蛋白質(zhì)的測定

子情境六蛋白質(zhì)和氨基酸的測定（1）食品中的蛋白質(zhì)含量及測定意義（2）蛋白質(zhì)系數(shù)（3）蛋白質(zhì)測定方法食品中的蛋白質(zhì)含量牛肉豬肉兔肉雞肉

20.19.521.221.5大豆米面粉菠菜蘋果

368.3102.4

0.4

測定食品中蛋白質(zhì)的含量，對于評價(jià)食品的營養(yǎng)價(jià)值、合理開發(fā)利用食品資源、提高產(chǎn)品質(zhì)量、優(yōu)化食品配方、指導(dǎo)經(jīng)濟(jì)核算及生產(chǎn)過程控制均具有極重要的意義。

蛋白質(zhì)的測定意義

不同的蛋白質(zhì)其氨基酸構(gòu)成比例及方式不同，故各種不同的蛋白質(zhì)其含氮量也不同，一般蛋白質(zhì)含氮量為16%，即一份氮素相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)。

不同種類食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米，蕎麥，青豆，雞蛋等為6.25，花生為5.46，大米為5.95，大豆及其制品為5.71，小麥粉為5.70，牛乳及其制品為6.38。蛋白質(zhì)系數(shù)

蛋白質(zhì)含量測定最常用的方法

凱氏定氮法是通過測出樣品中的總含氮量再乘以相應(yīng)的蛋白質(zhì)系數(shù)而求出蛋白質(zhì)的含量，包含了核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉、以及含氮色素等非氮蛋白質(zhì)含氮化合物，所以這樣的測定結(jié)果稱為粗蛋白。凱氏定氮法是測定總有機(jī)氮量較為準(zhǔn)確、操作較為簡單的方法之一，可用于所有動(dòng)、植物食品的分析及各種加工食品的分析，可同時(shí)測定多個(gè)樣品，故國內(nèi)外應(yīng)用較為普遍，是個(gè)經(jīng)典分析方法，至今仍被作為標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。此法可應(yīng)用于各類食品中蛋白質(zhì)含量測定凱氏定氮法：常量法、微量法及經(jīng)改進(jìn)后的改良凱氏定氮法

微量凱氏定氮法樣品質(zhì)量及試劑用量較少，且有一套微量凱氏定氮器。目前通用以硫酸銅作催化劑的常量、半微量、微量凱氏定氮法。在凱氏法改良中主要的問題是，氮化合物中氮的完全氨化問題及縮短時(shí)間、簡化操作的問題，即分解試樣所用的催化劑。常量改良凱氏定氮法在催化劑中增加了二氧化鈦。學(xué)習(xí)重點(diǎn)與難點(diǎn)

凱氏定氮法的原理、測定方法及實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范。(1)

原理

樣品與濃硫酸一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。然后加堿蒸餾，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以標(biāo)準(zhǔn)鹽酸或硫酸溶液滴定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。凱氏定氮法

消化反應(yīng)方程式如下：

2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4

＝(NH4)2SO4

＋6CO2

＋12SO2

＋16H2O

濃硫酸具有脫水性，使有機(jī)物脫水后被炭化為碳、氫、氧、氮。

濃硫酸又具有氧化性,將有機(jī)物炭化后轉(zhuǎn)化為二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

二氧化硫使氮還原為氨，本身則被氧化為三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。

H2SO4＋2NH3

＝(NH4)2SO4

在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，加熱蒸餾，即可釋放出氨氣，反應(yīng)方程式如下：

②蒸餾

2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3＋Na2SO4＋2H2O③吸收與滴定

加熱蒸餾所放出的氨，可用硼酸溶液進(jìn)行吸收，待吸收完全后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，因硼酸呈微弱酸性（k＝5.8×10-10），用酸滴定不影響指示劑的變色反應(yīng)，但它有吸收氨的作用，吸收及滴定的反應(yīng)方程式如下：

2NH3+

4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3

(2)測定方法①

樣品消化觀察與思考：1、樣品中加入濃硫酸后，溶液的顏色立即發(fā)生什么變化？2、消化過程中是否有大量的泡沖到瓶頸，原因是什么？3、瓶頸有什么顏色的有毒煙產(chǎn)生？4、如何判斷消化的終點(diǎn)？②

蒸餾

按圖安裝好微量定氮蒸餾裝置。于水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝水至2/3容積處，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。

在接受瓶中加入10ml40g/L硼酸及2滴混合指示劑，將冷凝管下端插入液面以下。③滴定

取下接受瓶，以0.01000mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至微紅色為終點(diǎn)。

式中W—蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；

V0—滴定空白蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；

V1—滴定樣品蒸餾液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液體積，mL；

V2—蒸餾時(shí)吸取樣品稀釋液體積，mL；

C—鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的濃度，mol/L；

0.014—氮的毫摩爾質(zhì)量，g/mmol；

F—蛋白質(zhì)系數(shù)；

m—樣品質(zhì)量，g。(3)結(jié)果計(jì)算(4)樣品的分解條件（1）K2SO4或Na2SO4

：提高溶液的沸點(diǎn)(400℃)(2)催化劑：CuSO4

氧化汞和汞良好的催化劑，但劇毒；硒粉（3）氧化劑過氧化氫硫酸銅的作用①催化劑

Cu2SO4+2H2SO4=2CuSO4+2H2O+SO2↑

2CuSO4=Cu2SO4+SO2↑+O2↑此反應(yīng)不斷進(jìn)行，待有機(jī)物被消化完后，不再有硫酸亞銅（褐色）生成，溶液呈現(xiàn)清澈的藍(lán)綠色。②可以指示消化終點(diǎn)的到達(dá)③下一步蒸餾時(shí)作為堿性反應(yīng)的指示劑。

①

所用試劑應(yīng)用無氨蒸餾水配制。加指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)毫升，以保持水呈酸性。

②若樣品含脂肪或糖較多時(shí)，應(yīng)注意發(fā)生的大量泡沫

應(yīng)加入少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑，防止其溢出瓶外，并注意適當(dāng)控制熱源強(qiáng)度。

③若樣品消化液不易澄清透明，可加入300g/L2~3ml過氧化氫后再加熱。(5)注意事項(xiàng)

④硫酸銅起到催化作用，加速氧化分解。硫酸銅也是蒸餾時(shí)樣品液堿化的指示劑，蒸餾前若加堿量不足，消化液呈藍(lán)色不生成氫氧化銅沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。

氫氧化銅在70～90℃時(shí)發(fā)黑。

⑤若取樣量較大，如干試樣超過5g，可按每克試樣5ml的比例增加硫酸用量。

⑥消化時(shí)間一般約4小時(shí)左右即可，消化時(shí)間過長會(huì)引起氨的損失。一般消化至透明后繼續(xù)30分鐘即可.

⑦蒸餾完畢，先將蒸餾出口離開液面，繼續(xù)蒸餾1min，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶內(nèi)，再將吸收瓶移開，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。

⑧硼酸吸收液的溫度不應(yīng)超過40°C，否則氨吸收減弱，造成損失，可置于冷水浴中。

⑨混合指示劑在堿性溶液中呈蘭綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。雙縮脲法傳統(tǒng)的凱氏定氮法應(yīng)用范圍廣，靈敏度高、準(zhǔn)確，不要大儀器，但費(fèi)時(shí)間，有環(huán)境污染。新開發(fā)的：雙縮脲法、紫外分光光度法、水楊酸比色法等。1. 原理脲（尿素）NH2—CO—NH2

加熱至150~160℃時(shí)，兩分子縮和成雙縮脲。雙縮脲能和硫酸銅的堿性溶液生成紫色絡(luò)和物，這種反應(yīng)叫雙縮脲反應(yīng)。（縮二脲反應(yīng)）蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵—CO—NH—與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似。在同樣條件下也有呈色反應(yīng)，在一定條件下，其顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比，可用分光光度計(jì)來測其吸光度，確定含量。（560nm）NH2—CO—NH—CO—NH2+NH3NH2—CO—NH2

+

NH2—CO—NH2

注：測蛋白質(zhì)時(shí)叫雙縮脲法，并不另加雙縮脲。樣品不用消化

2. 方法特點(diǎn)及應(yīng)用范圍本法靈敏度較低，但操作簡單快速，故在生物化學(xué)領(lǐng)域中測定蛋白質(zhì)含量時(shí)常用此法。本法亦適用于豆類、油料、米谷等作物種子及肉類等樣品測定。

3.主要儀器：分光光度計(jì)，離心機(jī)（4000r/min）

氨基酸的一般定量測定

（一）甲醛滴定法

1.原理：氨基酸本身有堿性—NH2基，又有酸性—COOH基，成中性內(nèi)鹽，加入甲醛溶液后，與—NH2結(jié)合，堿性消失，再用強(qiáng)堿來滴定—COOH基。2．特點(diǎn)：適用于發(fā)酵工業(yè)，如發(fā)酵液中含氮量，其發(fā)酵過程中氮量減少情況等。（適于食品中游離氨基酸的測定）氨基酸的結(jié)構(gòu)通式?jīng)Q定物化性質(zhì)組成蛋白質(zhì)的氨基酸除了甘氨酸外都是L-型的α-氨基酸。+OH-+H++OH-+H+pH<pIpH=pI凈電荷為０pH>pI凈電荷為負(fù)凈電荷為正3．雙指示劑：①36%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示劑，用氫氧化鈉將40%甲醛中和至藍(lán)色。②0.1%百里酚酞乙醇溶液，③0.1%中性紅50%乙醇溶液，④0.1mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。4．操作：同時(shí)取兩份樣：①+中性紅指示劑，用氫氧化鈉直接滴，中和樣液中其它酸性物質(zhì)。②+百里酚酞+中性甲醛+NaOH

滴，中和了樣液中氨基酸的羧基與其它酸性物質(zhì)的總和。二者之差可