微生物檢驗技術(shù)

微生物檢驗技術(shù)

顯微技術(shù)

顯微技術(shù)是微生物檢驗技術(shù)中最常用的技術(shù)之一。顯微鏡的種類

專門多，在實驗室中常用的有：一般光學(xué)顯微鏡、暗視野顯微鏡、相差顯

微鏡、熒光顯微鏡和電子顯微鏡等。而在食品微生物檢驗中最常用的依舊

一般光學(xué)顯微鏡。

一、一般光學(xué)顯微鏡的結(jié)構(gòu)和差不多原理：

1.結(jié)構(gòu)：

光學(xué)顯微鏡是由光學(xué)放大系統(tǒng)和機(jī)械裝置兩部分組成。光學(xué)系統(tǒng)

一樣包括目鏡、物鏡、聚光器、光源等；機(jī)械系統(tǒng)一樣包括鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)

換器、鏡臺、鏡臂和底座等。（圖3—1）

標(biāo)本的放大要緊由物鏡完成，物鏡放大倍數(shù)越大，它的焦距越短。

焦距越小，物鏡的透鏡和玻片間距離（工作距離）也小。油鏡的工作距離

專門短，使用時需格外注意。目鏡只起放大作用，不能提升辨論率，標(biāo)準(zhǔn)

目鏡的放大倍數(shù)是十倍。聚光鏡能使光線照耀標(biāo)本后進(jìn)入物鏡，形成一個

大角度的錐形光柱，因而對提升物鏡辨論率是專門重要的。聚光鏡能夠上

下移動，以調(diào)劑光的明暗，可變光闌能夠調(diào)劑入射光束的大小。

顯微鏡用光源，自然光和燈光都能夠，以燈光較好，因光色和強(qiáng)

度都容易操縱。一樣的顯微鏡可用一般的燈光，質(zhì)量高的顯微鏡要用顯微

鏡燈，才能充分發(fā)揮其性能。有些需要專門強(qiáng)照明，如暗視野照明、攝影

等，常常使用鹵素?zé)糇鳛楣庠础?/p>

圖3

-1光

學(xué)顯微鏡

結(jié)構(gòu)圖

2.原

理：

顯微鏡的

放大效能

(辨論

率)是由

所用光波

長短和物鏡數(shù)值口徑?jīng)Q定，縮短使用的光波波長或增加數(shù)值口徑能夠提升

辨論率，可見光的光波幅度比較窄，紫外光波長短能夠提升辨論率，但不

能用肉眼直截了當(dāng)觀看。因此利用減小光波長來提升光學(xué)顯微鏡辨論率是

有限的，提升數(shù)值口徑是提升辨論率的理想措施。要增加數(shù)值口徑，能夠

提升介質(zhì)折射率，當(dāng)空氣為介質(zhì)時折射率為1,而香柏油的折射率為1.51,

和載片玻璃的折射率(1.52)相近，如此光線能夠不發(fā)生折射而直截了當(dāng)通

過載片、香柏油進(jìn)入物鏡，從而提升辨論率。顯微鏡總的放大倍數(shù)是目鏡

和物鏡放大倍數(shù)的乘積，而物鏡的放大倍數(shù)越高，辨論率越高。

二、一般顯微鏡的使用方法

1、低倍鏡觀看

先將低倍物鏡的位置固定好，然后放置標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動反光鏡，調(diào)

好光線，將物鏡提升，向下調(diào)至看到標(biāo)本，再用細(xì)調(diào)對準(zhǔn)焦距進(jìn)行觀看。

除少數(shù)顯微鏡外，聚光鏡的位置都要放在最高點。如果視野中顯現(xiàn)外界物

體的圖像，能夠?qū)⒕酃忡R略微下降，圖像就能夠消逝。聚光鏡下的虹彩光

圈應(yīng)調(diào)到適當(dāng)?shù)拇笮?，以操縱射入光線的量，增加明暗差。

2、高倍鏡觀看

顯微鏡的設(shè)計一樣是共焦點的。低倍鏡對準(zhǔn)焦點后，轉(zhuǎn)換到高倍

鏡差不多上也對準(zhǔn)焦點，只要略微轉(zhuǎn)動微調(diào)即可。有些簡易的顯微鏡不是

共焦點，或者是由于物鏡的更換而達(dá)不到共焦點，就要采取將高倍物鏡下

移，再向上調(diào)準(zhǔn)焦點的方法。虹彩光圈要放大，使之能形成足夠的光錐角

度。略微上下移動聚光鏡，觀看圖像是否清晰。

3、油浸鏡觀看

油浸鏡的工作距離專門小，因此要防止載皮片和物鏡上的透鏡損

壞。使用時，一樣是經(jīng)低倍、高倍到油浸鏡。當(dāng)高倍物鏡對準(zhǔn)標(biāo)本后，再

加油浸鏡觀看。載玻片標(biāo)本也能夠不通過低倍和高倍物鏡，直截了當(dāng)用油

浸鏡觀看。顯微鏡有自動止降裝置的，載玻片上加油以后，將油浸鏡下移

到油滴中，到停止下降為止，然后用微調(diào)向上調(diào)準(zhǔn)焦點。沒有自動止降裝

置的，對準(zhǔn)焦點的方法是從顯微鏡的側(cè)面觀看，將油浸鏡下移到與載玻片

略微接觸為止，然后用微調(diào)向上提升調(diào)準(zhǔn)焦點。

使用油浸鏡時，鏡臺要保持水平，防止油流淌。油浸鏡所用的油

要潔凈，聚光鏡要提升到最高點，并放大聚光鏡下的虹彩光圈，否則會降

低數(shù)值口徑而阻礙辨論率。不管是油浸鏡或高倍鏡觀看，都宜用可調(diào)劑的

顯微鏡燈作光源。

三、一般顯微鏡的保養(yǎng)

顯微鏡是周密貴重的儀器，必須專門好地保養(yǎng)。顯微鏡用完后要

放回原先的鏡箱或鏡柜中，同時要注意下列事項：

1觀看完后，移去觀看的載玻片標(biāo)本。

2、用過油浸鏡的，應(yīng)先用擦鏡紙將鏡頭上的油擦去，再用擦鏡紙蘸著

二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦鏡紙將二甲苯擦去。

3、轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，放在低倍鏡的位置。

4、將鏡身下降到最低位置，調(diào)劑好鏡臺上標(biāo)本移動器的位置，罩上防

塵套。

鏡頭的愛護(hù)最為重要。鏡頭要保持清潔，只能用軟而沒有短絨毛

的擦鏡紙擦拭。擦鏡紙要放在紙盒中，以防沾染灰塵。切勿用手絹或紗布

等擦鏡頭。物鏡在必要時能夠用溶劑清洗，但要注意防止溶解固定透鏡的

膠固劑。按照不同的膠固劑，可選用不同的溶劑，如酒精、丙酮和二甲苯

等，其中最安全的是二甲苯。方法是用脫脂棉花團(tuán)蘸取少量的二甲苯，輕

擦，并趕忙用擦鏡紙將二甲苯擦去，然后用洗耳球吹去可能殘留的短絨。

目鏡是否清潔能夠在顯微鏡下檢視。轉(zhuǎn)動目鏡，如果視野中能夠看到污點

隨著轉(zhuǎn)動，則講明目鏡已沾有污物，可用擦鏡紙擦拭接目的透鏡。如果還

不肯^目鏡

成H防灰

塵療

物計

微鏡

方格

網(wǎng)當(dāng)稱為

計凄寧格,

每目每個

中75X16

或】殳,載

片上）.1

圖3—2兩種血球計數(shù)板

a.25X16計數(shù)板b.l6X25計數(shù)板立方毫米。測出每個中方格菌數(shù)，就

能夠算出一個大方格的菌數(shù)，由此推算出1毫升菌液內(nèi)所含的菌數(shù)。

一個大方格是16個中方格時，應(yīng)當(dāng)數(shù)4角4個中方格（即100個

小方格）的菌數(shù)，一個大方格是25個中方格時，除取4角4個中方格外，

還要數(shù)中央一個中方格（即為80個小方格）的菌數(shù)。

運算公式如下：

16X25計教;＜：

總菌數(shù)/ml=X400X10000X稀釋倍數(shù)

=每個小方格內(nèi)菌數(shù)X4X106X稀釋倍數(shù)

25X16計戮工

總菌數(shù)/ml=X400X10000X稀釋倍數(shù)

=每小方格內(nèi)菌數(shù)義4X106X稀釋倍數(shù)

染色技術(shù)

由于微生物細(xì)胞含有大量水分（一樣在80-90%以上），對光線的

吸取和反射與水溶液的差別不大，與周圍背景沒有明顯的明暗差。因此，

除了觀看活體微生物細(xì)胞的運動性和直截了當(dāng)運算菌數(shù)外，絕大多數(shù)情形

下都必須通過染色后，才能在顯微鏡下進(jìn)行觀看。然而，任何一項技術(shù)都

不是完美無缺的。染色后的微生物標(biāo)本是死的，在染色過程中微生物的形

狀與結(jié)構(gòu)均會發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細(xì)胞的真實情形，染色

觀看時必須注意。

本節(jié)包括四部分：

一、染色的差不多原理

微生物染色的差不多原理，是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而

進(jìn)行的。物理因素如細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用

等。化學(xué)因素則是按照細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學(xué)反應(yīng)。

酸性物質(zhì)關(guān)于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，堿性物質(zhì)對酸

性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細(xì)胞核關(guān)于堿性染料就有化學(xué)親和力，易

于吸附。然而，要使酸性物質(zhì)染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以

改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發(fā)生。相反，堿性物質(zhì)（如細(xì)胞

質(zhì)）通常僅能染上酸性染料，若把它們變?yōu)檫m宜的物理形式，也同樣能與

堿性染料發(fā)生吸附作用。

細(xì)菌的等電點較低，pH值大約在2—5之間，故在中性、堿性或

弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時染料離子

帶陽電。因此，帶陰電的細(xì)菌常和帶陽電的堿性染料進(jìn)行結(jié)合。因此，在

細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料進(jìn)行染色。

阻礙染色的其它因素，還有菌體細(xì)胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，

如細(xì)胞膜的通透性、膜孔的大小和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一定

作用。此外，培養(yǎng)基的組成、菌令、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、

藥物的作用等，也都能阻礙細(xì)菌的染色。

二、染料的種類和選擇

染料分為天然染料和人工染料兩種。天然染料有胭脂蟲紅、地衣

素、石蕊和蘇木素等，它們多從植物體中提取得到，其成分復(fù)雜，有些至

今還未搞清晰。目前要緊采納人工染料，也稱煤焦油染料，多從煤焦油中

提取獲得，是苯的衍生物。多數(shù)染料為帶色的有機(jī)酸或堿類，難溶于水，

而易溶于有機(jī)溶劑中。為使它們易溶于水，通常制成鹽類。

染料可按其電離后染料離子所帶電荷的性質(zhì)，分為酸性染料、堿

性染料、中性（復(fù)合）染料和單純?nèi)玖纤拇箢悺?/p>

1、酸性染料

這類染料電離后染料離子帶負(fù)電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺

黑、苦味酸和酸性復(fù)紅等，可與堿性物質(zhì)結(jié)合成鹽。當(dāng)培養(yǎng)基因糖類分解

產(chǎn)酸使pH值下降時，細(xì)菌所帶的正電荷增加，這時選擇酸性染料，易被染

色。

2、堿性染料

這類染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結(jié)合成鹽。微生

物實驗室一樣常用的堿性染料有美蘭、甲基紫、結(jié)晶紫、堿性復(fù)紅、中性

紅、孔雀綠和蕃紅等，在一樣的情形下，細(xì)菌易被堿性染料染色。

3、中性（復(fù)合）染料

酸性染料與堿性染料的結(jié)合物叫做中性（復(fù)合）染料，如瑞脫氏

（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等，后者常用于細(xì)胞核的染色。

4、單純?nèi)玖?/p>

這類染料的化學(xué)親和力低，不能和被染的物質(zhì)生成鹽，其染色能

力視其是否溶于被染物而定，因為它們大多數(shù)都屬于偶氮化合物，不溶于

水，但溶于脂肪溶劑中，如紫丹類（Sudanb）的染料。

三、制片和染色的差不多程序

微生物的染色方法專門多，各種方法應(yīng)用的染料也不盡相同，然

而一樣染色都要通過制片及一套染色操作程序。

1、制片

在潔凈的載玻片上滴上一滴蒸儲水，用接種環(huán)進(jìn)行無菌操作，挑

取培養(yǎng)物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘

米的薄層，為幸免因菌數(shù)過多聚成集團(tuán)，不利觀看個體形狀，可在載玻片

之一側(cè)再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進(jìn)行稀釋，涂

布成薄層，若材料為液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物中洗下制備的菌液，則直截

了當(dāng)涂布于載玻片上即可。

2、自然干燥

涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時為了使之干得更快些，可

將標(biāo)本面向上，手持載玻片一端的兩側(cè)，小心地在酒精燈上高處微微加熱,

使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時刻過長，以防標(biāo)本烤枯而變形。

3、固定

標(biāo)本干燥后即進(jìn)行固定，固定的目的有三個：

1）殺死微生物，固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

2）保證菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標(biāo)本被水沖洗掉。

3）改變?nèi)玖蠈?xì)胞的通透性，因為死的原生質(zhì)比活的原生質(zhì)易

于染色。

固定常常利用高溫，手執(zhí)載玻片的一端（涂有標(biāo)本的遠(yuǎn)端），標(biāo)本

向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3—4次，共約2—3秒鐘，并不

時以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺過燙為宜（不超過6（TC）,放置待冷后,

進(jìn)行染色。

以上這種固定法在微生物實驗室中盡管應(yīng)用較多普遍，然而應(yīng)當(dāng)

指出，在研究微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)時不適用，應(yīng)采納化學(xué)固定法?；瘜W(xué)固定法

最常用的固定劑有：酒精（95%）,酒精和醒各半的混合物，丙酮，1—2%

的餓酸等。餓酸能專門快固定細(xì)胞但不改變其結(jié)構(gòu)，故較常用。應(yīng)用餓酸

固定細(xì)胞的技術(shù)如下：在培養(yǎng)皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細(xì)管，

在毛細(xì)管中注入少量的1—2%餓酸溶液，同時在玻璃上再放置濕標(biāo)本涂片

的載玻片，然后把培養(yǎng)皿蓋上，通過1—2分鐘后把標(biāo)本從培養(yǎng)皿中取出，

并使之干燥。

4、染色

標(biāo)本固定后，滴加染色液。染色的時刻各不相同，視標(biāo)本與染料

的性質(zhì)而定，有時染色時還要加熱。染料作用標(biāo)本的時刻平均約1—3分鐘，

而所有的染色時刻內(nèi)，整個涂片（或有標(biāo)本的部分）應(yīng)該浸在染料之中。

若作復(fù)合染色，在媒染處理時，媒染劑與染料形成不溶性化合物,

可增加染料和細(xì)菌的親和力。一樣固定后媒染，但也能夠結(jié)合固定或染色

同時進(jìn)行。

5、脫色

用醇類或酸類處理染色的細(xì)胞，使之脫色?？蓹z查染料與細(xì)胞結(jié)

合的穩(wěn)固程度，鑒別不同種類的細(xì)菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸

溶液。

6、復(fù)染

脫色后再用一種染色劑進(jìn)行染色，與不被脫色部位形成鮮亮的對

比，便于觀看。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復(fù)紅最后進(jìn)行染色,

確實是復(fù)染。

7、水洗

染色到一定的時候，用細(xì)小的水流從標(biāo)本的背面把余外的染料沖

洗掉，被菌體吸附的染料則保留。

8、干燥

著色標(biāo)本洗凈后，將標(biāo)本晾干，或用吸水紙把余外的水吸去，然

后晾干或微熱烘干，用吸水紙時，切勿使載玻片翻轉(zhuǎn)，以免將菌體擦掉。

9、鏡檢

干燥后的標(biāo)本可用顯微鏡觀看。

綜上所述，染色的差不多程序如下：

制片f固定f媒染f染色f脫色f復(fù)染f水洗f干燥f鏡檢。

四、染色方法

微生物染色方法一樣分為單染色法和復(fù)染色法兩種。前者用一種

染料使微生物染色，但不能鑒別微生物。復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染

料，有協(xié)助鑒別微生物的作用。故亦稱鑒別染色法。常用的復(fù)染色法有革

蘭氏染色法和抗酸性染色法，此外還有鑒別細(xì)胞各部分結(jié)構(gòu)的（如芽胞、

鞭毛、細(xì)胞核等）專門染色法。食品微生物檢驗中常用的是單染色法和革

蘭氏染色法。

1、單染色法

用一種染色劑對涂片進(jìn)行染色，簡便易行，適于進(jìn)行微生物的形

狀觀看。在一樣情形下，細(xì)菌菌體多帶負(fù)電荷，易于和帶正電荷的堿性染

料結(jié)合而被染色。因此，常用堿性染料進(jìn)行單染色，如美蘭、孔雀綠、堿

性復(fù)紅、結(jié)晶紫和中性紅等。若使用酸性染料，多用剛果紅、伊紅、藻紅

和酸性品紅等。使用酸性染料時，必須降低染液的PH值，使其出現(xiàn)強(qiáng)酸性

（低于細(xì)菌菌體等電點），讓菌體帶正電荷，才易于被酸性染料染色。

單染色一樣要通過涂片、固定、染色、水洗和干燥五個步驟。

染色結(jié)果依染料不同而不同：

石碳酸復(fù)紅染色液：著色快，時刻短，菌體呈紅色。

美蘭染色液：著色慢，時刻長，成效清晰，菌體呈蘭色。

草酸鍍結(jié)晶染色液：染色迅速，著色深，菌體呈紫色。

2、革蘭氏染色法

革攔氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，1884年由

丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。

細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶染色，而經(jīng)碘液媒染后，用酒精脫色，在

一定條件下有的細(xì)菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細(xì)菌分為兩

大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（G+）,后者為革蘭氏陰性菌（G—）。為觀

看方便，脫色后再用一種紅色染料如堿性蕃紅等進(jìn)行復(fù)染。陽性菌仍帶紫

色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數(shù)和球菌，以及所有的

放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應(yīng)；弧菌，螺旋體和大多數(shù)致病性的無芽胞

桿菌都出現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。

革攔氏陽性菌和革蘭氏陰性菌在化學(xué)組成和生理性質(zhì)上有專門多

差別，染色反應(yīng)不一樣。現(xiàn)在一樣認(rèn)為革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有專門的核蛋

白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合專門牢，不易脫

色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色，這是染色反應(yīng)的要

緊依據(jù)。

另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低，在相同PH條件下進(jìn)行染

色，陽性菌吸附堿性染料專門多，因此不易脫去，陰性菌則相反。因此染

色時的條件要嚴(yán)格操縱。例如，在強(qiáng)堿的條件下進(jìn)行染色，兩類菌吸附堿

性染料都多，都可呈正反應(yīng)；PH專門低時，則可都呈負(fù)反應(yīng)。此外，兩類

菌的細(xì)胞壁等對結(jié)晶紫一碘復(fù)合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故

不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色。因此脫色時刻，脫色方法也應(yīng)嚴(yán)格

操縱。

革攔氏染色法一樣包括初染、媒染、脫色、復(fù)染等四個步驟，具

體操作方法是：

1）涂片固定。

2）草酸鐵結(jié)晶紫染1分鐘。

3）自來水沖洗。

4）加碘液覆蓋涂面染1分鐘。

5）水洗，用吸水紙吸去水分。

6）加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進(jìn)行脫色，30秒后水洗，吸去

水分。

7）蕃紅梁色液（?。┤?0秒鐘后，自來水沖洗。干燥，鏡檢。

染色的結(jié)果，革蘭氏正反應(yīng)菌體都呈紫色，負(fù)反應(yīng)菌體都呈紅色。

滅菌和消毒

消毒和滅菌兩個詞在實際使用中常被混用，事實上它們的含義是

有所不同的。消毒是指應(yīng)用消毒劑等方法殺滅物體表面和內(nèi)部的病原菌營

養(yǎng)體的方法，而滅菌是指用物理和化學(xué)方法殺死物體表面和內(nèi)部的所有微

生物，使之呈無菌狀態(tài)。

一、物理方法

1、溫度

利用溫度進(jìn)行滅菌、消毒或防腐，是最常用而又方便有效的方法。

高溫可使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶類發(fā)生變性而失活，從而起滅菌作用，

低溫通常起抑菌作用。

1）干熱滅菌法：

a.灼燒滅菌法：利用火焰直截了當(dāng)把微生物燒死。此法完全可靠，

滅菌迅速，但易焚毀物品，因此使用范疇有限，只適合于接種針、環(huán)、試

管口及不能用的污染物品或?qū)嶒瀯游锏氖w等的滅菌。

b.干熱空氣滅菌法：這是實驗室中常用的一種方法，即把待滅菌的

物品平均地放入烘箱中，升溫至160°C,恒溫1小時即可。此法適用于玻

璃皿、金屬用具等的滅菌。

2）濕熱滅菌法：

在同樣的溫度下，濕熱滅菌的成效比干熱滅菌好，這是因為一方

面細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含水量高，容易變性。另一方面高溫水蒸汽對蛋白質(zhì)有高

度的穿透力，從而加速蛋白質(zhì)變性而迅速死亡。

a.巴氏消毒法：有些食物會因高溫破壞營養(yǎng)成分或阻礙質(zhì)量，如牛

奶、醬油、啤酒等，因此只能用較低的溫度來殺死其中的病原微生物，如

此既保持食物的營養(yǎng)和風(fēng)味，又進(jìn)行了消毒，保證了食品衛(wèi)生。該法一樣

在62。C,30分鐘既可達(dá)到消毒目的。此法為法國微生物學(xué)家巴斯德首創(chuàng)，

故名為巴氏消毒法。

b.煮沸消毒法：直截了當(dāng)將要消毒的物品放入清水中，煮沸15分

鐘，即可殺死細(xì)菌的全部營養(yǎng)和部分芽泡。若在清水中加入1%碳酸鈉或2%

的石炭酸，則成效更好。此法適用于注射器、毛巾及解剖用具的消毒。

c.間歇滅菌法：上述兩種方法在常壓下，只能起到消毒作用，而專

門難做到完全無菌。若采納間歇滅菌的方法，就能殺滅物品中所有的微生

物。具體做法是：將待滅菌的物品加熱至100°C,15?30分鐘，殺死其中

的營養(yǎng)體。然后冷卻，放入37°C恒溫箱中過夜，讓殘留的芽袍萌發(fā)成營

養(yǎng)體。第2天再重復(fù)上述步驟，三次左右，就可達(dá)到滅菌的目的。此法不

需加壓滅菌鍋，適于推廣，但操作苦惱，所需時刻長。

d.加壓蒸汽滅菌法：這是發(fā)酵工業(yè)、醫(yī)療保健、食品檢測和微生

物學(xué)實驗室中最常用的一種滅菌方法。它適用于各種耐熱、體積大的培養(yǎng)

基的滅菌，也適用于玻璃器皿、工作服等物品的滅菌。

加壓蒸汽滅菌是把待滅菌的物品放在一個可密閉的加壓蒸汽滅菌

鍋中進(jìn)行的，以大量蒸汽使其中壓力升高。由于蒸汽壓的上升，水的沸點

也隨之提升。在蒸汽壓達(dá)到1.055公斤/厘米2時，加壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)的溫

度可達(dá)到121°Co在這種情形下，微生物（包括芽泡）在15?20分鐘便會

被殺死，而達(dá)到滅菌目的。如滅菌的對象是砂土、石蠟油等面積大、含菌

多、傳熱差的物品，則應(yīng)適當(dāng)延長滅菌時刻。

在加壓蒸汽滅菌中，要引起注意的一個咨詢題是，在恒壓之前，

一定要排盡滅菌鍋中的冷空氣，否則表上的蒸汽壓與蒸汽溫度之間不具對

應(yīng)關(guān)系，如此會大大降低滅菌成效。

3）阻礙滅菌的因素

a.不同的微生物或同種微生物的不同菌齡對高溫的敏銳性不同。多

數(shù)微生物的營養(yǎng)體和病毒在50?65。C,10分鐘就會被殺死；但各種泡子、

專門是芽抱最能抗熱，其中抗熱性最強(qiáng)的是嗜熱脂肪芽抱桿菌，要在121°

C,12分鐘才被殺死。對同種微生物來講，幼齡菌比老齡菌對熱更敏銳。

b.微生物的數(shù)量多少明顯會阻礙滅菌的成效，數(shù)量越多，熱死時刻

越長。

c.培養(yǎng)基的成分與組成也會阻礙滅菌成效。一樣地講，蛋白質(zhì)、糖

或脂肪存在，則提升抗熱性，pH在7鄰近，抗熱性最強(qiáng)，偏向兩極，則抗

熱能力下降，而不同的鹽類可能對滅菌產(chǎn)生不同的阻礙；固體培養(yǎng)基要比

液體培養(yǎng)基滅菌時刻長。

4）滅菌對培養(yǎng)基成分的阻礙

a.pH值普遍下降。

b.產(chǎn)生混濁或沉淀，這要緊是由于一些離子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生混

濁或沉淀。例如Ca+2與PO4-3化合，就會產(chǎn)生磷酸鈣沉淀。

c.許多培養(yǎng)基顏色加深。

d.體積和濃度有所變化。

e.營養(yǎng)成分有時受到破壞。

2、輻射

利用輻射進(jìn)行滅菌消毒，能夠幸免高溫滅菌或化學(xué)藥劑消毒的缺

點，因此應(yīng)用越來越廣，目前要緊應(yīng)用在以下幾個方面：

1）接種室、手術(shù)室、食品、藥物包裝室常應(yīng)用紫外線殺菌。

2）應(yīng)用B射線作食品表面殺菌，Y射線用于食品內(nèi)部殺菌。經(jīng)

輻射后的食品，因大量微生物被殺滅，再用冷凍保藏，可使儲存期延長。

3、過濾

采納機(jī)械方法，設(shè)計一種濾孔比細(xì)菌還小的篩子，做成各種過濾

器。通過過濾，只讓液體培養(yǎng)基從篩子中流下，而把各種微生物菌體留在

篩子上面，從而達(dá)到除菌的目的。這種滅菌方法適用于一些對熱不穩(wěn)固的

體積小的液體培養(yǎng)基的滅菌以及氣體的滅菌。它的最大優(yōu)點是不破壞培養(yǎng)

基中各種物質(zhì)的化學(xué)成分。然而比細(xì)菌還小的病毒仍舊能留在液體培養(yǎng)基

內(nèi)，有時會給實驗帶來一定的苦惱。

二、化學(xué)方法

一樣化學(xué)藥劑無法殺死所有的微生物，而只能殺死其中的病原微

生物，因此是起消毒劑的作用，而不是滅菌劑。

能迅速殺滅病原微生物的藥物，稱為消毒劑。能抑制或阻止微生

物生長繁育的藥物，稱為防腐劑。然而一種化學(xué)藥物是殺菌依舊抑菌，常

不易嚴(yán)格區(qū)分。消毒劑在低濃度時也能殺菌（如1：1000硫柳汞）。由于消

毒防腐劑沒有選擇性，因此對一切活細(xì)胞都有毒性，不僅能殺死或抑制病

原微生物，而且對人體組織細(xì)胞也有損害作用，因此只能用于體表、器械、

排泄物和周圍環(huán)境的消毒。常用的化學(xué)消毒劑有：石碳酸、來蘇水（甲醛

溶液）、氯化汞、碘酒、酒精等。

培養(yǎng)基制備技術(shù)

一、玻璃器皿的清洗

在制備培養(yǎng)基的過程中，第一要使用一些玻璃器皿，如試管、三

角瓶、培養(yǎng)皿、燒杯和吸管等。這些器皿在使用前都要按照不同的情形，

通過一定的處理，洗刷潔凈。有的還要進(jìn)行包裝，通過滅菌等預(yù)備就緒后,

才能使用。

1、新購的玻璃器皿

除去包裝沾染的污垢后，先用熱肥皂水

刷洗，流水沖凈，再浸泡于1?2%的工業(yè)'鹽酸

中數(shù)小時，使游離的堿性物質(zhì)除去，再以流水沖

凈。對容量較大的器皿，如大燒瓶、量筒等,洗凈

后注入濃鹽酸少許，轉(zhuǎn)動容器使其內(nèi)部表面均沾有鹽酸，數(shù)分鐘后傾去鹽

酸，再以流水沖凈，倒置于洗滌架上將水空干，即可使用。

2、用過的玻璃器皿

凡確無病原菌或未被帶菌物污染的器皿，使用后可隨時沖洗，吸

取過化學(xué)試劑的吸管，可先浸泡于清水中，待到一定數(shù)量后再集中進(jìn)行清

洗。有可能被病原菌污染的器皿，必須通過適當(dāng)消毒后，將污垢除去，用

皂液洗刷，再用流水沖洗潔凈。若用皂液未能洗凈的器皿，可用洗液浸泡

適當(dāng)時刻后再用清水洗凈。洗液的要緊成份是重格酸鉀和濃流酸，其作用

是將有機(jī)物氧化成可溶性物質(zhì)，以便沖洗。洗液有專門強(qiáng)的腐蝕作用，使

用時應(yīng)專門小心，幸免濺到衣服、軀體和其他物品上。

二、培養(yǎng)基的類型

在實驗室中配制的適合微生物生長繁育或累積代謝產(chǎn)物的任何營

養(yǎng)基質(zhì)，都叫做培養(yǎng)基(Media)。由于各類微生物對營養(yǎng)的要求不同，培養(yǎng)

目的和檢測需要不同，因而培養(yǎng)基的種類專門多。我們可按照某種標(biāo)準(zhǔn)，

將種類繁多的培養(yǎng)基劃分為若干類型。

1、按照對培養(yǎng)基組成物質(zhì)的化學(xué)成分是否完全了解來區(qū)分，能夠?qū)⑴?/p>

養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基和半合成培養(yǎng)基。

1)天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基是指利用各種動、植物或微生物的原

料，其成分難以確切明白。用作這種培養(yǎng)基的要緊原料有：牛肉膏、麥芽

汁、蛋白膿、酵母膏、玉米粉、熟皮、各種餅粉、馬鈴薯、牛奶、血清等。

用這些物質(zhì)配成的培養(yǎng)基盡管不能確切明白它的化學(xué)成分，但一樣來講，

營養(yǎng)是比較豐富的，微生物生長旺盛，而且來源廣泛，配制方便，因此較

為常用，專門適合于配制實驗室常用的培養(yǎng)基。這種培養(yǎng)基的穩(wěn)固性常受

生產(chǎn)廠或批號等因素的阻礙。

2）合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是一類化學(xué)成分和數(shù)量完全明白的培

養(yǎng)基，它是用已知化學(xué)成分的化學(xué)藥品配制而成。這類培養(yǎng)基化學(xué)成分精

確、重復(fù)性強(qiáng)，但價格昂貴，而微生物又生長緩慢，因此它只適用于做一

些科學(xué)研究，例如營養(yǎng)、代謝的研究。

3）半合成培養(yǎng)基在合成培養(yǎng)基中，加入某種或幾種天然成分；

或者在天然培養(yǎng)基中，加入一種或幾種已知成分的化學(xué)藥品即成半合成培

養(yǎng)基。例如馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基等。這種培養(yǎng)基在生產(chǎn)實踐和實驗室中使用

最多。

2、按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài)來區(qū)分，能夠分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)

基和半固體培養(yǎng)基。

1）液體培養(yǎng)基所配制的培養(yǎng)基是液態(tài)的，其中的成分差不多上

溶于水，沒有明顯的固形物，液體培養(yǎng)基營養(yǎng)成分分布平均，易于操縱微

生物的生長代謝狀態(tài)。

2）固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入適量的凝固劑即成固體培養(yǎng)

基。常用作凝固劑的物質(zhì)有瓊脂、明膠、硅膠等，以瓊脂最為常用。固體

培養(yǎng)基在實際中用得十分廣泛。在實驗室中，它被用作微生物的分離、鑒

定、檢驗雜菌、計數(shù)、保藏、生物測定等。

3）半固體培養(yǎng)基如果把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就

制成了半固體培養(yǎng)基。以瓊脂為例，它的用量在0.2~1%之間。這種培養(yǎng)基

有時可用來觀看微生物的動力，有時用來保藏菌種。

3、按照培養(yǎng)基的用途來區(qū)分，可分為選擇培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、鑒

別培養(yǎng)基等。

1）選擇培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種物質(zhì)以殺死或抑制不需要的

菌種生長的培養(yǎng)基，稱之為選擇培養(yǎng)基。如鏈霉素、氯霉素等抑制原核微

生物的生長；而制霉菌素、灰黃霉素等能抑制真核微生物的生長；結(jié)晶紫

能抑制革蘭氏陽性細(xì)菌的生長等。

2）增殖培養(yǎng)基在自然界中，不同種的微生物常生活在一起，為

了分離我們所需要的微生物，在一般培養(yǎng)基中加入一些某種微生物專門喜

愛的營養(yǎng)物質(zhì)，以增加這種微生物的繁育速度，逐步剔除其它微生物，這

種培養(yǎng)基稱為增殖培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基常用于菌種選擇和選擇增菌中。在

某種程度上講，增殖培養(yǎng)基也是一種選擇培養(yǎng)基。

3）鑒別培養(yǎng)基在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使難以區(qū)

分的微生物經(jīng)培養(yǎng)后出現(xiàn)出明顯差別，因而有助開快速鑒別某種微生物。

如此的培養(yǎng)基稱之為鑒別培養(yǎng)基。例如用以檢查飲水和乳品中是否含有腸

道致病菌的伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基確實是一種常用的鑒別性培養(yǎng)基。

有些培養(yǎng)基是具有選擇和鑒別雙重作用。例如食品檢驗中常用的

麥康凱培養(yǎng)基是一例。它含有膽鹽、乳糖和中性紅。膽鹽具有抑制腸道菌

以外的細(xì)菌的作用（選擇性），乳糖和中性紅（指示劑）能關(guān)心區(qū)別乳糖發(fā)

酵腸道菌（如大腸桿菌）和不能發(fā)酵乳糖的腸道致病菌（如沙門氏菌和志

賀氏菌）。

另外，按照培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分是否“完全”，能夠分為差不多培養(yǎng)

基、完全培養(yǎng)基和補(bǔ)充培養(yǎng)基，這類術(shù)語要緊是用在微生物遺傳學(xué)中。按

照培養(yǎng)基用于生產(chǎn)的目的來區(qū)分，能夠分為種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。還

有專門用于培養(yǎng)病毒等寄生微生物的活組織培養(yǎng)基，如雞胚等；專門用于

培養(yǎng)自養(yǎng)微生物的無機(jī)鹽培養(yǎng)基等。

三、培養(yǎng)基制備的差不多方法和注意事項

1、培養(yǎng)基配方的選定

同一種培養(yǎng)基的配方在不同著作中常會有某些差別。因此，除所

用的是標(biāo)準(zhǔn)方法，應(yīng)嚴(yán)格按其規(guī)定進(jìn)行配制外，一樣均應(yīng)盡量收集有關(guān)資

料，加以比較核對，再依據(jù)自己的使用目的，加以選用，記錄其來源。

2、培養(yǎng)基的制備記錄

每次制備培養(yǎng)基均應(yīng)有記錄，包括培養(yǎng)基名稱，配方及其來源，

和各種成份的牌號，最終pH值、消毒的溫度和時刻制備的日期和制備者等,

記錄應(yīng)復(fù)制一份，原記錄儲存?zhèn)洳?，?fù)制記錄隨制好的培養(yǎng)基一同存放、

以防發(fā)生紛亂。

3、培養(yǎng)基成分的稱取

培養(yǎng)基的各種成分必須精確稱取并要注意防止錯亂，最好一次完

成，不要中斷?？蓪⑴浞街糜诎鴤?cè)，每稱完一種成分即在配方面軍做出記

號，并將所需稱取的藥品一次取齊，置于左側(cè)，每種稱取完畢后，即移放

于右側(cè)。完全稱取完畢后，還應(yīng)進(jìn)行一次檢查。

4、培養(yǎng)基各成份的混合和溶化

培養(yǎng)基所用化學(xué)藥品均應(yīng)是化學(xué)純的。使用的蒸煮鍋不得為銅鍋

或鐵鍋，以防有微量銅或鐵混入培養(yǎng)基中，使細(xì)菌不易生長。最好使用不

銹鋼菌加熱溶化，可放入大燒杯或大燒瓶中置高壓蒸汽滅菌器或流淌蒸汽

消毒器中蒸煮溶化。在鍋中溶化時、可先用溫水加熱并隨時擾動、以防焦

化、如發(fā)覺有焦化現(xiàn)象、該培養(yǎng)基即不能使用，應(yīng)重新制備。待大部分固

體成分溶化后，再用較小火力使所有成分完全溶化，迄至煮沸。如為瓊脂

溶化，用另一部分水溶化其它成分，然后將兩溶液充分混合。在加熱溶化

過程中，因蒸發(fā)而丟失的水分，最后必須加以補(bǔ)足。

5、培養(yǎng)基pH的初步調(diào)正

因培養(yǎng)基在加熱消毒過程中、pH會有所變化，培養(yǎng)基各成分完全

溶解后，應(yīng)進(jìn)行PH的初步調(diào)正。例如，牛肉浸液約可降低pH0.2,而腸浸

液pH卻會有明顯的升高。因此，對那個步驟，操作者應(yīng)隨時注意探究體會、

以期能把握培養(yǎng)基的最終PH,保證培養(yǎng)基的質(zhì)量。PH調(diào)整后，還應(yīng)將培

養(yǎng)基煮沸數(shù)分鐘，以利培養(yǎng)基沉淀物的析出。

6、培養(yǎng)基的過濾澄清

液體培養(yǎng)基必須絕對澄清，瓊脂培養(yǎng)基也應(yīng)透亮無明顯沉淀，因

此，須要采納過濾或其它澄清方法以達(dá)到此項要求。一樣液體培養(yǎng)基可用

濾紙過濾法，濾紙應(yīng)折疊成折扇或漏斗形，以幸免因液壓不平均而引起濾

紙破裂。

瓊脂培養(yǎng)基可用清潔的白色薄絨布趁熱過濾。亦可用中間夾有薄

層吸水棉的雙層紗布過濾。新制肉、肝、血和土豆等浸液時、則須先用絨

布將碎渣濾去，再用濾紙反復(fù)過濾。如過濾法不能達(dá)到澄清要求、則須用

蛋清澄清法。馬上冷卻至55?60。C的培養(yǎng)基放入大的三角燒瓶內(nèi)，裝入量

不得超過燒瓶容量的1/2,每1000ml培養(yǎng)基加入1?2個雞蛋的蛋白，強(qiáng)力

振搖3?5分鐘，置高壓蒸汽滅菌器中、121。C加熱20分鐘、取出趁熱以

絨布過濾即可。

7、培養(yǎng)基的分裝

培養(yǎng)基的分裝，應(yīng)按使用的目的和要求，分裝于試管、燒瓶等適

當(dāng)容器內(nèi)。分裝量不得超過容器裝盛量的2/3。容器口可用墊有防濕紙的棉

塞封堵，其外還須用防水紙包扎（現(xiàn)試管一樣多有用螺旋蓋者）。分裝時最

好能使用半自動或電動的定量分裝器。分裝瓊脂斜面培養(yǎng)基時，分裝量應(yīng)

以能形成2/3底層和1/3斜面的量為洽當(dāng)。分裝容器應(yīng)預(yù)先清洗潔凈并經(jīng)干

烤消毒，以利于培養(yǎng)基的完全滅菌。每批培養(yǎng)基應(yīng)另外分裝20ml培養(yǎng)基于

一小玻璃瓶中，隨該批培養(yǎng)基同時滅菌，以為測定該批培養(yǎng)基最終pH之用。

8、培養(yǎng)基的滅菌

一樣培養(yǎng)基可采納121。C高壓蒸汽滅菌15分鐘的方法。在各種

培養(yǎng)基制備方法中，如無專門規(guī)定，即可用此法滅菌。

某些畏熱成分，如糖類，應(yīng)另行配成20%或更高的濃液，以過濾

或間歇滅菌法消毒，以后再用無菌操作技術(shù)、定量加于培養(yǎng)基。明膠培養(yǎng)

基亦應(yīng)用較低溫度滅菌。血液、體液和抗生素等則應(yīng)以無菌操作技術(shù)抽取

和加入于經(jīng)冷卻約50。C左右的培養(yǎng)基中。

瓊脂斜面培養(yǎng)基應(yīng)在滅菌后趕忙取出，冷至55（-60。。時，擺置成

適當(dāng)斜面，待其自然凝固。

9、培養(yǎng)基的質(zhì)量測試

每批培養(yǎng)基制備好以后，應(yīng)認(rèn)真檢查一遍，如發(fā)覺破裂、水分浸

入、色澤專門、棉塞被培養(yǎng)基沾染等、均應(yīng)挑出棄去。并測定其最終pH。

將全部培養(yǎng)基放入36±1。C恒溫箱培養(yǎng)過夜，如發(fā)覺有菌生長，

即棄去。

用有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)菌株接種1~2管或瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)24?48小時，如

無菌生長或生長不行。應(yīng)追查緣故并重復(fù)接種一次，如結(jié)果仍同前，則該

批培養(yǎng)基即應(yīng)棄去，不能使用。

10、培養(yǎng)基的儲存

培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處，最好能放于一般冰箱內(nèi)。放置時刻不宜

超過一周，傾注的平板培養(yǎng)基不宜超過3天。每批培養(yǎng)基均必須附有該批

培養(yǎng)基制備記錄副頁或明顯標(biāo)簽。

接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)

1.接種針2.接種環(huán)3.接種鉤45玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解

剖刀

常用的接種方法有以下幾種：

1）劃線接種這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來

回直線形的移動，就可達(dá)到接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種

針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。

2）三點接種在研究霉菌形狀經(jīng)常用此法。此法即把少量的微生

物接種在平板表面上，成等邊三角形的三點，讓它各自獨立形成菌落后，

來觀看、研究它們的形狀。除三點外，也有一點或多點進(jìn)行接種的。

3）穿刺接種在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力經(jīng)常采納此

法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一樣是半固體培

養(yǎng)基。它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管

底作直線穿刺，如某細(xì)菌具有鞭毛而能運動，則在穿刺線周圍能夠生長。

4）澆混接種該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒

入冷卻至45°C左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，如此菌液就達(dá)到稀釋

的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長出單個的微生物菌

落。

5）涂布接種與澆混接種略有不同，確實是先倒好平板，讓其凝

固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作來回左右的涂布,

讓菌液平均分布，就可長出單個的微生物的菌落。

6）液體接種從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或

者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物

中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種。

7）注射接種該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生

物體內(nèi)，如人或其它動物中，常見的疫苗預(yù)防接種，確實是用注射接種，

接入人體，來預(yù)防某些疾病。

8）活體接種活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的

一種方法，因為病毒必須接種于活的生物體內(nèi)才能生長繁育。所用的活體

能夠是整個動物；也能夠是某個離體活組織，例如猴腎等；也能夠是發(fā)育

的雞胚。接種的方式是注射，也能夠是拌料喂養(yǎng)。

2、無菌操作

培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用通過滅菌的工具（如接種針和吸管等）

在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，那

個過程叫做無菌接種操作。在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。

實驗臺面不論是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用

消毒劑擦洗；水平是倒瓊脂培養(yǎng)基時利于培養(yǎng)皿內(nèi)平板的厚度保持一致。

在實驗臺上方，空氣流淌應(yīng)緩慢，雜菌應(yīng)盡量減少，其周圍雜菌也應(yīng)越少

推舁為序M淅溶切去內(nèi)￥用文胎宏照門禽斗田消蠱利濟(jì)行去々消

圖3—4斜面接種時的無菌操作

（1）接種滅菌（2）開啟棉塞（3）管口滅菌（4）挑起菌苔（5）接種（6）塞好

棉塞

二、分離純化

含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixedculture）o

如果在一個菌落中所有細(xì)胞均來自于一個親代細(xì)胞，那么那個菌落稱為純

培養(yǎng)（Pureculture）o在進(jìn)行菌種鑒定時，所用的微生物一樣均要求為純的

培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化，方法有許多種。

1飾已平痂注

家的稀釋液與熔化好

的,后把這混合液傾注到

無目培養(yǎng)。單一細(xì)胞通

過W事復(fù)上述步驟數(shù)次，

便吊

圖3—5傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解

1.菌懸液2.熔化的培養(yǎng)基3.培養(yǎng)物4.無菌水

2、涂布平板法

第一把微生物懸液通過適當(dāng)?shù)南♂?，取一定量的稀釋液放在無菌

的差不多凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液平均地

涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便能夠得到單個菌落。（圖3—5,b）

3、平板劃線法

最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培

養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線。劃線的方法專門多，常見的比較容易顯現(xiàn)單

個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖3

-6）當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動時，接種環(huán)上的菌液逐步稀釋，

最后在所劃的線上分散著單個細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個細(xì)胞長成一個菌落。（圖

3-7）

4、富集培養(yǎng)法

富集培養(yǎng)法的方法和原理專門簡單。我們能夠制造一些條件只讓

所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生

物行手包括選

擇胄司的培養(yǎng)

基本E固體培

養(yǎng)胃安種到相

應(yīng)由修卷小笠得到純

的名

圖3—6平板劃線分離法

1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法

5、厭氧法

在實驗室中，為了分離某些厭氧菌，能夠利用裝有原培養(yǎng)基的試

管作為培養(yǎng)容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)

基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進(jìn)行接種。接種后，加入無菌的石蠟于

培養(yǎng)基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用N2或

CO2取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時為了更有效

地分離某些厭氧菌，能夠把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)

皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。

三、培養(yǎng)

微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界

因素的阻礙，如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、PH等。微生物的種類

不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。

1、阻礙微生物生長的因素

微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到外界許多

因素的阻礙。阻礙微生物生長的因素專門多，簡要介紹如下。

1)營養(yǎng)物濃度

細(xì)菌的生長率與營養(yǎng)物的濃度有關(guān)：P=umax*C/(K+C)

營養(yǎng)物濃度與生長率的關(guān)系曲線是典型的雙曲線。

K值是細(xì)菌生長的專門差不多的特性常數(shù)。它的數(shù)值專門小，表

明細(xì)菌所需要的營養(yǎng)濃度專門之低，因此在自然界中，它們到處生長。然

而營養(yǎng)太低時，細(xì)菌生長就會遇到困難，甚至還會死亡。這是因為除了生

長需要能量以外，細(xì)菌還需要能量來堅持它的生存。這種能量稱為堅持能。

另一方面，隨著營養(yǎng)物濃度的增加，生長率愈接近最大值。

2)溫度

在一定的溫度范疇內(nèi)，每種微生物都有自已的生長溫度三基點：

最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度。在生長溫度三基點內(nèi)，微

生物都能生長，但生長速率不一樣。微生物只有處于最適生長溫度時，生

長速度才最快，代時最短。超過最低生長溫度，微生物可不能生長，溫度

太低，甚至?xí)劳?。超過最高生長溫度，微生物也要停止生長，溫度過高。

也會死亡。一樣情形下，每種微生物的生長溫度三基點是恒定的。但也常

受其它環(huán)境條件的阻礙而發(fā)生變化。

按照微生物最適生長溫度的不同，可將它們分為三個類型：

a.嗜冷微生物：其是適生長溫度多數(shù)在-10℃-2（TC之間

b.中溫微生物：其最適生長溫度一樣在2（rc—45（之間

c.嗜熱微生物：生長溫度在45寸以上。

3）水分

水分是微生物進(jìn)行生長的必要條件。芽匏、電子萌發(fā)，第一需要

水分。微生物是不能脫離水而生存的。然而微生物只能在水溶液中生長，

而不能生活在純水中。各種微生物在不能生長發(fā)育的水分活性范疇內(nèi)，均

具有狹小的適當(dāng)?shù)乃只钚詤^(qū)域。

4）氧氣

按照微生物對氧氣的需要情形，可將它們分為以下五個類型。

a.需氧微生物

這類微生物需要氧氣供呼吸之用。沒有氧氣，便不能生長，然而

高濃度的氧氣對需氧微生物也是有毒的。專門多需氧微生物不能在氧氣濃

度大于大氣中氧氣濃度的條件下生長。絕大多數(shù)微生物都屬于那個類型。

b.兼性需氧微生物

這類微生物在有氧氣存在或無氧氣存在情形下，都能生長，只只

是所進(jìn)行的代謝途徑不同罷了。在無氧氣存在的條件下，它進(jìn)行發(fā)酵作用,

例如酵母菌的無氧乙醇發(fā)酵。

c.微量需氧微生物

這類菌是需要氧氣的，但只在0.2大氣壓下生長最好。這可能是由

一它們含有在強(qiáng)氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用。

d.耐氧微生物

這類微生物在生長過程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在，可

不能被氧氣所殺死。

c.厭氧微生物

這類微生物在生長過程中，不需要分子氧。分子氧存在對它們生

長產(chǎn)生毒害，不是被抑制，確實是被殺死。

2、培養(yǎng)方法

1）按照培養(yǎng)時是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。

好氧培養(yǎng)：也稱“好氣培養(yǎng)工確實是講這種微生物在培養(yǎng)時，需

要有氧氣加入，否則就不能生長良好。在實驗室中，斜面培養(yǎng)是通過棉花

塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床振蕩，使外

界的空氣源源持續(xù)地進(jìn)入瓶中。

厭氧培養(yǎng)：也稱“厭氣培養(yǎng)”。這類微生物在培養(yǎng)時，不需要氧氣

參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中，最重要的一點確實是要除去培養(yǎng)基中

的氧氣。一樣可采納下列幾種方法：

a.降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位：常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋

酸鹽等，加入到培養(yǎng)基中，便可達(dá)到目的。有的將一些動物的死的或活的

組織如牛心、羊腦加入到培養(yǎng)基中，也可適合厭氧菌的生長。

b.化合去氧：這也有專門多方法，要緊有：用焦性沒食子酸吸取氧

氣；用磷吸取氧氣；用好氧菌與厭氧混合培養(yǎng)吸取氧氣；用植物組織如發(fā)

芽的種子吸取氧氣；用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧。

c.隔絕阻氧：深層液體培養(yǎng)；用石蠟油封存；半固體穿刺培養(yǎng)。

d.替代驅(qū)氧用二氧氣碳驅(qū)代氧氣；用氮氣驅(qū)代氧氣；用真空驅(qū)代

氧氣；用氫氣驅(qū)代氧氣；用混和氣體驅(qū)代氧氣。

2）按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類。

固質(zhì)培養(yǎng)：是將菌種接至疏松而富有營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中，在合

適的條件下進(jìn)行微生物培養(yǎng)的方法。

液體培養(yǎng)：在實驗中，通過液體培養(yǎng)能夠使微生物迅速繁育，獲

得大量的培養(yǎng)物，在一定條件下，依舊微生物選擇增菌的有效方法。

微生物常規(guī)鑒定技術(shù)

一、形狀結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性觀看

1、微生物的形狀結(jié)構(gòu)觀看要緊是通過染色，在顯微鏡下對其形狀、

大小、排列方式、細(xì)胞結(jié)構(gòu)（包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、鞭毛、芽抱

等）及染色特性進(jìn)行觀看，直觀地了解細(xì)菌在形狀結(jié)構(gòu)上特性，按照不同

微生物在形狀結(jié)構(gòu)上的不同達(dá)到區(qū)別、鑒定微生物的目的。

2、細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基表面形成的細(xì)胞群體叫菌落（colony）o不

同微生物在某種培養(yǎng)基中生長繁育，所形成的菌落特點有專門大差異，而

圖3—8細(xì)菌的培養(yǎng)特點

1.點狀2.圓形3.絲狀4.不規(guī)則形5.假根狀6.紡錘狀7.扁平8.隆起

9.凸起10.墊狀11.臍狀12.邊緣整齊13.波狀14.裂片狀15.嚙蝕狀16.絲

狀17.卷發(fā)狀18.絲線狀19.刺毛狀20.串珠狀21.疏展?fàn)?2.樹根狀23.假

根狀24.絲狀25.串珠狀26.乳頭狀27.絨毛狀28.樹根狀29.量杯狀30.蘿

卜狀31.漏斗狀32.囊狀33.層狀34.絮狀35.環(huán)狀36.蹊狀37.膜狀

2）霉菌酵母菌的培養(yǎng)特點：大多數(shù)酵母菌沒有絲狀體，在固體

培養(yǎng)基上形成的菌落和細(xì)菌的專門相似，只是比細(xì)菌菌落大且厚。液體培

養(yǎng)也和細(xì)菌相似，有平均生長、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的絲

狀體，菌絲粗長，在條件適宜的培養(yǎng)基里，菌絲無限伸長沿培養(yǎng)基表面蔓

延。霉菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和袍子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊

緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：泡子青綠色，氣生菌絲

無色，基內(nèi)菌絲褐色。霉菌在固體培養(yǎng)表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀

菌落。

二、生理生化試驗

微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化

反應(yīng)常用來鑒別一些在形狀和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生

化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。

微生物檢驗中常用的生化反應(yīng)有：

1、糖酵解試驗

不同微生物分解利用糖類的能力有專門大差異，或能利用或不能

利用，能利用者，或產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣。可用指示劑及發(fā)酵管檢驗。

試驗方法：以無菌操作，用接種針或環(huán)移取純培養(yǎng)物少許，接種

于發(fā)酵液體培養(yǎng)基管，若為半固體培養(yǎng)基，則用接種針作穿刺接種。接種

后，置36±1.0。C培養(yǎng)，每天觀看結(jié)果，檢視培養(yǎng)基顏色有無改變（產(chǎn)酸）,

小倒管中有無氣泡，微小氣泡亦為產(chǎn)氣陽性，若為半固體培養(yǎng)基，則檢視

沿穿刺線和管壁及管底有無微小氣泡，有時還可看出接種菌有無動力，若

有動力、培養(yǎng)物可呈彌散生長。

本試驗要緊是檢查細(xì)菌對各種糖、醇和糖昔等的發(fā)酵能力，從而

進(jìn)行各種細(xì)菌的鑒別，因而每次試驗，常需同時接種多管。一樣常用的指

示劑為酚紅、漠甲酚紫，澳百里藍(lán)和An-drade指示劑。

2、淀粉水解試驗

某些細(xì)菌能夠產(chǎn)生分解淀粉的酶，把淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。

淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色。

試驗方法：以18?24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平

板（一個平板可分區(qū)接種，試驗數(shù)種培養(yǎng)物）或直截了當(dāng)移種于淀粉肉湯

中，于36±1。C培養(yǎng)24?48h,或于20。培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直截了

當(dāng)?shù)谓谂囵B(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。趕忙檢

視結(jié)果，陽性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物

周圍顯現(xiàn)無色透亮環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反應(yīng)則無透亮環(huán)或肉湯呈

深藍(lán)色。

淀粉水解系逐步進(jìn)行的過程，因而試驗結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶的

能力、培養(yǎng)時刻，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必

須為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜儲存于冰箱，因而

以臨用時制備為發(fā)。

3、V-P試驗

某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，

丙酮酸縮合，脫竣成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化

為二乙酰，二乙酰與蛋白豚中的胭基生成紅色化合物，稱v—P(+)反應(yīng)。

試驗方法：

1)O'Meara氏法：將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1。C

培養(yǎng)48h,培養(yǎng)液1ml加O'Meara試劑(加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酎

Creatinine的40%氫氧化鈉水溶液)1ml,搖動試管1?2min,靜置于室溫或

36±1°C恒溫箱，若4h內(nèi)不出現(xiàn)伊紅、即判定為陰性。亦有主張在48?5

0°C水浴放置2h后判定結(jié)果者。

2)Barritt氏法：將試驗菌接種于通用培養(yǎng)基，于36±1°C培養(yǎng)

4天、培養(yǎng)液2.5ml先加入5°Ca蔡酚(2-na-phthol)純酒精溶液0.6ml,

再加40%氫氧化鉀水溶液0.2ml,搖動2~5min,陽性菌常趕忙出現(xiàn)紅色，

若無紅色顯現(xiàn)，靜置于室溫或36±1°C恒溫箱，如2h內(nèi)仍不顯現(xiàn)紅色、

可判定為陰性。

3)快速法：將0.5%肌酸溶液2滴放于小試管中、挑取產(chǎn)酸反應(yīng)

的三糖鐵瓊脂斜面培養(yǎng)物一接種環(huán)，乳化接種于其中，加入5%a-蔡酚3

滴，40%氫氧化鈉水溶液2滴，振動后放置5min,判定結(jié)果。不產(chǎn)酸的培

養(yǎng)物不能使用。

本試驗一樣用于腸桿菌科各菌屬的鑒別。在用于芽胞桿菌和葡萄

球菌等其它細(xì)菌時，通用培養(yǎng)基中的磷酸鹽可阻礙乙酰甲基醇的產(chǎn)生，故

應(yīng)省去或以氯化鈉代替。

4、甲基紅(MethylRed)試驗

腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮

酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸

和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指

示劑變紅。

試驗方法：挑取新的待試純培養(yǎng)物少許，接種于通用培養(yǎng)基，培

養(yǎng)于36±1°C或30°C(以30°C較好)3?5天，從翌日起，每日取培養(yǎng)

液1ml,加甲基紅指示劑1?2滴，陽性呈鮮紅色，弱陽性呈淡紅色，陰性為

黃色。迄至發(fā)覺陽性或至第5天仍為陰性、即可判定結(jié)果。

甲基紅為酸性指示劑，pH范疇為4.4?6.0,其pK值為5.0。故在p

H5.0以下，隨酸度而增強(qiáng)黃色，在pH5.0以上，則隨堿度而增強(qiáng)黃色，在

pH5.0或上下接近時，可能變色不夠明顯，現(xiàn)在應(yīng)延長培養(yǎng)時刻，重復(fù)試驗。

5、靛基質(zhì)（Imdole）試驗

某些細(xì)菌能分解蛋白陳中的色氨酸，生成呻味。哼I喋的存在可用

顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來。呻喙與對二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰哼I喋，為紅

色化合物。

試驗方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗培養(yǎng)基管，于36±1C

培養(yǎng)24h時后，取約2ml培養(yǎng)液，力口入Kovacs氏試劑2?3滴，輕搖試管，

呈紅色為陽性，或先加少量乙醛或二甲苯，搖動試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，

待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸

面呈紅色，即為陽性。

實驗證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽性

反應(yīng)，若先用二甲苯或乙醛等進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲

基靛基質(zhì)在溶劑中出現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。

6、硝酸鹽（Nitrate）還原試驗

有些細(xì)菌具有還原硝酸鹽的能力，可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽、

氨或氮氣等。亞硝酸鹽的存在可用硝酸試劑檢驗。

試驗方法：臨試前將試劑的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（a—蔡

胺乙醇溶液）試液各0.2ml等量混合、取混合試劑約0.1ml、加于液體培養(yǎng)

物或瓊脂斜面培養(yǎng)物表面，趕忙或于lOmin內(nèi)出現(xiàn)紅色即為試驗陽性，若

無紅色顯現(xiàn)則為陰性。

用a-蔡胺進(jìn)行試驗時，陽性紅色消退專門快、故加入后應(yīng)趕忙判

定結(jié)果。進(jìn)行試驗時必須有未接種的培養(yǎng)基管作為陰性對比。a-蔡胺具有

致癌性、故使用時應(yīng)加注意。

7、明膠（Gelatin）液化試驗

有些細(xì)菌具有明膠酶（亦稱類蛋白水解酶），能將明膠先水解為多

肽，又進(jìn)一步水解為氨基酸，失去凝膠性質(zhì)而液化。

試驗方法：挑取18?24h待試菌培養(yǎng)物，以較大量穿刺接種于明膠

高層約2/3深度或點種于平板培養(yǎng)基。于20~22匕培養(yǎng)7?14天。明膠高層

亦可培養(yǎng)于36±1匕。每天觀看結(jié)果，若因培養(yǎng)溫度高而使明膠本身液化時

應(yīng)不加搖動、靜置冰箱中待其凝固后、再觀看其是否被細(xì)菌液化，如確被

液化，即為試驗陽性。平板試驗結(jié)果的觀看為在培養(yǎng)基平板點種的菌落上

滴加試劑，若為陽性，10?20min后，菌落周圍應(yīng)顯現(xiàn)清晰帶環(huán)。否則為陰

性。

8、尿素酶（Urease）試驗

有些細(xì)菌能產(chǎn)生尿素酶，將尿素分解、產(chǎn)生2個分子的氨，使培

養(yǎng)基變?yōu)閴A性，酚紅呈粉紅色。尿素酶不是誘導(dǎo)酶，因為不論底物尿素是

否存在，細(xì)菌均能合成此酶。其活性最適pH為7.0。

試驗方法:挑取18~24h待試菌培養(yǎng)物大量接種于液體培養(yǎng)基管中，

搖均，于36±1寸培養(yǎng)10,60和120m