DB32T3685-2019豬薩佩羅病毒檢測技術

ICS65.020.30

B40

DB32

江蘇省地方標準

DB32/T3685—2019

豬薩佩羅病毒檢測技術規(guī)程

DetectiontechnicalregulationforPorcineSapelovirus

2019-12-03發(fā)布2019-12-25實施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3685—2019

豬薩佩羅病毒檢測技術

1范圍

本標準規(guī)定了豬薩佩羅病毒的核酸檢測（RT-PCR法）、血清學檢測（間接ELISA方法）等要求。

本標準規(guī)定的RT-PCR法適用于本病毒的抗原確診，間接ELISA試驗適用于血清學的普查。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修訂單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

NY/T541動物疫病實驗室檢驗采樣方法

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

豬薩佩羅病毒PorcineSapelovirus（PSV）

單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科薩佩羅病毒屬。該病毒能引起中度或嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、

腹瀉、繁殖障礙和肺炎，感染豬康復后仍然會繼續(xù)排毒，成為重要的病毒傳播源，因此該病毒在豬群中

感染率很高，嚴重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

4核酸檢測（RT-PCR法）

4.1材料準備

PCR引物P15`-GAGAAGGTAAAGATGGGCAAAAC-3`和P25`-

AATACAGGATGACACAGGAAGGG-3`（見附錄B）。PCR相關試劑。豬薩佩羅病毒陽性病料RNA提

取物反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為陽性對照，水作為陰性對照。高速離心機（10000r/min）、PCR儀、電泳儀、

水平電泳槽凝膠成像系統(tǒng)（或紫外投射儀）、移液器等儀器。

4.2操作步驟

4.2.1DNA模板制備

按NY/T541規(guī)定的方法，采集待檢豬的病料置于-20℃以下冰箱保存。臨床組織病料樣品加入1×PBS

緩沖液進行充分研磨后凍融3次，高速10000r/min離心5min，取上清提取病毒總RNA（參照RNA提取試

劑盒說明書），并反轉(zhuǎn)錄成cDNA（利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒），保存?zhèn)溆谩?/p>

4.2.2PCR

1

DB32/T3685—2019

PCR反應體系：2xTaqMasterMix12.5μL，P1（20pmol/μL）1.0μL，P2（20pmol/μL）1.0μL，模

板2μL～5μL，加ddH2O至總體積25μL。反應條件：預變性94℃5min，94℃30s，擴增的退火溫度分

別采用55℃進行擴增30s，72℃30s，35個循環(huán)72℃延伸10min。

4.2.3電泳

制備1%瓊脂糖凝膠，內(nèi)加適量溴化乙錠或其替代物，取PCR產(chǎn)物10μL～20μL分別與適量加樣

緩沖液混合后，加樣到電泳孔中，9V/cm恒壓下電泳15min～30min。將電泳好的凝膠放到紫外投射儀

或凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果。

4.3結果判定

陽性對照擴增到689bp條帶，同時陰性對照無條帶時，試驗成立。

在試驗結果成立的前提下，如果樣品擴增到689bp條帶，可確認為樣品為豬薩佩羅病毒PCR陽性。

4.4廢棄物處理和防止污染的措施

檢測過程中的廢棄物，應做好無害化處理，檢測過程中防止交叉污染的措施見附錄A。

5血清學檢測（間接ELISA方法）

5.1材料準備

豬薩佩羅病毒重組3C表達抗原，酶標抗體，標準陰性血清、標準陽性血清，酶標板及其他必要的

試驗溶液和酶標儀、移液器等儀器。待檢血清樣品采集于疑似患病豬場。

5.2操作步驟

5.2.1包被：用包被液將豬薩佩羅3C蛋白抗原稀釋到工作濃度加入酶標板孔內(nèi)，每孔100μL，4℃冰箱

過夜。

5.2.2洗滌：甩掉酶標板孔內(nèi)的液體，加入洗滌液200ul/孔，室溫下浸泡5min，甩去洗滌液，再重新

加入洗滌液，連續(xù)洗3次，最后一次甩掉洗滌液后，拍干酶標板。

5.2.3封閉：各孔加入5%的脫脂乳封閉液200μL，37℃作用2h。按5.2.2步驟洗滌四次。

5.2.4加入待檢血清和陰、陽性血清對照：待檢血清用稀釋液1:320稀釋，每孔加100μL。同時將陰、

陽性血清作對照。37℃作用45min，重復5.2.2步驟，洗滌4次。

5.2.5加入酶標抗體：用稀釋液將酶標抗體按1:10000稀釋，每孔加入100μL，37℃作用30min，重復5.2.2

步驟，洗滌4次。

5.2.6加入底物，每孔加100μL，室溫避光顯色8min。

5.2.7終止反應，每孔加入50μL終止液終止反應。

5.2.8測定光吸收值(OD)，在酶聯(lián)免疫檢測儀上于450nm波長處測定光吸收值(OD)。

5.3結果判定

用酶標儀檢測OD值，計算S/P值，S/P值=（樣品血清OD450nm值-陰性血清OD450nm值）/（陽性

血清OD450nm值-陰性血清OD450nm值）。當樣品S/P值<0.150時，判為陰性；樣品S/P值>0.212時判為

陽性；0.150≤樣品S/P值≤0.212時，判為疑似。

2

DB32/T3685—2019

_________________________________

3

DB32/T3685—2019

前言

本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標準由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院提出并歸口。

本標準起草單位：江蘇省農(nóng)業(yè)科學院。

本標準主要起草人：李彬、范寶超、孫杰、何孔旺、郭容利、周金柱、俞正玉。

I

DB32/T3685—2019

豬薩佩羅病毒檢測技術

1范圍

本標準規(guī)定了豬薩佩羅病毒的核酸檢測（RT-PCR法）、血清學檢測（間接ELISA方法）等要求。

本標準規(guī)定的RT-PCR法適用于本病毒的抗原確診，間接ELISA試驗適用于血清學的普查。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修訂單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

NY/T541動物疫病實驗室檢驗采樣方法

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

豬薩佩羅病毒PorcineSapelovirus（PSV）

單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科薩佩羅病毒屬。該病毒能引起中度或嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、

腹瀉、繁殖障礙和肺炎，感染豬康復后仍然會繼續(xù)排毒，成為重要的病毒傳播源，因此該病毒在豬群中

感染率很高，嚴重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。

4核酸檢測（RT-PCR法）

4.1材料準備

PCR引物P15`-GAGAAGGTAAAGATGGGCAAAAC-3`和P25`-

AATACAGGATGACACAGGAAGGG-3`（見附錄B）。PCR相關試劑。豬薩佩羅病毒陽性病料RNA提

取物反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為陽性對照，水作為陰性對照。高速離心機（10000r/min）、PCR儀、電泳儀、

水平電泳槽凝膠成像系統(tǒng)（或紫外投射儀）、移液器等儀器。

4.2操作步驟

4.2.1DNA模板制備

按NY/T541規(guī)定的方法，采集待檢豬的病料置于-20℃以下冰箱保存。臨床組織病料樣品加入1×PBS

緩沖液進行充分研磨后凍融3次，高速10000r/min離心5min，取上清提取病毒總RNA（參照RNA提取試

劑盒說明書），并反轉(zhuǎn)錄成cDNA（利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒），保存?zhèn)溆谩?/p>

4.2.2PCR

1

DB32/T3685—2019

PCR反應體系：2xTaqMasterMix12.5μL，P1（20pmol/μL）1.0μL，P2（20pmol/μL）1.0μL，模

板2μL～5μL，加ddH2O至總體積25μL。反應條件：預變性94℃5min，94℃30s，擴增的退火溫度分

別采用55℃進行擴增30s，72℃30s，35個循環(huán)72℃延伸10min。

4.2.3電泳

制備1%瓊脂糖凝膠，內(nèi)加適量溴化乙錠或其替代物，取PCR產(chǎn)物10μL～20μL分別與適量加樣

緩沖液混合后，加樣到電泳孔中，9V/cm恒壓下電泳15min～30min。將電泳好的凝膠放到紫外投射儀

或凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果。

4.3結果判定

陽性對照擴增到689bp條帶，同時陰性對照無條帶時，試驗成立。

在試驗結果成立的前提下，如果樣品擴增到689bp條帶，可確認為樣品為豬薩佩羅病毒PCR陽性。

4.4廢棄物處理和防止污染的措施

檢測過程中的廢棄物，應做好無害化處理，檢測過程中防止交叉污染的措施見附錄A。

5血清學檢測（間接ELISA方法）

5.1材料準備

豬薩佩羅病毒重組3C表達抗原，酶標抗體，標準陰性血清、標準陽性血清，酶標板及其他必要的

試驗溶液和酶標儀、移液器等儀器。待檢血清樣品采集于疑似患病豬場。

5.2操作步驟

5.2.1包被：用包被液將豬薩佩羅3C蛋白抗原稀釋到工作濃度加入酶標板孔內(nèi)，每孔100μL，4℃冰箱

過夜。

5.2.2洗滌：甩掉酶標板孔內(nèi)的液體，加入洗滌液200ul/孔，室溫下浸泡5min，甩去洗滌液，再重新

加入洗滌液，連續(xù)洗3次，最后一次甩掉洗滌液后，拍干酶標板。

5.2.3封閉：各孔加入5%的脫脂乳封閉液200μL，37℃作用2h。按5.2.2步驟洗滌四次。

5.2.4加入待檢血清和陰、陽性血清對照：待檢血清用稀釋液1:320稀釋，每孔加100μL。同時