樣品保存和相關(guān)設(shè)備

樣品存貯及相關(guān)設(shè)備實(shí)驗(yàn)室基本儀器技術(shù)課程1樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024實(shí)驗(yàn)室樣本保存的種類生物大分子（蛋白、核酸）細(xì)菌、酵母血液、組織其他（試劑、組織液等）細(xì)胞（貼壁、懸?。?樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024生物大分子保存的主要因素溫度（加速反應(yīng)）水分（加速反應(yīng)和霉變）光線（光化作用）空氣（水分、氧氣、微生物）PH值（穩(wěn)定范圍）時(shí)間（保存期限）3樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024⑴空氣：空氣的影響主要是潮解、微生物污染和自動(dòng)氧化?？諝庵形⑸锏奈廴究墒箻悠犯瘮∽冑|(zhì)，樣品吸濕后會(huì)引起潮解變性，同時(shí)也為微生物污染提供了有利的條件。某些樣品與空氣中的氧接觸會(huì)自發(fā)引起游離基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，還原性強(qiáng)的樣品易氧化變質(zhì)和失活，如維生素C、巰基酶等。⑵溫度：每種生物大分子都有其穩(wěn)定的溫度范圍，溫度升高10℃，氧化反應(yīng)約加快數(shù)倍，酶促反應(yīng)增加1～3倍。因此通常絕大多數(shù)樣品都是低溫保存，以抑制氧化、水解等化學(xué)反應(yīng)和微生物的生成。⑶水份：包括樣品本身所帶的水份和由空氣中吸收的水份。水可以參加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、離解和霉變。⑷光線：某些生物大分子可以吸收一定波長(zhǎng)的光，使分子活化不利于樣品保存，尤其日光中的紫外線能量大，對(duì)生物大分子制品影響最大，樣品受光催化的反應(yīng)有變色、氧化和分解等，通稱光化作用。因此樣品通常都要避光保存。⑸樣品的pH：保存液態(tài)樣品時(shí)注意其穩(wěn)定的pH范圍，通?？蓮奈墨I(xiàn)和手冊(cè)中查得或做實(shí)驗(yàn)求得，因此正確選擇保存液態(tài)樣品的緩沖劑的種類和濃度就十分重要。⑹時(shí)間：生化和分子生物學(xué)樣品不可能永久存活，不同的樣品有其不同的有效期，因此，保存的樣品必須寫明日期，定期檢查和處理。4樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024DNA保存

短期保存，加無(wú)菌水或TE緩沖液，4°或－20°。長(zhǎng)期保存，剛提取好的DNA直接保存到乙醇里，放－20°或者-70°。需要用的時(shí)候，再離心后，棄去乙醇，加水或TE溶解即可。

DNA本來(lái)就是酸性，所以需要弱堿性環(huán)境保存，如果用中性或者酸性環(huán)境保存時(shí)間長(zhǎng)容易降解。保存時(shí)間長(zhǎng)會(huì)降解。所以還是要盡快的利用了。有文獻(xiàn)報(bào)道高純DNA的最佳保存條件是4度，提純的DNA放在4°一段時(shí)間（數(shù)周-數(shù)月）都沒(méi)問(wèn)題。但是長(zhǎng)期保存建議-20°或-70°，并且濃度不能太低。

5樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024RNA保存

保存RNA應(yīng)該盡量低溫。

若要長(zhǎng)期保存,需沉淀下來(lái)后置于無(wú)水乙醇凍在-70度,用的時(shí)候再離心下來(lái)除去無(wú)水乙醇,用DEPC水溶解。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質(zhì)量的RNA，為了增加貯存RNA樣品的穩(wěn)定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。RNA即使是放在-80度下也會(huì)降解，所以最好的保存方法是將RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA后保存。

提取的RNA保存在DEPC處理的水中，加入RNAse抑止劑，在-80度保存2個(gè)月，應(yīng)該是可以保證不降解的。最好是反轉(zhuǎn)錄后保存。

6樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024蛋白質(zhì)保存

選擇什么樣的貯存方法取決于該蛋白的穩(wěn)定性和你打算保存多長(zhǎng)時(shí)間以及下一步你打算如何利用。注意事項(xiàng)：蛋白溶液應(yīng)避免極端的pH（強(qiáng)酸or強(qiáng)堿），同時(shí)也不能接近其等電點(diǎn)的pH。另外，還應(yīng)該避免其他物質(zhì)的摻入。

如果保存時(shí)間在24h以內(nèi)，大多數(shù)蛋白可以放置到4℃。

如果保存時(shí)間在24h以上，應(yīng)該考慮避免蛋白溶液長(zhǎng)菌，可以事先過(guò)濾一下或者加入抑菌的物質(zhì)（如疊氮化鈉）。

7樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024蛋白質(zhì)有什么比較實(shí)用的保存方法?1.凍成干粉，低溫保存。

2.甘油+防腐劑，低溫保存，甘油濃度5%~50%，防腐劑一般選擇NaN3（疊氮化鈉），但對(duì)于氧化酶類的蛋白，不能使用NaN3，會(huì)影響蛋白活性，推薦不加防腐劑，或者改加PMSF（苯甲基磺酰氟）。

如果抗體用于染色或處理活細(xì)胞，用于體內(nèi)研究：疊氮化鈉在抵抗微生物的同時(shí)，對(duì)其它大部分有機(jī)物也是有毒的，因?yàn)樗钄嗔司€粒體的細(xì)胞色素電子轉(zhuǎn)運(yùn)。

大多數(shù)的蛋白、RNA酶抑制劑都是致癌或潛在致癌的，因?yàn)樗锌赡茏璧K體內(nèi)蛋白、RNA的正常更替。

PMSF通過(guò)與蛋白質(zhì)的serine殘基結(jié)合而達(dá)到抑制serine蛋白酶的作用。

檢測(cè)用的粗蛋白，全蛋白當(dāng)然可以分裝低溫保存，制備級(jí)最好是凍干，-80度存放，但經(jīng)常使用的（比如抗血清、純化的酶）最好采取公司商品化酶類的保存方法，就是50%甘油+低溫，即保證了低溫，甘油又保證了整個(gè)體系不會(huì)結(jié)晶，避免了反復(fù)凍融，而且甘油有穩(wěn)定蛋白活性的作用。8樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024關(guān)于疊氮化鈉的使用

為了防止微生物污染，疊氮化鈉經(jīng)常被加入到抗體中（終濃度0.02%(w/v)）。

在下述情況中不能使用疊氮化鈉：（1）如果抗體用于染色或處理活細(xì)胞，用于體內(nèi)研究：疊氮化鈉在抵抗微生物的同時(shí)，對(duì)其它大部分有機(jī)物也是有毒的，因?yàn)樗钄嗔司€粒體的細(xì)胞色素電子轉(zhuǎn)運(yùn)。（2）要偶聯(lián)帶有氨基基團(tuán)的抗體：疊氮化鈉會(huì)干擾任何含有氨基基團(tuán)的偶聯(lián)，因此在進(jìn)行偶聯(lián)之前，應(yīng)將疊氮化鈉去除。偶聯(lián)后的抗體可以加入疊氮化鈉保存，但是濃度只能是0.01%。

9樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024蛋白保存的注意事項(xiàng)

在4度下頂多保存一個(gè)禮拜。在-20度最長(zhǎng)保存一個(gè)月。如果打算保存數(shù)月之久，要加入一定量甘油，避免“凍傷”。最好的保存辦法還是將蛋白樣品凍干成粉末，放置-80度冰箱。凍干在大多數(shù)情況下可以很好地保存蛋白的活性，但不適于某些蛋白（因有些蛋白對(duì)凍干重溶時(shí)必然產(chǎn)生的鹽離子濃度的急劇變化反應(yīng)不佳，其活性會(huì)永久喪失。蛋白樣品最忌諱反復(fù)凍融。為避免多次凍溶致使蛋白活性降低或變性，應(yīng)該將蛋白溶液分裝保存，一次用多少就取多少。除此之外，還可以加入一些甘油(5-50%(w/v))或者血清(10mg/ml)幫助目的蛋白保持穩(wěn)定。盡量將蛋白保存在冰箱里層，而不是門上。

10樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024抗體的保存

絕大多數(shù)已稀釋的抗體應(yīng)存在4℃-8℃條件下，以免凍融對(duì)抗體蛋白產(chǎn)生有害效應(yīng)?？贵w原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于-20℃條件下，并避免反復(fù)凍融。反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致抗體變性，導(dǎo)致多聚體形成冷凍的抗體溶液應(yīng)置于室溫中緩慢地解凍，應(yīng)絕對(duì)避免用高溫快速解凍。

被細(xì)菌污染的抗體常會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細(xì)菌污染，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉?？贵w經(jīng)真空冷凍干燥后置-20℃以下可保存3-5年。

除非特別要求-20℃凍存，一般4℃可穩(wěn)定一年（無(wú)菌，如加疊氮鈉），因?yàn)榭贵w是一種具有非常穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的蛋白；要求具有活性的蛋白,最好根據(jù)需要分裝保存4℃(一周）、-20℃(一個(gè)月)、-80℃(六個(gè)月)、液氮（基本無(wú)限期）特殊抗體的保存條件：1.酶聯(lián)抗體：永遠(yuǎn)保存在4度，避免凍起來(lái)。否則會(huì)導(dǎo)致酶活性的下降或者喪失。2.偶聯(lián)抗體：所有偶聯(lián)抗體都是在棕色管中或使用錫箔紙避光保存。尤其是熒光抗體，對(duì)光極為敏感，因此在所有的實(shí)驗(yàn)階段也是要避光操作的！3.IgG3的同型對(duì)照：永遠(yuǎn)保存在4度，避免凍起來(lái)。因?yàn)槿绻霈F(xiàn)凍融過(guò)程，該抗體非常容易形成多聚體。無(wú)論是保存還是運(yùn)輸，絕對(duì)避免反復(fù)凍融！反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致抗體變性，導(dǎo)致多聚體形成，從而降低抗體的結(jié)合能力！

11樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024

菌種保藏的原理和方法一、菌種保藏的目的

保存、不退化二、菌種保藏的原理

DNA復(fù)制時(shí)自發(fā)突變是造成菌種退化的原因，因此要?jiǎng)?chuàng)造代謝不活潑的狀態(tài)。

休眠態(tài)（孢子、芽孢）代謝不活潑的狀態(tài)環(huán)境（干燥、低溫、缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)）12樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024真空冷凍干燥保藏法

目前常用的較理想的一種方法。其基本原理是在較低溫度下，（-18℃），快速地將細(xì)胞凍結(jié)，并且保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華。在這樣的環(huán)境中，微生物的生長(zhǎng)和代謝都暫時(shí)停止，不易發(fā)生變異。一般可保存5~10年左右。液氮超低溫保藏法

液氮超低溫保藏技術(shù)是將菌種保藏在-196℃的液態(tài)氮，或在-150℃的氮?dú)庵械拈L(zhǎng)期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。是適用范圍最廣的微生物保藏法，其保存期最長(zhǎng)。因?yàn)橐旱臏囟瓤蛇_(dá)-196℃，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于菌種新陳代謝作用停止的溫度（-130℃），故此時(shí)代謝活動(dòng)已停止。保藏期一般為2~3年，長(zhǎng)的可達(dá)9年之久。13樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024-80℃低溫冷凍保藏

將菌種保藏在-80℃冰箱中以減緩細(xì)胞的生理活動(dòng)進(jìn)行冷凍的一種保藏方法。

在最適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期，進(jìn)行純度檢查后，與保護(hù)劑混合均勻，分裝（分裝時(shí)應(yīng)注意在無(wú)菌條件下操作)。將安瓿管或塑料凍存管置于-80℃冰箱中保藏。

復(fù)蘇方法

從冰箱中取出安瓿管或塑料凍存管，應(yīng)立即放置38℃-40℃水浴中快速?gòu)?fù)蘇并適當(dāng)快速搖動(dòng)。直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止，約需50秒-100秒。開(kāi)啟安瓿管或塑料凍存管，將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

14樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024

細(xì)胞的凍存

按照冷凍保護(hù)液在凍結(jié)后是否形成冰晶來(lái)劃分為兩種。若降溫速率過(guò)快，則形成胞內(nèi)冰，這些胞內(nèi)冰在復(fù)溫過(guò)程中會(huì)發(fā)生再結(jié)晶使細(xì)胞受損;若降溫速率過(guò)慢，則細(xì)胞收縮過(guò)劇，并且細(xì)胞處在高濃度溶液中也會(huì)引起損傷。非玻璃化凍存是利用各種溫級(jí)的冰箱分階段降溫至-70～-80度，然后直接投入液氮進(jìn)行保存；或者是利用電子降溫儀以及利用液氮的氣、液，按一定的降溫速率從室溫降至-100度以下，再直接投入液氮保存的方法。以該種方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液或多或少都有冰晶的形成。細(xì)胞在液氮中可長(zhǎng)期凍存，而不會(huì)影響細(xì)胞活力；在-70度可保存數(shù)月。在將細(xì)胞凍存管投入液氮時(shí)，動(dòng)作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出，可能對(duì)皮膚造成凍傷。凍存管宜采用塑料凍存管，不宜使用玻璃安瓿。因?yàn)樵趶?fù)蘇時(shí)，需要從-196度的液氮中取出凍存管，立即投入37～40度溫水中，溫差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而發(fā)生危險(xiǎn)。冷存管置于4℃10～30分鐘--->-20℃1～2小時(shí)--->-80℃4～12小時(shí)(或隔夜)--->液氮罐長(zhǎng)期儲(chǔ)存。玻璃化凍存則是指利用多種高濃度的冷凍保護(hù)劑聯(lián)合形成的玻璃化冷凍保護(hù)液（丁二醇、丙二醇、二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇、甘油等CPA及適量聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇等高聚合物）保護(hù)懸浮細(xì)胞，直接投入液氮進(jìn)行凍存的方法。以該中方法凍結(jié)的細(xì)胞懸液沒(méi)有冰晶的形成。

15樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024實(shí)驗(yàn)室樣本保存相關(guān)的設(shè)備真空冷凍干燥機(jī)4.液氮罐3.超低溫冰箱、深冷冰箱2.普通冰箱、低溫冰箱1.16樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024生物樣本冷凍儲(chǔ)存溫度建議

17樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024各種生物樣品的建議保存溫度

18樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024冷凍技術(shù)?冷凍原理：冷凍過(guò)程對(duì)細(xì)胞和組織影響的主要來(lái)源于冰晶損傷和溶液滲透壓損傷。若降溫速率過(guò)快，則形成胞內(nèi)冰，這些胞內(nèi)冰在復(fù)溫過(guò)程中會(huì)發(fā)生再結(jié)晶使細(xì)胞受損;若降溫速率過(guò)慢，則細(xì)胞收縮過(guò)劇，并且細(xì)胞處在高濃度溶液中也會(huì)引起損傷。

19樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024內(nèi)旋凍存管與外旋凍存管的使用區(qū)別?外旋凍存管是為超低溫冰箱設(shè)計(jì)，不適用于液氮儲(chǔ)存系統(tǒng)。液氮凍存容器推薦使用內(nèi)旋凍存管。?內(nèi)旋蓋污染問(wèn)題，通過(guò)單手操作解決使用梯度降溫盒或程序降溫儀減少對(duì)細(xì)胞的傷害?蛋白凍存使用急凍。細(xì)胞凍存需要緩慢降溫，需要使用梯度降溫盒或者更嚴(yán)格的程序降溫儀。40C

-200C

-860C液氮會(huì)增加凍存過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的傷害?微量離心管的管壁厚度和插拔式管蓋均不適用于液氮系統(tǒng)，會(huì)出現(xiàn)大量炸管現(xiàn)象，造成樣品的損失20樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024凍存操作的注意事項(xiàng)

?與液氮接觸的樣品需在操作時(shí)注意：?急凍或長(zhǎng)期液氮儲(chǔ)存的樣品會(huì)接觸到液氮?不建議用微量離心管?對(duì)管口進(jìn)行密封，避免液氮滲透?液氮滲入的風(fēng)險(xiǎn)：炸管、樣品間交叉污染?轉(zhuǎn)移過(guò)程中注意使用冰盒?生物安全柜中操作凍存管：?單手操作，避免污染，解決靜電、管子滑落等問(wèn)題?用力適中，避免扭力過(guò)度造成脫絲，影響密封效果?注意做好標(biāo)記：?管蓋和管壁均做標(biāo)記?推薦使用冷凍標(biāo)簽紙和低溫記號(hào)筆

?21樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/202422樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024?注意做好個(gè)人防護(hù)，避免炸傷?護(hù)目鏡、面罩、手套、防護(hù)服?盡量使用鑷子?水浴鍋/燒杯上覆蓋毛巾樣品復(fù)蘇時(shí)的注意事項(xiàng)

?樣品復(fù)蘇時(shí)：?對(duì)于未經(jīng)保護(hù)的凍存管，切忌快速扔進(jìn)水浴中?凍存管從液氮液相取出后必須在液氮?dú)庀嘀袃?chǔ)存24h，這樣可以使得液氮從凍存管中慢慢的蒸發(fā)和逃逸，從而降低凍存管中的壓力。?凍存管從液氮液相取出后快速放置于-20度冰箱30min，再進(jìn)行水浴復(fù)蘇。?凍存管從液氮取出后，用手輕輕擰松管蓋，使液氮蒸發(fā)后再進(jìn)行水浴復(fù)蘇。?對(duì)于不需水浴復(fù)蘇的樣品，建議取出后放置于0~-20度冰盒上，盡量避免發(fā)生擠壓、碰撞、跌落。23樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/202424樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024?提高冰箱空間使用率：?在冰箱中制作必要的支架?使用凍存盒，替代各種手套、袋子、板架?采用節(jié)省空間的凍存管?對(duì)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存的重要樣品：?實(shí)驗(yàn)室重要的菌種、組織、蛋白等樣品做好標(biāo)記冰箱存放樣品的建議

25樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024超低溫冰箱的注意事項(xiàng)

必須靜置冷柜至少24小時(shí)以上才能通電?？障洳环湃胛锲?，通電開(kāi)機(jī)，分階段使冷柜先降溫至﹣40度，正常開(kāi)停后再降到﹣60度，正常開(kāi)停8小時(shí)后再調(diào)到﹣80度，觀察冷柜有正常開(kāi)停24小時(shí)以上。證明冷柜性能正常?？梢韵蚶涔駜?nèi)存放物品。原則上應(yīng)存放﹣60度的物品，不超過(guò)1/3箱體容量。如果存放的物品溫度高于﹣60度，應(yīng)將冷柜溫度設(shè)置在高于存放物品的溫度3度左右(即，如果物品溫度為20度，則將低溫柜溫度設(shè)定在23度)，保證冷柜停機(jī)，并有正常開(kāi)停8個(gè)小時(shí)以上。禁止：所有低溫保存箱均為保存設(shè)備，嚴(yán)禁一次性放入過(guò)多相對(duì)太熱的物品，會(huì)造成壓縮機(jī)長(zhǎng)時(shí)間不停機(jī)，溫度不下降且很容易燒毀壓縮機(jī)。物品一定要分批放入，分階梯溫度降溫，直至所需要的低溫！存取樣品時(shí)門開(kāi)得不要過(guò)大，存取時(shí)間盡量要短。

26樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024液氮罐的安全使用

液氮貯存：液氮貯存種類一般可分為貯存罐、運(yùn)輸罐兩種。貯存罐主要用于室內(nèi)液氮的靜置貯存，不宜在工作狀態(tài)下作遠(yuǎn)距離運(yùn)輸使用；為了滿足運(yùn)輸條件，運(yùn)輸罐主要有專項(xiàng)防震設(shè)計(jì)，除靜置貯存外，還可在充裝液氮狀態(tài)下，作運(yùn)輸使用，但應(yīng)避免劇烈的碰撞和震動(dòng)；另外，在短時(shí)間、短距離內(nèi)使用少量液氮時(shí)，也可以臨時(shí)使用保溫瓶（杯）等器具存放。

27樣品保存和相關(guān)設(shè)備5/8/2024液氮罐使用注意事項(xiàng)

液氮罐的安全使用：正常情況下，液氮貯存在密封式