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文檔簡介

項目15-1蛋黃中免疫球蛋白的提取

給雞注射液疫苗，能大大提高雞蛋中1g的活性，并有抑制4種腸道菌的作用。

雞的免疫：腸素Ecoli(ETEC)菌株H1047在37℃培養(yǎng)18h后，加入0.4%的甲醛溶液48h后滅活，離心，沉淀，用PBS洗滌，重復(fù)三四次后，把收集的菌體凍干并儲存于同樣的緩沖液中。上述的抗原懸浮液（2×109個菌體/mL）與等體積的不完全Freund’s試劑相混勻，即為注射試劑，用8只25周齡的蛋雞，在每只雞的翼處4個不同處注射。每隔2周注射1次，共3次，每日收集雞蛋備用。項目15-1蛋黃中免疫球蛋白的提取

1．Ig分離

取1體積的蛋黃加4體積的蒸餾水混合均勻后于4℃靜止8h，然后在12000r/min下冷凍離心15min，取上清液，加入19%的Na2SO4，緩慢攪拌1h后，在同樣條件下離心、沉淀，用PBS懸浸（1mg/mL），在4℃下對PBS透析8h。然后上DEAE-纖維素柱，分離得到免疫球蛋白。項目15-1蛋黃中免疫球蛋白的提取

2．活性檢測方法

用Ecoli細(xì)胞懸浮液（108個/mL）包被酶聯(lián)反應(yīng)板，4℃下吸附過夜。然后用0.1%的PBS-TN洗滌，加入稀釋好的IgG樣品。37℃下溫育3h，洗滌后每孔加入堿性磷酸脂酶（sigma）。37℃下溫育2h，再洗滌后每孔加入100μL底物，37℃下溫育0.5h。觀察顏色變化，加入2mol/L的NaOH終止反應(yīng)，在405nm下用酶聯(lián)閱讀儀進(jìn)行測試。IgG的活性越高，儀器上反應(yīng)出來的OD值相應(yīng)也越高。項目15-1蛋黃中免疫球蛋白的提取

2．活性檢測方法

免疫球蛋白抑制試驗是將免疫球蛋白PHS稀釋至2mg/mL，然后和細(xì)菌懸浮液（106個Ecoli/mL）混合。用未加Ig的菌液做空白對照。在37℃培養(yǎng)，分別在1h、3h、7h、12h取樣，平板計數(shù)。結(jié)果表明，空白對照液在12h后，大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌4種菌液的生長濃度均達(dá)到109/mL，而加入Ig菌液12h后，四種菌液中添加免疫球蛋白對四種腸道致病菌的生長起到明顯的抑制作用。項目15-1蛋黃中免疫球蛋白的提取

2．活性檢測方法

經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測免疫過與未免疫過的雞蛋中的Ig活力，結(jié)果前者的OD值明顯高于后者。免疫過的雞蛋中的Ig濃度稀釋16～32倍以后，OD值和未免疫過的雞蛋中的Ig相同?？梢?，從免疫過的雞蛋中提取的Ig活性有很大的提高。體外模擬實驗：在pH2.8，溫度3

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