外周血單個核細胞分離

外周血單個核細胞的分離及(Ji)活力測定IsolationandstorageofPBMCandviabilitytest第一頁，共二十頁。實(Shi)驗原理人外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）包括淋巴細胞和單核細胞。單個核細胞的體積、形態(tài)和比重與外周血其他細胞不同。因此利用一種介于1.075-1.090之間的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）分離液作密度梯度離心，離心后不同比重的血細胞在分離液中呈梯度分布,從而分離出PBMC。第二頁，共二十頁。人血液中各種細胞的密度(Du)如下：紅細胞：1.093白細胞：1.092淋巴細胞和單核細胞：1.075-1.090血小板：1.030-1.035F/H=1.077±0.001第三頁，共二十頁。肝素抗凝全血(Xue)+等量Hanks液將F/H管稍傾斜將稀釋血液在距分層液界面上1cm處沿試管壁緩慢加至分層液上面。應注意保持兩界面清晰，勿使血液混入分層液內(nèi)。Ficoll/Hypaque(2:1)1500rpm,20min水平離心第四頁，共二十頁。血小板第五頁，共二十頁。第六頁，共二十頁。⒈簡述補體的概念、分泌細胞及激活途徑。⒉簡述補體的經(jīng)典激活途徑的具體過程(Cheng)。⒊補體結(jié)合反應為什么需分兩階段進行？如果將幾種成分反應順序顛倒，結(jié)果會如何？⒋參加補體結(jié)合反應的各已知成分，為什么須預先滴定？試驗中所設計的四種對照管有何意義？第七頁，共二十頁。用毛細吸管輕輕插入灰白色層，沿管壁輕輕吸出該層的單個核細胞，盛入另一支(Zhi)離心管中。將所得到的PBMC懸液用5倍體積的Hanks液或RPMI-l640洗滌2次，1500rpm5min。第八頁，共二十頁。淋巴細(Xi)胞濃度（細(Xi)胞數(shù)/ml）=四個大方格內(nèi)細胞數(shù)/4×104細胞計數(shù)板計數(shù)細胞,調(diào)整細胞至所需濃度第九頁，共二十頁。臺盼藍(Lan)染色測定細胞存活率臺盼藍（trypanblue）染色法是測定細胞活力的最簡便的方法。臺盼藍又稱錐藍，是一種陰離子型染料，它不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色，但死亡細胞的細胞膜通透性增加，可使染料通過細胞膜進入細胞內(nèi)，使死細胞著色呈藍色。細胞存活率(%)＝無色細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%計數(shù)200個細胞，一般活性應在95％以上第十頁，共二十頁。注(Zhu)意事項1.與血液樣品接觸時應注意安全防護，避免血源性傳染病傳染。2.操作應輕柔，細胞懸液應充分混勻，避免損傷細胞活性及細胞丟失。3.細胞分層液在室溫下比重為l.077±0.001g/L；應避光4℃下保存，取出后逐漸升至室溫后混勻，方可使用。使用中應避免細菌污染。4.稀釋血液可降低紅細胞的凝集，提高淋巴細胞收獲量，但如果要保留血漿成分作其他實驗用時，則不能稀釋血液，以免影響血漿成分。第十一頁，共二十頁。E玫瑰(Gui)花環(huán)試驗

Erythrocyterosetteformationtest第十二頁，共二十頁。原(Yuan)理T淋巴細胞表面有綿羊紅細胞受體（CD2），不需要任何處理可與綿羊紅細胞結(jié)合形成花環(huán)，B淋巴細胞和巨噬細胞無綿羊紅細胞受體，因此形成E花環(huán)的細胞主要是T淋巴細胞。計算外周血中E花環(huán)形成細胞的百分率，可從數(shù)量大致推測機體的細胞免疫狀態(tài)。第十三頁，共二十頁。原(Yuan)理TcellsSRBCE-rosette第十四頁，共二十頁。E玫(Mei)瑰花環(huán)試驗高倍鏡下計數(shù)200個以上的淋巴細胞中花環(huán)形成細胞的百分數(shù)。凡能結(jié)合三個以上SRBC者為花環(huán)形成細胞。正常值：60-80%第十五頁，共二十頁。淋巴細胞功能(Neng)檢測—淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗Detectionoflymphocytefunction：lymphocytetransformationtest第十六頁，共二十頁。原(Yuan)理指體外培養(yǎng)的淋巴細胞與特異性抗原或非特異性促有絲分裂物質(zhì)如植物血凝素（PHA）等接觸后發(fā)生胚變（或返祖）現(xiàn)象，轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞的一種方法。淋巴細胞在抗原或促有絲分裂原的刺激下淋巴細胞的DNA合成而分裂增殖，并在細胞形態(tài)上也向母細胞轉(zhuǎn)化，因此通過形態(tài)學觀察或同位素摻入法可測得細胞分裂增殖的程度，從而判斷淋巴細胞對有關刺激物的反應及其功能，以此了解機體的細胞免疫狀態(tài)。第十七頁，共二十頁。轉(zhuǎn)化(Hua)的淋巴細胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞第十八頁，共二十頁。意(Yi)義由轉(zhuǎn)化率的高低可以了解人體免疫功能狀況。正常人淋巴細胞轉(zhuǎn)化率為50－70%，故此試驗可作為某此疾病診斷和治療的參考。第十九頁，共二十頁。內(nèi)容(Rong)總結(jié)外周血單個核細胞的分離及活力測定。因此利用一種介于1.075-1.090之間的聚蔗糖-泛影葡胺（ficoll-hypaque）分離液作密度梯度離心，離心后不同比重的血細胞在分離