結核病疫苗的新進展

全國結核病學術會議

結核病疫苗的新進展5/9/20241結核病疫苗的新進展國際公共衛(wèi)生問題

20世紀的中期，許多從事衛(wèi)生事業(yè)的專業(yè)人員曾經很樂觀地認為傳染病將在不久的將來被徹底消滅。如今，艾滋病的流行、肺結核、瘧疾、以及各種具有抵抗抗生素的傳染病每年使上百萬的人死亡。在很大程度上，不僅因為缺乏科學知識使這些流行病得以傳播，而且承受傳染病壓力最大的貧窮國家沒有對付這些疾病的工具。5/9/20242結核病疫苗的新進展5/9/20243結核病疫苗的新進展結核病問題的嚴重性全世界約1/3的人口（近20億）攜帶結核菌。每年有2000萬人患活動性結核病。每年約有300萬人死于結核病。結核病每15秒鐘就殺死1人。預計未來20年還將有3600萬人死于結核病。5/9/20244結核病疫苗的新進展結核病卷土重來的主要原因BCG免疫效果的降低耐多藥結核分枝桿菌(multi-drugresistantTB,MDRTB)的播散HIV與TB的雙重感染人口大規(guī)模的流動5/9/20245結核病疫苗的新進展中國結核病狀況

中國是WHO確定的MDRTB的高發(fā)病率的熱點地區(qū)。結核病人數居全世界第二位，是世界第二大結核病重災區(qū)。中國是全球22個結核病高負擔國家之一。全國結核桿菌感染人數5億?，F有結核病人600萬，每年新發(fā)病例113萬，每年死亡人數25萬。5/9/20246結核病疫苗的新進展國家衛(wèi)生部近期報告發(fā)病數居前五位的病種為：乙型肝炎、肺結核、淋病、痢疾、未分型病毒性肝炎。死亡數居前五位的病種為：狂犬病、肺結核、乙型肝炎、流腦、新生兒破傷風。5/9/20247結核病疫苗的新進展怎么辦？在世界面臨的嚴重的結核病防治問題上，我們應當做什么？1、研究結核桿菌致病機制2、發(fā)現抗結核病新藥3、研制抗結核病疫苗5/9/20248結核病疫苗的新進展CD4+Th1或Th2T淋巴細胞與抗結核免疫反應的關系5/9/20249結核病疫苗的新進展CD4＋、CD8＋T細胞在清除胞內感染結核桿菌中的不同途徑與效果引自SilvaCL,FEMSMicrobiologyLetters,2001;197:11CD4+CD8+5/9/202410結核病疫苗的新進展結核病疫苗的新進展

(一)減毒疫苗(二)重組疫苗(三)亞單位疫苗(四)DNA疫苗(五)治療性疫苗5/9/202411結核病疫苗的新進展OrmeIM.2001美國NIH結核疫苗研究項目概況5/9/202412結核病疫苗的新進展

1.牛型分枝桿菌減毒活疫苗BCG。2.田鼠分枝桿菌減毒活疫苗。自然突變株，保護力和BCG相當。已應用于臨床實驗。3.通過基因敲除/突變人型結核桿菌毒力基因，構建結核桿菌減毒活疫苗。

（一）減毒活疫苗5/9/202413結核病疫苗的新進展1.減毒活疫苗BCG

近80年歷史的減毒活疫苗BCG是目前僅有的預防結核病的疫苗。BCG來源于傳代230代的牛分枝桿菌，一直被廣泛用作預防結核病的疫苗，但多年的應用發(fā)現BCG的兩大特性:1、極不穩(wěn)定，地域性極強，保護效果從高達80%至某些地域的0%，有時甚至帶來有害效果;2、BCG通?？捎行ПＷo新生兒及兒童免患初期疾病如結核性腦膜炎，而對青少年及成人幾乎不能提供阻止后期感染性肺結核發(fā)生的保護力。BCG似為一雙刃劍，有時保護，而有時毫無用處甚至有害。因此，BCG的免疫病理和毒力問題仍待謹慎的研究和探討。5/9/202414結核病疫苗的新進展卡介苗免疫保護效果5/9/202415結核病疫苗的新進展

BCG保護作用差異大的原因BCG丟失了一些結核桿菌特異性抗原；環(huán)境分枝桿菌的作用，使BCG在體內受到抑制，不能引起有效的免疫保護作用；BCG株、劑量和接種方案存在差異；人群基因差異；結核桿菌基因差異。5/9/202416結核病疫苗的新進展BCG所缺失的結核桿菌特異性基因組區(qū)域引自MustafaAS.MolecularImmunology,2002;39:1135/9/202417結核病疫苗的新進展環(huán)境分枝桿菌感染使BCG失去免疫保護作用引自AggerEM.Vaccine,2002;21:75/9/202418結核病疫苗的新進展(二)重組疫苗優(yōu)良的佐劑和安全的載體表達多個抗原表位誘導持續(xù)的免疫記憶和高水平的細胞免疫綜合各疫苗優(yōu)勢5/9/202419結核病疫苗的新進展2.1重組BCG疫苗安全的載體：以BCG為表達載體。人型結核桿菌保護性抗原：Ag85B和ESAT-6，MPT64等。增強細胞免疫反應的細胞因子：IFN-r,IL-2,IL-12,G-CSF等。5/9/202420結核病疫苗的新進展構建重組BCG疫苗示意圖5/9/202421結核病疫苗的新進展Ⅰ重組MtbRD1-2F9（含ESAT-6基因）BCG疫苗免疫保護力增強-體重變化重組BCG免疫保護力比較salineBCGBCG:RD1-2F95/9/202422結核病疫苗的新進展重組MtbRD1-2F9BCG疫苗免疫保護活性增強—細菌清除率改變salineBCGBCG:RD1-2F9salineBCGBCG:RD1-2F95/9/202423結核病疫苗的新進展重組MtbRD1-2F9BCG疫苗免疫保護活性增強—脾臟組織觀察引自PymAS.NatureMedicine,2003;9:5335/9/202424結核病疫苗的新進展Ⅱ重組MtbAg85BBCG疫苗(rBCG30)免疫活性增強—DTH反應增強引自HorwitzMA.PNAS,2000;97(25):138535/9/202425結核病疫苗的新進展rBCG30免疫保護性增強—體重變化5/9/202426結核病疫苗的新進展rBCG30免疫保護性增強—肺臟和肝臟組織學觀察5/9/202427結核病疫苗的新進展2.2重組痘苗病毒疫苗痘苗病毒疫苗也是一安全的載體。將結核桿菌抗原Ag85和組織纖維蛋白溶酶原激活因子（tPA)信號肽基因拼接后，導入痘苗病毒載體，形成重組痘苗疫苗，可以高效表達Ag85。用該疫苗免疫小鼠，可以刺激針對結核菌的保護性免疫反應（IL-2、IFN-γ升高）。5/9/202428結核病疫苗的新進展表達MtbAg85復合體的痘苗病毒免疫反應引自MalinAS.MicrobesandInfection.2000;2:16775/9/202429結核病疫苗的新進展表達MtbAg85復合體的痘苗病毒免疫反應5/9/202430結核病疫苗的新進展2.3重組沙門氏菌疫苗

以鼠傷寒桿菌（Salmonellatyphimurium)為載體，導入融合的結核桿菌Ag85B基因和HlyB基因（轉運Ag85B蛋白出胞外），可得到能夠分泌表達Ag85B融合蛋白的重組活疫苗?？诜撘呙缑庖咝∈?，明顯增高了IFN-γ和TNF-α的生成，并且在一定時期內具有和BCG相當的免疫保護能力。5/9/202431結核病疫苗的新進展重組MtbAg85B鼠傷寒桿菌疫苗免疫反應性觀察—細胞因子變化引自FEMSImmunologyandMedicalMicrobiology2000,27:283-2685/9/202432結核病疫苗的新進展重組MtbAg85B鼠傷寒桿菌疫苗免疫效應觀察—保護力比較5/9/202433結核病疫苗的新進展2.4重組BCG多價疫苗5/9/202434結核病疫苗的新進展國內在重組BCG方面的研究1、復旦大學王洪海：IFN-γ+Ag85B+ESAT-62、第四軍醫(yī)大學徐志凱：IL-2+Ag85B+ESAT-63、四川大學華西醫(yī)學院鮑朗：ESAT-6Infect.Immun.2003,71(4):16564、華中理工大學同濟醫(yī)學院皇甫永穆：HSP65JHuazhongUnivSciTechnologMedSci.2004;24(2)

5/9/202435結核病疫苗的新進展表達載體的構建

HYGHYGpOLYGrIFNAg85boriMoriMMCSMCS連接酶切BCGPPPESAT5/9/202436結核病疫苗的新進展

融合基因在E.coli中的表達(1)攜帶人IFN-γ--Ag85B融合基因在原核細胞中的表達(2)攜帶人IFN-γ--ESAT-6融合基因在原核細胞中的表達(3)攜帶人IFN-γ--Ag85B--ESAT-6融合基因的原核表達5/9/202437結核病疫苗的新進展（三）亞單位疫苗結核桿菌培養(yǎng)基濾過蛋白（CFP）一定程度上具有保護小鼠感染結核的能力，這促使人們開始研究有效的亞單位疫苗。人們在早期培養(yǎng)濾液中發(fā)現具有明顯免疫原性的蛋白質：Ag85復合體和ESAT-6。二者分別具有免疫保護作用，當二者融合表達則時保護力更強，可達到和BCG相當的水平?？寺》置诘鞍譓tb8.4,并通過與T細胞相互作用分析發(fā)現它可被T細胞識別，免疫動物證明它具有很強的免疫活性。5/9/202438結核病疫苗的新進展30kD分泌蛋白(Ag85)的免疫原性——T細胞增殖反應引自SinhaRK.Vaccine,1997;15:6895/9/202439結核病疫苗的新進展亞單位疫苗的特點環(huán)境分枝桿菌存在使BCG的預防保護作用大為降低，此時亞單位疫苗具有較好的免疫保護力。免疫佐劑和細胞因子對疫苗的效應影響很大。T細胞表位對于亞單位疫苗非常關鍵。疫苗通過特異性表位和特異性的T細胞作用，分別激活Th1和CTL?？梢宰鳛橹委熜砸呙?。5/9/202440結核病疫苗的新進展5/9/202441結核病疫苗的新進展引自MustafaAS.MolecularImmunology,2002;39:113T細胞表位5/9/202442結核病疫苗的新進展利用后基因組學尋找亞單位疫苗5/9/202443結核病疫苗的新進展

（四）DNA疫苗

基因免疫(Geneticimmunization)，又稱遺傳免疫，或者叫做DNA疫苗(DNAVaccine)，是九十年代發(fā)展起來的一種嶄新的免疫接種技術。是繼巴斯德開創(chuàng)的減毒疫苗，基因工程疫苗之后的第三代疫苗?；蛎庖叩闹饕硎菍⒖乖幋a基因插入帶有強啟動子的質粒載體，然后用物理方法將此重組質粒導入體內細胞，抗原編碼基因即在細胞內表達合成抗原蛋白，誘發(fā)機體產生保護性免疫反應。5/9/202444結核病疫苗的新進展1.DNA疫苗作用機制示意圖5/9/202445結核病疫苗的新進展

2.DNA疫苗操作方法

DNA疫苗的組成：一般由病原體抗原編碼基因和作為真核表達載體的質粒構成。編碼基因：①完整的一組基因；②單個基因的cDNA；③抗原決定簇的一段基因?？傊磉_產物為病原體有效抗原成分。5/9/202446結核病疫苗的新進展3．影響基因轉染和表達的因素

(1)年齡對DNA表達的影響（2）性別對DNA表達的影響（3）DNA劑量及保存液對表達的影響（4）表達載體的選擇（5）不同組織細胞對DNA表達的影響（6）接種途徑5/9/202447結核病疫苗的新進展4.DNA疫苗的優(yōu)點

（1）直接轉入DNA，包括開放讀框，適當的真核轉錄和翻譯調控因子，可以體內合成蛋白質，其折疊和翻譯后修飾在大多數情況下和普通感染類似，模擬病毒感染的體內蛋白質合成進入MHC－I途徑，也可以由APC識別進入MHC－II途徑，這樣細胞免疫和體液免疫反應都調動起來，可誘發(fā)持久的免疫應答。（2）由于轉入DNA本身缺乏復制機制，不會與宿主染色體基因整合，所以不會象減毒疫苗出現毒力恢復的可能性。5/9/202448結核病疫苗的新進展DNA疫苗的優(yōu)點（3）構建DNA疫苗載體相對容易，而成熟的質粒DNA純化技術能夠加快和簡化發(fā)展新疫苗的進展，并可提供廣譜的疫苗。（4）DNA疫苗的制備成本低于基因工程重組疫苗，可以免去生產和純化蛋白質的大量費用，制備起來省時省力。5/9/202449結核病疫苗的新進展5.DNA疫苗的新進展

Krieg發(fā)現細菌DNA能夠誘導非特異性的免疫反應，而脊椎動物的DNA卻不能。研究發(fā)現在這兩個基因組內主要是未甲基化胞嘧啶－磷酸－鳥嘌呤（unmethylatedcytosine-phosphate-guanine,CpG－免疫刺激序列）二核苷出現的頻率不同。

5/9/202450結核病疫苗的新進展5/9/202451結核病疫苗的新進展5/9/202452結核病疫苗的新進展Ag85復合體DNA疫苗的免疫反應性引自LozesE,Vaccine,1997;15:830(下同）5/9/202453結核病疫苗的新進展Ag85免疫保護性5/9/202454結核病疫苗的新進展5/9/202455結核病疫苗的新進展提高DNA疫苗效果的方法使用免疫佐劑細胞因子應用DNA疫苗聯合使用DNA疫苗和亞單位疫苗、BCG等結合使用5/9/202456結核病疫苗的新進展HSP65DNA疫苗/TDM(trehalosedimicolate)微球體增強免疫效果——Ⅰ抗體滴度變化引自LinaKM,Genetherapy,2003;10:678（下同）5/9/202457結核病疫苗的新進展肺細胞再次受Mtb攻擊時，IFN-γ分泌差異HSP65DNA疫苗/TDM微球體輔助增強免疫效果——Ⅱ細胞因子變化5/9/202458結核病疫苗的新進展細胞因子促進疫苗保護作用

—IL-12和IL-18對Ag85BDNA疫苗保護力的影響引自TriccasJA.ImmunologyandCellBiology,2002;80:3465/9/202459結核病疫苗的新進展細胞因子GM-CSF和IL-12,15,18對HSP65DNA疫苗的免疫增強作用引自BaekKM.Vaccine,2003;21:3684（下同）5/9/202460結核病疫苗的新進展細胞因子GM-CSF和IL-12增強HSP65的免疫保護作用5/9/202461結核病疫苗的新進展DNA疫苗聯合使用提高保護效果5/9/202462結核病疫苗的新進展DNA—亞單位疫苗聯合使用增強免疫效果HSP65DNA疫苗免疫動物（牛）后，再用重組HSP65蛋白來增強免疫效果引自VordermeierHM.VeterinaryMicrobiology,2003;93:3495/9/202463結核病疫苗的新進展DNA疫苗-BCG聯合使用策略預先用Ag85DNA疫苗免疫小鼠，可以增強BCG的保護效果引自BrittonWJ.ImmunologyandCellBiology,2003;81:345/9/202464結核病疫苗的新進展國內在DNA疫苗方面的研究1、北京309醫(yī)院吳雪瓊等：（１）MPT64DNA疫苗（軍醫(yī)進修學院學報,2001）（２）Ag85ADNA疫苗（中國免疫學雜志,2002）2、山東省醫(yī)科院田志剛等：Ag85BDNA疫苗（中國免疫學雜志,2001）3、重慶醫(yī)科大學朱道銀等：Ag85B-MPT64融合基因疫苗（中華結核和呼吸雜志，2003）4、第二軍醫(yī)大學孫樹漢等：ESAT-6DNA疫苗（Vaccine,2004）5、華西醫(yī)科大學鮑朗等：Ag85ADNA疫苗（免疫學雜志2003）5/9/202465結核病疫苗的新進展（五）結核病的治療性疫苗

結核病的問題在有了卡介苗(BCG)和特效抗生素以后曾被長期忽視，現在隨著AIDS的全球侵襲而卷土重來，再次成為疾病和死亡的首要原因之一。世界衛(wèi)生組織已宣布結核為"全球性急癥"，但其年感染率仍在攀升。缺乏一種適用于所有地區(qū)的高效預防性疫苗是結核失控的原因之一，而更關鍵的原因在于缺乏適用于大量已感染結核桿菌的結核患者的治療性疫苗及藥物，使患者由初期感染發(fā)展為可傳播的結核性疾病。5/9/202466結核病疫苗的新進展研究治療性疫苗的必要性

由于抗菌藥物濫用，產生嚴重危害，出現結核桿菌的耐藥性。目前，全球已有17億人感染了結核桿菌，約有2千萬結核病人?，F在每年新增加病例800萬，死于結核病的達300人，高居傳染病死亡人數之首。HIV/M.tb的雙重感染使得重大傳染病的防治雪上加霜。因此需要開發(fā)新的藥物和治療性疫苗。5/9/202467結核病疫苗的新進展結核治療性疫苗的試驗1、熱滅活分枝桿菌疫苗免疫或聯合激素藥物的治療性試驗2、多肽疫苗的治療性試驗3、基因疫苗的治療性研究4、其他形式的結核治療性疫苗5/9/202468結核病疫苗的新進展5.1熱滅活分枝桿菌＋激素藥物

肺結核在BALB/c小鼠模型中的建立促進了結核治療性疫苗的試驗研究。Hernandez-Pando等以結核桿菌H37Rv經氣管感染BALB/c小鼠，初期出現以分泌Th1細胞因子、TNF-a和IL-1為特征的抗感染癥狀，60天左右時則發(fā)展為TNF-a和IL-1消失、IL-4分泌增高的進行性肺炎癥狀，此時及90天時，給予熱滅活分枝桿菌疫苗2次免疫或聯合一激素藥物17-B-雄烯二醇(AED)注射，結果該疫苗可使小鼠重新表達Th1細胞因子TNF-a和IL-la，并使肺炎轉化為肉芽腫，達到與AED相似的效果，但二者無協(xié)同作用。

5/9/202469結核病疫苗的新進展5.2多肽疫苗的治療試驗利用多肽疫苗激活細胞免疫，尤其是CD8+CTL的活性，有助于結核桿菌的徹底清除。0lsen等在該BALB/c小鼠肺炎模型中測試了多肽疫苗的治療效果。將來自結核桿菌培養(yǎng)物早期分泌性蛋白質中的相對分子質量6x103(ESAT-6)的兩種多肽1-20和51-70以dimenthyl

dioctadecylam-moniumbromide/單磷酰脂A/IL-2混合物乳化后免疫經血管或氣霧劑致肺炎的小鼠，發(fā)現ESAT-6的51～70多肽疫苗可誘生細胞免疫應答，免疫保護小鼠，其效果近于ESAT-6蛋白輔以BCG的免疫效果。5/9/202470結核病疫苗的新進展5.3DNA疫苗的治療性研究

DNA疫苗是發(fā)展治療性結核疫苗的極具吸引力的一項新技術，許多研究已顯示DNA疫苗具強有力的保護作用。Morris等以結核菌MPT-63和MPT-83抗原構建的DNA疫苗，可提供小鼠對Erdman結核桿菌的免疫保護力;而多價ESAT-6、MPT-64、MPT-63和KatGDNA疫苗聯合免疫可誘生分別針對4種結核抗原的體液和細胞免疫應答，而且可達到BCG活疫苗的保護效果。5/9/202471結核病疫苗的新進展

DNA疫苗的治療效果

1999年的《自然》雜志載文介紹，感染了結核病的小鼠在接受結核DNA疫苗注射后，其體內原本軟弱無效的免疫反應會大大加強，并會通過有效刺激T細胞而獲得殺滅結核桿菌的能力。這項研究還發(fā)現，DNA疫苗可消滅某些具有抗藥性的結核桿菌。5/9/202472結核病疫苗的新進展HSP65DNA疫苗治療結核潛伏感染5/9/202473結核病疫苗的新進展引自LovvieDB.Nature,1999;400:269HSP65DNA疫苗治療結核潛伏感染5/9/202474結核病疫苗的新進展Ag85ADNA疫苗結合化學療法治療結核潛伏感染引自HaSJ.GeneTherapy,2003;10:15925/9/202475結核病疫苗的新進展Ag85ADNA疫苗結合化學療法治療結核潛伏感染—治療效果觀察M.tb.H37Rvc.f.u.(log10)5/9/202476結核病疫苗的新進展5.4其他形式的結核治療性疫苗

重組疫苗