減弱時(shí)間防止封裱劑蒸發(fā)。
(7)熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn):一般分為四級(jí),即“-”—無(wú)或可見(jiàn)微弱熒光。“+”—僅能見(jiàn)明確可見(jiàn)的熒光。“++”—可見(jiàn)有明亮的熒光?!?++”—可見(jiàn)耀眼的熒光。第14頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天熒光分光光度計(jì)工作原理:
由光源氙狐燈發(fā)出的光通過(guò)切光器使其變成斷續(xù)之光以及激發(fā)光單色器變成單色光后,此光即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光,被測(cè)的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光,經(jīng)過(guò)單色器變成單色熒光后照射于測(cè)樣品用的光電倍增管上,由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過(guò)放大器放大輸至記錄儀,激發(fā)光單色器和熒光單色器的光柵均由電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)的凸輪所控制,當(dāng)測(cè)繪熒光發(fā)射光譜時(shí),將激發(fā)光單色器的光柵,固定在最適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光波長(zhǎng)處,而讓熒光單色器凸輪轉(zhuǎn)動(dòng),將各波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度訊號(hào)輸出至記錄儀上,所記錄的光譜即發(fā)射光譜(emissionspectrum),簡(jiǎn)稱(chēng)熒光光譜。
7熒光分光光度計(jì)第15頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天當(dāng)測(cè)繪熒光激發(fā)光譜時(shí),將熒光單色器的光柵固定在最適當(dāng)?shù)臒晒獠ㄩL(zhǎng)處,只讓激發(fā)光單色口的凸輪轉(zhuǎn)動(dòng),將各波長(zhǎng)的激發(fā)光的強(qiáng)度訊號(hào)輸出至記錄儀,所記錄的光譜即激發(fā)光譜(emissionspectrum)。
當(dāng)進(jìn)行樣品溶液的定量分析時(shí),將激發(fā)光單色器固定在所選擇的激發(fā)光波長(zhǎng)處,將熒光單色器調(diào)節(jié)至所選擇的熒光波長(zhǎng)處,由記錄儀得出的信號(hào)是樣品溶液的熒光強(qiáng)度。第16頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天熒光分光光度計(jì)原理圖熒光分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)是:光源單色器或?yàn)V光片樣品池單色器或?yàn)V光片檢測(cè)器第17頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天注意事項(xiàng):(1)
注意開(kāi)機(jī)順序。
(2)
注意關(guān)機(jī)順序。
(3)
為延長(zhǎng)儀器使用壽命,掃描速度、負(fù)高壓、狹縫的設(shè)置一般不宜選在高檔。(4)
關(guān)機(jī)后必須半小時(shí)(等氙燈溫度降下)方可重新開(kāi)機(jī)。
第18頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天8熒光技術(shù)的應(yīng)用(1)免疫熒光技術(shù)用熒光標(biāo)記的抗體或抗原與樣品(細(xì)胞、組織或分離的物質(zhì)等)中相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合,以適當(dāng)檢測(cè)熒光的技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分析的方法。將抗原或抗體與熒光染料連接,用于檢測(cè)相應(yīng)特異性的抗體或抗原的方法稱(chēng)“直接免疫熒光技術(shù)(directimmunofluorescenttechnique)”。用熒光染料標(biāo)記的第二、第三抗體等檢測(cè)相應(yīng)抗原抗體復(fù)合體的方法則稱(chēng)“間接免疫熒光技術(shù)(indirectimmunofluorescenttechnique)”??寡a(bǔ)體染色法簡(jiǎn)稱(chēng)補(bǔ)體法,是間接染色法的一種改良法,本法利用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的原理,用熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體,鑒定未知抗原或未知抗體(待檢血清)。第19頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天直接法熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。直接熒光抗體染色法示意圖
第20頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天間接法特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng),熒光素標(biāo)記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。間接熒光抗體染色法示意圖
第21頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天
染色程序分為二步,最終使之形成抗原-抗體-補(bǔ)體-抗補(bǔ)體抗體復(fù)合物,發(fā)出熒光。抗補(bǔ)體染色法第22頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)直接法特異性高,操作簡(jiǎn)便,比較快速。一種標(biāo)記抗體只能檢查一種抗原,敏感性較差。直接法應(yīng)設(shè)陰、陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照,抑制試驗(yàn)對(duì)照。間接法既能檢查未知抗原,也能檢查求知抗體;用一種標(biāo)記的抗球蛋白抗體,能與在種屬上相同的所有動(dòng)物的抗體結(jié)合,檢查各種未知抗原或抗體,敏感性高。由于參加反應(yīng)的因素較多,受干擾的可能性也較大,判定結(jié)果有時(shí)較難,操作繁瑣,對(duì)照較多,時(shí)間長(zhǎng)。間接法應(yīng)設(shè)陰、陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照,還應(yīng)設(shè)有中間層對(duì)照(即中間層加陰性血清代替陽(yáng)性血清)。補(bǔ)體法即只需要一種標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體,便能檢測(cè)各種抗原-抗體系統(tǒng)。參與反應(yīng)的成分多,染色程序較復(fù)雜,比較麻煩。第23頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天
(2)作為生物大分子篩選與鑒定的標(biāo)記物
綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein),簡(jiǎn)稱(chēng)GFP,其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì),在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下,會(huì)發(fā)出綠色熒光。在生物學(xué)研究中綠色熒光蛋白具有廣泛用途,包括有:
分子標(biāo)記利用綠色熒光的發(fā)光機(jī)制,可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽(proteintagging),即利用DNA重組技術(shù),將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因,轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),然后借助熒光顯微鏡便可對(duì)標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)活體觀察。
煙草細(xì)胞第24頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的活體觀察
藥物篩選
熒光探針?lè)植际抢眯盘?hào)傳導(dǎo)中信號(hào)分子的遷移功能,將一熒光蛋白與信號(hào)分子相偶聯(lián),根據(jù)熒光蛋白的分布情況即可推斷信號(hào)分子的遷移狀況,并推斷該分子在遷移中的功能。由于GFP分子量小,在活細(xì)胞內(nèi)可溶且對(duì)細(xì)胞毒性較小,因而常用作熒光探針。第25頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天
(3)熒光原位雜交
原位雜交技術(shù)(Insituhybridization,ISH)是用標(biāo)記的核酸探針,經(jīng)放射自顯影或非放射檢測(cè)體系,在組織,細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段。原理:利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列,將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì),結(jié)合成專(zhuān)一的核酸雜交分子,經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來(lái)。第26頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天第27頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天第28頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天(4)無(wú)機(jī)分析在無(wú)機(jī)元素分析中,主要是通過(guò)待測(cè)元素與有機(jī)試劑(或熒光試劑)生成配合物或發(fā)生熒光猝滅效應(yīng)來(lái)測(cè)定元素的含量。目前可以通過(guò)熒光分析測(cè)定70多種金屬離子和陰離子,如Ag、
Al、As、Au、Be、Bi、Ca、Cu、Ge、Ga、Hf、
Hg、In、Ir、Li、Mg、Mn、Nb、Ni、Os、Pb、
Pt、Ru、Sb、Sc、Si、Sn、Sr、Ta、Tl、Th、
Ti、V、Y、W、Zn、Ce、Dy、Eu、Gd、La、
Lu、Sm、Cd、Cr(Ⅵ)、Se、Te、Re等第29頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天(5)有機(jī)物分析近年來(lái)有機(jī)物熒光分析研究在我國(guó)發(fā)展迅速,年文獻(xiàn)量不斷增加。主要應(yīng)用領(lǐng)域有中西藥和臨床、食品營(yíng)養(yǎng)和添加劑等試樣。激光誘導(dǎo)熒光法診斷惡性腫瘤,顯微熒光法研究藥物與細(xì)胞的相互作用,DNA編序及含量的熒光法測(cè)定均是目前受到關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。第30頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天環(huán)境檢測(cè)領(lǐng)域:
熒光分光光度計(jì)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)成為環(huán)境污染監(jiān)測(cè)中污染物定性和定量分析的有效手段。如不同類(lèi)型不同場(chǎng)地的石油及其產(chǎn)品成份各有不同,其熒光光譜也有著顯著的區(qū)別,利用油標(biāo)可在激發(fā)310nm,發(fā)射365nm處測(cè)量淤泥和海水中油污樣品中總油的含量。還可以對(duì)機(jī)油、柴油、重油、原油及液壓油進(jìn)行初步鑒定;空氣塵埃中多環(huán)芳烴的檢測(cè)。其他如陰離子表面活性劑作為洗滌劑污染的主要成份,葉綠素a、葉綠素b、脫鎂葉綠素a和脫鎂葉綠素b作為水環(huán)境浮游植物生物量和水體富營(yíng)養(yǎng)化的重要指標(biāo)以及多環(huán)芳烴等都可用熒光分光光度計(jì)測(cè)量。第31頁(yè),共40頁(yè),2024年2月25日,星期天食品和藥物成份分析領(lǐng)域:
曾用熒光法分析食品和藥品中的化合物如:維生素A、維生素B1、B2(核黃素)、B6、維生素BC(葉酸或蝶酰谷氨酸)、維生素C、維生素D、維生素E(生育酚)、維生素P(蘆丁)、維生素F(煙酸)、維生素K,抗生素藥中的青梅毒、金霉素、四環(huán)素、抗霉素、鏈霉素和放線菌素D等,抗瘧疾藥中的奎寧、瘧滌平、撲瘧母星、嘧啶甲胺和利凡諾等,麻醉藥中的大麻醇、嘜啶鹽酸鹽、四氫大麻醇、嗎啡、可待因、罌粟堿、那可汀、吐根酚堿、依米丁、麻黃素、馬錢(qián)子堿鹽酸鹽、毛果(蕓香)鹽酸鹽、弗勒可丁、二丁卡因、麥角酸二乙胺等,鎮(zhèn)痛藥中撲熱息痛、阿司匹林、消炎痛吲哚美辛等等。第32頁(yè)
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