實驗十六 DNA的連接與轉(zhuǎn)化

實驗十六DNA的連接與轉(zhuǎn)化1、ＤＮＡ分子的體外連接

ＤＮＡ分子的體外連接就是在一定條件下，由ＤＮＡ連接酶催化兩個雙鏈ＤＮＡ片段組鄰的５’端磷酸與３’端羥基之間形成磷酸酸脂鍵的生物化學過程，ＤＮＡ分子的連接是在酶切反應獲得同種酶互補序列基礎上進行的。連接反應中值得注意的幾個問題：1.ＤＮＡ連接酶常用的ＤＮＡ連接酶有兩種：

(1)來自大腸桿菌的ＤＮＡ連接酶(2)來自噬菌體的Ｔ４ＤＮＡ連接酶。二者的作用機理類似。Ｔ４ＤＮＡ連接酶作用機制Ｔ４連接酶作用分三步：１．Ｔ４ＤＮＡ連接酶與輔助因子ＡＴＰ形成酶－ＡＭＰ復合物。２．酶－ＡＭＰ復合物結(jié)合到具有５’－磷酸基和３’－羥基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ腺苷化。３．產(chǎn)生一個新的磷酸二酯鍵，把缺口封起來.2.連接反應的溫度ＤＮＡ連接酶的最適反應溫度為３７℃，但在此溫度下，粘性末端的氫鍵結(jié)合很不穩(wěn)定，折衷方法是１２℃過夜。3.DNA的平未端和粘性末端由于內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA末端有平未端和粘性末端，因而連接反應中就有平未端連接和粘性末端連接。二者連接效率不同。粘性末端效率高，因而在底物濃度，酶濃度選擇上是有差異的，4.堿性磷酸酶處理質(zhì)粒載體為了提高連接效率，一般采取提高ＤＮＡ的濃度，增加重組子比例。這樣就會出現(xiàn)ＤＮＡ自生連接問題，為此通常選擇對質(zhì)粒載體用堿性磷酸酶處理，除去其５’末端的磷酸基，防止環(huán)化，通過接反應后形成的缺口可在轉(zhuǎn)化細胞后得以修復。見下圖。5.連接反應的檢測連接反應成功與否，最后的檢測要通過下一步實驗，轉(zhuǎn)化宿主菌，陽性克隆的篩選來確定。我們下面的實驗從粘性末端為例操作。二、實驗試劑１．純化后的酶切質(zhì)粒載體和目的基因。２．１０×Ｔ４ＤＮＡ連接酶buffer200mMTris-HCl(pH7.6)50mMMgCl250mM二硫芐糖醇500μl/mlBSA３．Ｔ４ＤＮＡ連接酶４．5mMATP三．實驗方法

ＤＮＡ分子的體外連接１．在無菌Eppendorf管中加入以下溶液：a.0.1μg質(zhì)粒載體，２倍分子的外源ＤＮＡ。b.加無菌水至7.5μl，于４５℃加溫５分鐘使重新退火的粘端解鏈，將混合物冷卻到０℃。c.加入：１０×Ｔ４ＤＮＡ連接酶buffer1μlＴ４ＤＮＡ連接酶0.1Weiss5mMATP1μl２．蓋上管蓋，充分混勻，臺式離心扣上離心５秒。３．１２℃下過夜連接反應。４．反應結(jié)束后于－２０℃保存。四．結(jié)果與分析

電泳檢查連接結(jié)果１．如何判斷連接效果的成功性？問題與討論：１．簡述Ｔ４ＤＮＡ連接酶作用機理。２．簡述一個完整外源ＤＮＡ的克隆過程。３．連接反應中應注意些什么問題及如何提高連接效率。2．ＤＮＡ的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子的篩選

一．實驗目的及背景體外通過基因工程手段所構建的含目的基因的重組質(zhì)粒，選用轉(zhuǎn)化和篩選技術，可獲得含重組的陽性克隆。在此陽性克隆中，ＤＮＡ可在生物體系中大量擴增，繁殖，保存以及表達目的基因的產(chǎn)物，這是ＰＣＲ體外擴增ＤＮＡ所不能替代的。配合ＤＮＡ重組技術，所獲得的，不同目的需要的陽性菌株已廣泛應用于科研，醫(yī)藥生產(chǎn)和生物發(fā)酵等領域。本實驗由二個方面組成:1.質(zhì)粒ＤＮＡ轉(zhuǎn)化大腸桿菌。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化不同細菌有不同的轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化效率的高低與實驗的成敗直接相關，通常轉(zhuǎn)化效率可達１０５－１０７轉(zhuǎn)化子/μgDNA。獲得高轉(zhuǎn)化效率的關鍵是感受態(tài)體菌的制備。所謂感受態(tài)，就是細菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。關于感受態(tài)的本質(zhì)與存在，說法很多，目前主要有兩種假說：１．局部原生質(zhì)體化假說－－感受態(tài)細胞的表面形成一種能接受ＤＮＡ的酶位點，使ＤＮＡ分子能進入細胞。制備感受態(tài)細胞現(xiàn)在制備感受態(tài)細胞通常用CaCl2處理，在低溫中與外來ＤＮＡ分子相混合.ＤＮＡ分子轉(zhuǎn)化分以下幾步:１．吸附－－雙鏈ＤＮＡ分子吸附于受體菌表面；２．轉(zhuǎn)入－－雙鏈ＤＮＡ分子解鏈。一條鏈進入受體菌，另一條降解；３．自穩(wěn)－－外源質(zhì)粒ＤＮＡ分子在細胞內(nèi)復制成雙鏈；４．表達一供體基因隨同復制子同時復制，分裂，轉(zhuǎn)錄翻譯。2.重組子的篩選這和受體菌：質(zhì)粒ＤＮＡ的選擇相關，原則上要注意：１．受體菌必須是限制與修飾系統(tǒng)缺陷的菌株；２．根據(jù)質(zhì)?；蛐秃褪荏w菌基因型互補原則而定。重組子的篩選方法常用的有兩種方法：１．抗生素篩選法菌株為某種抗生缺陷型，而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素，卡拉霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。本實驗利用抗生篩選轉(zhuǎn)化子。２互補法現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含有一個大腸桿菌ＤＮＡ的短區(qū)段，其中含有β－半乳糖苷酸基因（lacZ）的調(diào)控序列和頭１４６個氨基酸偏碼區(qū)。這個偏碼區(qū)中插入一個多克隆位點。受體菌則含編碼β－半乳糖苷酶Ｃ端ａａ的序列。當外源基因插入時，二者溶為一體后，有β－半乳糖苷酶表達，在生色底物５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷（x-gal）培養(yǎng)基中形成蘭色菌落。而當有外源基因插入到多克隆原點，從而造成插入失活，而使lacZ基因不表達而形成白色菌斑。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。二、實驗試劑

ＬＢ培養(yǎng)基質(zhì)粒ＤＮＡ（含Amp抗生基因），受體菌CaCl20.1MAmp三．實驗方法一、感受態(tài)細胞制備１．將宿主菌在瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，３７℃培養(yǎng)１６～２０小時。２．挑取單菌落轉(zhuǎn)入２０ｍｌＬＢ培養(yǎng)基錐瓶中，３７℃振蕩過夜。３．從中?。玻恚炀恨D(zhuǎn)入５０ｍｌＬＢ培養(yǎng)基中３７℃振蕩培養(yǎng)４－５小時，測ＯＤ１００達０．４～０．５。４．培養(yǎng)物于冰上１０分鐘。５．轉(zhuǎn)入－５０ｍｌ離心管，于４０００ｒｐｍ下４℃離心１０分鐘。６．棄上清，倒置離心管１分鐘，流盡剩余殘液然后加入10ml用冰預冷的0.1mol/LCaCl2，置冰上１０分鐘。７．4,000rpm4℃離心１０分鐘，棄上清。８．加入2ml，0.1MCaCl2懸浮細胞，于４℃過夜。二、轉(zhuǎn)化

１．在1.5mlEppendorf管中加入２００μl感受態(tài)細胞和１０μl40ngDNA溶液，溫和混勻，于冰上３０分鐘。２．于４２℃水浴９０秒。３．冰浴２分鐘。４．加入８００μlＬＢ液體培養(yǎng)基３７℃４５分鐘