蛋白質分離純化

第七章蛋白質的分離

純化和表征

第一節(jié)

蛋白質的酸堿性質

第二節(jié)蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀

第三節(jié)蛋白質分離純化的一般原則

第四節(jié)蛋白質混合物的分離方法

第五節(jié)蛋白質分子量的測定第六節(jié)蛋白質含量的測定與純度鑒定

第一節(jié)蛋白質的酸堿性質蛋白質是兩性電解質，是多價的。解離基團——側鏈基團（主要），末端α—COOH和α—NH3（次要）

。蛋白質的等電點（pI）等離子點第二節(jié)蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀水化層和雙電層影響蛋白質沉淀的因素沉淀蛋白質的方法：鹽析法有機溶劑沉淀法等電點沉淀法重金屬鹽沉淀法生物堿試劑和某些酸類沉淀法加熱變性沉淀法第三節(jié)蛋白質分離純化的一般原則純化的最終目標：增加純度或比活性，并使產量達到最高值。

前處理粗分級細分級

第四節(jié)蛋白質混合物的分離方法利用溶液度差別的分離方法根據分子大小不同的分離方法根據電荷不同的分離方法蛋白質與其它化合物的專一或非專一相互作用利用溶液度差別的分離方法1.等電點沉淀：（isoelectricprecipitation）2.蛋白質的鹽溶和鹽析（Saltingout）3.有機溶劑分級法：4.溫度對蛋白質溶解度的影響：二.根據分子大小不同的分離方法透析（dialysis）和超過濾（ultrafiltration）：密度梯度（區(qū)帶）離心：凝膠過濾層析（分子排阻層析、分子篩層析、凝膠滲透層析）（gelfiltration）

：

透析（dialysis）UltracentrifugationGelfiltrationchromatography葡聚糖凝膠過濾三.根據電荷不同的分離方法離子交換層析：

電泳：

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

（等）電聚焦（IEF）：

離子交換層析SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳單體：丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺增速劑：TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）、3-二甲胺丙腈引發(fā)劑：過硫酸銨、過硫酸鉀、核黃素特性：機械性能、彈性、透明度、粘著度、孔徑大?。ǖ龋╇娋劢梗↖EF）：蛋白質與其它化合物的專一或非專一相互作用親和層析（Affinitychromatography）吸附分離

疏水層析

AffinitychromatographyHighPressureLiquidChromatography第五節(jié)蛋白質分子量的測定方法：根據化學組成測定最低分子量利用凝膠過濾法測定分子量公式：Ve－Vo=a－b

logM

logM=K1－K2Ve

利用SDS—PAGE法測定分子量公式：

logM=K1－K2μR

4.質譜法5.通過滲透壓測定蛋白質分子量第六節(jié)蛋白質含量的測定與純度鑒定含量：凱氏定氮法（Kjeldahl）

雙縮脲法（biuret）Follin—酚法（Lowry）紫外吸收法染料結合法（Bradford）BCA法：ROOOOOOOOHHHHHHHHHHH+NNNNNNNNNCCCCCCCCCCCCCCCCCCOO-RRRRRRRR1BiruetMethods(carbonyl)2Cu+Phosphomolybdic-phosphotungstateCOH..LowryMethods280nm(aromatic)CoomassieBrilliantBlueG-N=N--NH--OH-SO3-SO3-SO3--N=N--NH--OH-SO3-SO3-SO3-■各種蛋白質定量法原理：■各種蛋白質定量法原理：TyrUVAbsorbanceCu2+Cu+34CoomassieBrilliantBlueG-250加入蛋白質酸性環(huán)境下呈茶色

CBG是一種指示劑470nm595nm

BradfordMethod：精

確準確不精

確+不準確280nm吸光度BiuretMethodLowryMethodBradfordMethod原理圖：BCA分子式：純化過程中需要測定：總蛋白，總活力，比活力，