熒光分光光度法

熒光分光光度法基本要求：了解熒光光譜法的基本原理和應用特點。了解熒光分光光度計的組成以及特點。掌握熒光光譜法的定量分析方法。了解影響熒光強度的因素。第2頁,共28頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)概論

回顧：四大類電化學分析法光學分析法色譜分析法其它分析方法原子光譜法分子光譜法X射線光譜法核磁波譜法紫外-可見光分光光度法熒光分光光度法紅外吸收光譜法拉曼光譜法第3頁,共28頁，2024年2月25日，星期天熒光粉(俗稱夜光粉)，通常分為光致儲能夜光粉和帶有放射性的夜光粉兩類?！盁晒夥壑饕性霭鬃饔茫诩垙?、包裝袋、洗衣粉、塑料、紡織品等上常有應用，這也難怪塑料袋上檢出熒光粉?！睙晒夥鄣姆N類很多，現(xiàn)在市場上常見的就有500多個品種，性狀各異，我們常用的Ａ4打印紙上就有熒光粉。第4頁,共28頁，2024年2月25日，星期天一、應用：

1.定量分析能產(chǎn)生熒光或能形成熒光配合物的物質。2.簡單定性回答“是不是”。二、特點：

靈敏度高，比吸收光譜法高103~104倍。ppb選擇性比吸收光譜法好。第5頁,共28頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)

基本原理

一、分子熒光的產(chǎn)生物質吸收光輻射價電子從基態(tài)躍到激發(fā)態(tài)，然后再回到基態(tài)釋放能量⒈以熱能的形式。⒉以光輻射的形式。以光輻射形式釋放能量時，發(fā)射熒光。這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。熒光磷光無輻射躍遷激發(fā)態(tài)亞穩(wěn)態(tài)（三重態(tài)）基態(tài)第6頁,共28頁，2024年2月25日，星期天分子的去活化過程：第7頁,共28頁，2024年2月25日，星期天當處于基態(tài)單重態(tài)（S0）的分子吸收波長為λ1和λ2的輻射后,分別被激發(fā)到第一激發(fā)單重態(tài)（S1*）和第二激發(fā)單重態(tài)(S2*)的任意振動能級上,而后發(fā)生以下過程：

振動弛豫:

在溶液中，受激的溶質分子與溶劑分子碰撞，而失去過剩的能量，以10-13~10-11s的極快速度，降至同一電子態(tài)的最低能級上，這一過程屬于無輻射躍遷。內(nèi)轉換:當兩個電子能級非?？拷灾缕湔駝幽芗売兄丿B時，如第一激發(fā)單重態(tài)的較高振動能級與第二激發(fā)單重態(tài)的某一較低振動能級的位能相同，可發(fā)生電子由高電子能級以無輻射躍遷的方式躍遷至低能級上。此過程效率高，速度快，一般只需10-13~10-11s。

熒光發(fā)射:

處于激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級的分子，也存在幾種可能的去活化過程。若以10-9~10-7s左右的時間發(fā)射光量子回到基態(tài)的各振動能級，這一過程就有熒光發(fā)生。第8頁,共28頁，2024年2月25日，星期天

最常見的光致發(fā)光：熒光和磷光。兩者發(fā)光機理不同，壽命不同。熒光壽命10-9～10-6秒，磷光壽命10-3～10秒。熒光可由激發(fā)態(tài)的分子產(chǎn)生，也可由激發(fā)態(tài)的原子產(chǎn)生，本章介紹分子熒光。由于熒光的產(chǎn)生由價電子引起，所以，熒光光譜屬于電子光譜，其波長范圍位于：紫外光區(qū)和可見光區(qū)。第9頁,共28頁，2024年2月25日，星期天二、激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

⒈激發(fā)光譜固定熒光波長，以激發(fā)光波長對熒光強度(F)所作的光譜曲線。300350400λ(nm)

F【例】硫酸奎寧（0.1mol/L硫酸溶液）的激發(fā)光譜。第10頁,共28頁，2024年2月25日，星期天⒉

發(fā)射(熒光)光譜固定激發(fā)光波長，以熒光波長對熒光強度F所作的光譜曲線。300350400λ(nm)

F【例】蒽（乙醇溶液）的發(fā)射光譜。第11頁,共28頁，2024年2月25日，星期天激發(fā)光譜和熒光光譜:

硫酸奎寧的激發(fā)光譜和熒光光譜

蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜

熒光物質的最大激發(fā)波長和最大熒光波長是鑒定物質的根據(jù)，也是定量測定時最靈敏的條件。

第12頁,共28頁，2024年2月25日，星期天三、分子熒光與分子結構的關系

分子要產(chǎn)生熒光，首先要能吸收紫外光或可見光。能產(chǎn)生熒光的分子具有的結構特點：共軛雙鍵剛性平面多環(huán)結構

【例】芴具有剛性平面，產(chǎn)生的熒光比聯(lián)二苯強。第13頁,共28頁，2024年2月25日，星期天

1具有共軛雙鍵體系的分子：大多數(shù)熒光物質都具有芳香環(huán)或雜環(huán)，因為這些化合物都具有易發(fā)生π→π*或n→π*躍遷的電子共軛結構，π電子的非定域性越大，就越容易被激發(fā)，分子的熒光效率越大，因此凡能提高π電子共軛程度的結構，如對-苯基化、間-苯基化、乙烯化的作用都會增大熒光的強度。

2苯環(huán)上取代基的類型：給電子基團。如-OH、-NH2常使熒光增強。與π電子體系互相作用較小的取代基。如-SO3H對分子熒光影響不明顯。吸電子基團如-COOH、-CO減弱甚至破壞熒光。

第14頁,共28頁，2024年2月25日，星期天3具有剛性平面結構的分子：剛性的不飽和的平面結構具有較高的熒光效率，分子剛性及共平面性越大，熒光效率越高，酚酞和熒光素比較，熒光素中多一個氧橋，使分子的三個環(huán)成一個平面，其共平面性增加，使π電子的共軛度增加，因而熒光素有強烈熒光，而酚酞的熒光很弱。

酚酞

熒光素第15頁,共28頁，2024年2月25日，星期天四、熒光強度與濃度的關系

Φ：量子效率，發(fā)射光量子與吸收光量子之比。I0：入射光強度ε：摩爾吸光系數(shù)b：光程c：濃度F=2.303ΦI0εbc公式成立前提條件：εbc=A<0.05

即：當試樣濃度較低時（c<0.05/εb），C與F方成線性。（如果濃度過高，分子碰撞機會增大，而產(chǎn)生無輻射去激活，造成線性偏離。）第16頁,共28頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)

熒光分光光度計

一、基本結構示意圖

特點：1．光源方向與檢測方向成直角；2．二個單色器。·顯示器檢測器熒光單色器樣品池激發(fā)光單色器光源第17頁,共28頁，2024年2月25日，星期天二、主要部件及功能

1．光源高壓汞蒸氣燈，氙燈。能提供紫外光和可見光，光強度比紫外-可見光分光光度計光源大得多。2．激發(fā)光單色器作用：提供單波長的激發(fā)光。色散元件：棱鏡或光柵。出射狹縫寬度可調。第18頁,共28頁，2024年2月25日，星期天3．樣品池須用石英材料制成。4．熒光單色器將樣品池中的散射光、反射光、雜質熒光等濾掉，只讓熒光通過。出射狹縫寬度可調。5．檢測器光電轉換元件，測定熒光的強度。檢測方向與激發(fā)光方向垂直：在垂直方向上沒有透過光的干擾。由于熒光的強度較弱，一般以光電倍增管作檢測器。第19頁,共28頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)

定量分析

一、定量方法一般采用工作直線法。作C—F直線。FC第20頁,共28頁，2024年2月25日，星期天⑴配制一系列待測成分的標準溶液C1C2C3C4C5⑵測出相應的熒光強度F1F2F3F4F5⑶建立工作直線（F

→C）①作圖法②回歸法⑷測量待測樣品，得F樣①從工作直線上找到待測成分的濃度C樣②由回歸方程計算出C樣第21頁,共28頁，2024年2月25日，星期天定量分析方法校準曲線法：以已知量的標準物質，按試樣相同方法處理后，配成一系列不同濃度的標準溶液，在儀器調零后再以濃度最大的標準溶液作基準，調節(jié)熒光強度讀數(shù)為100；然后測出其他標準溶液的相對熒光強度和空白溶液的相對熒光強度；扣除空白值后，以熒光強度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線；然后將處理后的試樣配成一定濃度的溶液，在同一條件下測定其相對熒光強度，扣除空白值后，從校準曲線上求出其含量。第22頁,共28頁，2024年2月25日，星期天分子熒光分析法在檢驗中的應用尿液中的色胺的測定尿中色胺的含量是色氨酸代謝的一個標志。色胺有天然熒光，激發(fā)峰285nm，熒光峰360nm。把尿或組織液的色胺萃取出來，就可直接檢測。在0.1~8μg/15mL范圍內(nèi)，熒光強度與色胺濃度呈線性關系。

第23頁,共28頁，2024年2月25日，星期天食品中維生素B2的測定:

維生素B2（核黃素）在430~440nm藍光照射下會發(fā)出綠色熒光，λem為535nm。它在pH6~7的溶液中熒光強度最大，而在pH11時熒光消失；但在堿性溶液經(jīng)光線照射發(fā)生分解作用或在酸性KMnO4氧化下都會生成熒光強度比維生素B2強得多的黃光素，并可溶于氯仿。利用此性質可提高測定的靈敏度和選擇性。

核黃素

黃光素

第24頁,共28頁，2024年2月25日，星期天數(shù)據(jù)處理先預掃描，可以發(fā)現(xiàn)這些面巾紙中所含熒光物質一樣，都為波長370的熒光物質，然后用370的光來照射，產(chǎn)生熒光，根據(jù)拉伯比爾定律，物質熒光物質的強度應該與濃度成線性關系。然后得到一系列的強度：下表是所測熒光物質的含量排名情況

名稱強度排名欣卉159.14

1

舒潔（Disney）173.67

2

五月花195.89

3

清風（抽式）216.49

4

舒潔（一般）234.54

5

心相?。ǔ槭剑?43.35

6

潔云（雅致）257.19

7

妮飄（一般）272.15

8

心相印（薄荷）298.89

9

純點300.9

10

妮飄（hellokitty）妮飄（hellokitty）11

妙芙（康師傅）1010.83

12

思蜜兒（抽式）1000以上13

黃色一般草稿紙999.99

14

A4紙比普通草稿紙多很多15

第25頁,共28頁，2024年2月25日，星期天二、影響熒光強度測定的因素

1．激發(fā)光照射有一些熒光物質若受到強光照射，會發(fā)生分解而導致F↓。所以，熒光分光光度計通常在激發(fā)光單色器后裝配有光閘，在測定時才打開光閘讓激發(fā)光照射樣品池。2．溫度溫度↑，熒光效率下降，F(xiàn)↓。（因為，溫度↑，增加分子間碰撞機會而使能量消耗掉。）第26頁,共28頁，2024年2月25日，星期天4．溶劑有些溶劑會使熒光效率下降，也可能帶來干擾熒光。