細(xì)胞傳代培養(yǎng)-自助學(xué)習(xí)

細(xì)胞培

養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的觀察自主查閱（課后）（1）細(xì)胞的常規(guī)觀察主要包括哪些項(xiàng)目？（2）體外培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)方式如何？（3）體外培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程如何？（4）體外培養(yǎng)的細(xì)胞有何形態(tài)？（5）細(xì)胞培養(yǎng)的污染途徑有哪些？如何排除 ？細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)觀察項(xiàng)目細(xì)胞培養(yǎng)1.培養(yǎng)液顏色及清亮度：肉眼觀察培養(yǎng)液顏色的變化反映培養(yǎng)液pH值的變化培養(yǎng)液的清亮度反映培養(yǎng)液是否被微生物污染2.細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)：倒置顯微鏡觀察3.

細(xì)胞形態(tài)：倒置顯微鏡或相差顯微鏡觀察4.微生物污染：肉眼觀察或鏡檢1、培養(yǎng)液的變化培養(yǎng)瓶刷洗不潔，殘留堿性物質(zhì)，致營(yíng)養(yǎng)液pH值升高，顏色變紫紅色細(xì)胞代謝旺盛，酸性物質(zhì)積累，致營(yíng)養(yǎng)液pH值下降，顏色變黃。新鮮RPMI－1640培養(yǎng)液呈橙紅色（pH7.2左右），適合細(xì)胞生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)貼附生長(zhǎng)：必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)(這種細(xì)胞稱為貼壁依賴性細(xì)胞)。大多數(shù)細(xì)胞是這種生長(zhǎng)方式。這類細(xì)胞存在接觸抑止和密度依賴性的生長(zhǎng)特性。2.培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)方式細(xì)胞培養(yǎng)懸浮生長(zhǎng)：于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng)，不需要貼附于支持物表面(這種細(xì)胞稱為非貼壁依賴性細(xì)胞)

。如某些癌細(xì)胞和血液白細(xì)胞。細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)時(shí)胞體為圓形。細(xì)胞培養(yǎng)兼具上述兩種生長(zhǎng)方式的細(xì)胞，稱為兼性貼壁細(xì)胞，如CHO細(xì)胞3.培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程（1）培養(yǎng)細(xì)胞的生命期所謂培養(yǎng)細(xì)胞的生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。大致可分為以下三個(gè)階段：原代培養(yǎng)期：也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入衰退期。衰退期：此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)（2）一代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程“一代”指的是從細(xì)胞接種到下一次再傳代接種的一段時(shí)間潛伏期：游離期：細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．此時(shí)胞體呈圓球形。一般

10分鐘一4小時(shí)。貼壁期：貼附底物,一般24小時(shí)內(nèi)貼壁。潛伏期：此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6～24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停滯期（平臺(tái)期）：細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性培養(yǎng)細(xì)胞貼壁過(guò)程停滯期跟生命期中的衰退期是一回事嗎？細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，主要可分為以下四種類型：成纖維細(xì)胞型：上皮細(xì)胞型：游走細(xì)胞型：多型細(xì)胞型：不常見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)4.培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)此細(xì)胞形態(tài)與體內(nèi)成纖維細(xì)胞的相似而得名，胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出２～３個(gè)長(zhǎng)短不齊的突起。成群細(xì)胞呈放射狀、旋渦狀等形式，除真正的成纖維細(xì)胞外，心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等細(xì)胞常呈此形態(tài)。成纖維細(xì)胞型細(xì)胞培養(yǎng)本型細(xì)胞呈扁平、不規(guī)則多角形，中有圓形核。細(xì)胞彼此緊密相連，因?yàn)橄嗷頂D而呈現(xiàn)“鋪路石”狀，皮膚表層、消化層上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆呈上皮型形態(tài)。上皮細(xì)胞型細(xì)胞培養(yǎng)5.培養(yǎng)細(xì)胞的微生物污染細(xì)胞培養(yǎng)（1）污染途徑：操作室環(huán)境不佳清洗消毒不徹底無(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)培養(yǎng)液配制不過(guò)關(guān)血清污染組織或細(xì)胞污染微生物污染細(xì)菌污染真菌污染支原體污染病毒污染化學(xué)污染（2）污染的檢測(cè)及排除：細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)菌污染檢測(cè)肉眼直接觀察法：培養(yǎng)液渾濁或細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。培養(yǎng)檢查法：用肉湯培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基37度培養(yǎng)待檢樣品數(shù)日，觀察肉湯培養(yǎng)基有無(wú)渾濁，或瓊脂培養(yǎng)基有無(wú)菌落形成。顯微鏡觀察法：鏡下可見(jiàn)大量菌體細(xì)胞培養(yǎng)a.微生物污染的檢測(cè)常見(jiàn)細(xì)菌形態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)白色念珠球菌污染細(xì)胞培養(yǎng)真菌污染的檢測(cè)肉眼直接觀察法：大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面顯微鏡觀察法：鏡下可見(jiàn)絲狀、管狀或樹枝狀菌絲，縱橫交錯(cuò)。念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵圓形。細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)真菌形態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)真菌污染的成纖維細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)支原體污染的檢測(cè)特點(diǎn)：大小介于0.2-2

μm，約1%可通過(guò)濾菌器。青霉素?zé)o效。最常見(jiàn)，主要來(lái)源為操作者和血清。不易察覺(jué)，給人“正?！钡母杏X(jué)：被支原體污染后培養(yǎng)液不渾濁，細(xì)胞無(wú)明顯變化。嚴(yán)重時(shí)，細(xì)胞增殖緩慢、脫落。對(duì)熱較敏感。細(xì)胞培養(yǎng)支原體污染電鏡照片細(xì)胞培養(yǎng)支原體污染的檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)相差顯微鏡觀察法：直接培養(yǎng)支原體于培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3－5星期，觀察其生長(zhǎng)及菌落生成。DNA熒光染色法：利用熒光染劑（bisbenzimide,Hoechst 33258）檢測(cè)支原體污染。此染劑會(huì)結(jié)合到DNA的A-T 富集區(qū)域，因?yàn)橹гw之DNA中A-T含量占多數(shù)（55～80%），所以可將其染色而檢測(cè)。被支原體污染之細(xì)胞經(jīng)染色后，在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一之熒光小點(diǎn)，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。病毒污染的檢測(cè)細(xì)胞的直接觀察動(dòng)物接種檢查電子顯微鏡觀察細(xì)胞培養(yǎng)b.微生物污染的排除細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)菌污染的排除抗生素對(duì)預(yù)防和殺滅細(xì)菌有一定效果。預(yù)防應(yīng)用比污染后使用效果好。已發(fā)生細(xì)菌污染，再使用抗生素，常難根除。有價(jià)值的細(xì)胞被污染后，可試用5～10倍常用劑量，作用24～28小時(shí)，再換入常規(guī)培養(yǎng)液中，有時(shí)可奏效。支原體污染的排除細(xì)胞培養(yǎng)抗生素法：用100微克/毫升卡那霉素處理3周。高熱處理法：將受污染的細(xì)胞41度作用5～10小時(shí)，最長(zhǎng)18小時(shí)。聯(lián)合使用抗生素法效果更好。血清處理法：將污染細(xì)胞接種到含10％非滅活血清培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6小時(shí)。巨噬細(xì)胞吞噬法：將同種動(dòng)物腹腔巨噬細(xì)胞加入被支原體污染的細(xì)胞中（巨噬細(xì)胞：污染細(xì)胞＝10