齲病病因及其免疫預防

六、齲病病因及其免疫預防根據(jù)WHO2004年報告齲病仍是人類最常見的疾病之一齲病嚴重威脅人群的口腔健康AgePrevalenceDMFTTreatedrate5歲組乳牙66.0%3.5dmft3%12歲組恒牙28.9%0.5DMFT

11%35～44歲88.1%4.5DMFT

8.3~21.1%65～74歲98.4%14.7DMFT

第三次全國口腔健康流行病學抽樣調(diào)查結果齲病的病因學——四聯(lián)因素理論齲病預防控制致齲微生物增強宿主抵抗力控制高糖飲食齲病發(fā)病理論非特異性菌斑學說特異性菌斑學說非特異性菌斑假說

——廣義齲病生態(tài)學假說齲病發(fā)生并非少數(shù)幾種致齲菌作用的結果，菌斑生物膜的影響是一個動態(tài)過程，最終導致齲病發(fā)生。I、動態(tài)穩(wěn)定階段產(chǎn)酸—脫礦—再礦化、自穩(wěn)機制平衡該過程以非變異鏈球菌群和放線菌為主導II、產(chǎn)酸階段糖類頻繁攝入，唾液量↓，無法中和酸菌斑pH下降并持續(xù)非變異鏈球菌群的產(chǎn)酸菌和耐酸適應性增強放線菌、血鏈、口腔鏈球菌、戈登鏈球菌、輕鏈等產(chǎn)酸性↑，自適應耐酸性↑菌群產(chǎn)酸潛力改變→齲病發(fā)生III、耐酸階段變異鏈球菌、乳桿菌在極端酸性條件上更具競爭力pH↓4.0后，部分非變異鏈球菌和放線菌失去生存能力代之以變鏈菌、乳桿菌、雙岐桿菌特異性菌斑學說口腔中各菌種在不同部位的檢出水平S.sanguis和Mutans.S是在菌斑和齲病病損中最常檢出的菌種，兩者都能夠產(chǎn)酸，但只有Mutans.S能夠單獨在無菌動物模型上產(chǎn)生齲齒。乳桿菌——致齲始動作用不明顯，促進齲病進展放線菌——與根面齲發(fā)病有關S.mutans大鼠磨牙齲齒模型S.mutans作為主要致齲菌的流行病學證據(jù)S.mutans幾乎總是能從菌斑中被檢出。大多數(shù)齲損部位有>10％的S.mutans。大多未感染S.mutans的區(qū)域無齲病發(fā)生?？v向研究發(fā)現(xiàn)S.mutans促進齲病的進展。有研究顯示，如果兒童3歲前沒有感染S.mutans，則趨向于保持未感染狀態(tài)幾年時間，直到第二牙列萌出時新的定植機會出現(xiàn)。S.Sobrinus—另一重要致齲菌隨著檢測手段的改進，

S.sobrinus在菌斑和齲損部位的檢出率明顯提高；與S.mutans相比，S.sobrinus的產(chǎn)酸性和耐酸性更強，S.sobrinus感染與高度齲活性的關系更為密切；研究發(fā)現(xiàn)口腔中同時感染S.mutans和S.sobrinus的兒童，其齲活性顯著高于單一菌種感染者。S.Sobrinus的表面蛋白抗原SpaA和葡糖基轉移酶GTF與S.mutans的PAc和GTF之間具有較高的同源性，兩菌之間具有交叉反應性。S.mutansS.Sobrinus免疫電鏡顯示，抗S.Sobrinus的多克隆抗體也可以和S.mutans反應細菌粘附和聚集——致齲過程的初始致齲菌主要依靠蔗糖非依賴性和蔗糖依賴性機制粘附聚集在牙面，代謝糖類產(chǎn)生乳酸，造成牙齒脫礦，齲病開始。細菌的粘附聚集機制包括：蔗糖非依賴性粘附——表面蛋白抗原（PAc）蔗糖依賴性粘附——葡糖基轉移酶（GTF）葡聚糖結合蛋白（GBP）ToothPellicleS.mutansS.mutansS.mutansS.mutansS.mutans=GBP=Glucan=GTF=PAc致齲菌粘附和聚集模式圖致齲菌的重要毒力因子信號肽富含丙氨酸富含脯氨酸錨基唾液結合區(qū)段，粘附功能區(qū)（A區(qū)，SBR）

免疫活性區(qū)（P區(qū)）0500aa1000aa1500aaPAc

S.mutans:PAc,AgI/IIorP1；S.sobrinus:SpaAorPAg兩者之間存在明顯的序列同源性(66%)PAc結構特點：

位于氨基端1/3富含丙氨酸的重復序列——唾液結合區(qū)

位于中部富含脯氨酸的重復序列——免疫活性區(qū)針對完整的PAc蛋白或其唾液結合區(qū)的抗體能夠阻斷S.mutans的粘附對大鼠免疫S.sobrinus的SpaA蛋白能夠保護大鼠抵抗S.sobrinus感染(Redmanetal.,1995)0500aa1000aa1500aa催化區(qū)段（CAT區(qū)）葡聚糖結合區(qū)段（GLU區(qū)）信號肽GTF

S.mutans和S.sobrinus

都能合成幾種GTFs，其中GTF-I在兩種細菌之間具有56.7%的序列同源性GTF的結構特點：位于氨基端1/3——催化活性區(qū)：催化蔗糖水解為葡萄糖和果糖靠近羧基端的重復序列——葡聚糖結合區(qū)S.mutans至少分泌三種具有葡聚糖結合活性的蛋白:GbpA,GbpB,GbpCGpbB已經(jīng)被證明能夠在實驗性齲齒動物上誘導保護性的免疫反應(SmithandTaubman,1996,1997)

通過唾液腺區(qū)皮下注射GpbB(SmithandTaubman,1996)或者通過鼻腔粘膜免疫(Smithetal.,1997)都可以達到保護效果相對于PAc和GTFs，研究較少GBP機體粘膜免疫共同粘膜免疫系統(tǒng)（CMIS）抗原通過接觸腸、鼻腔、支氣管或泌尿生殖道等部位的粘膜相關淋巴組織，不僅可以在誘導部位產(chǎn)生免疫反應，而且能夠在遠離誘導部位的局部粘膜產(chǎn)生免疫反應。機體不同部位的粘膜構成一個相互聯(lián)系的免疫網(wǎng)絡，稱為共同粘膜免疫系統(tǒng)。DomePeyer's

Patch

(GALT)Antigens

MLNTDBloodMucosalHomingGastrointestinaltractUpperrespiratorytract?Genitourinarytract?LaminaPropriaMammarySalivaryLachrymalSweat?GlandssIgA+BcellsCD4+TcellsMALTTonsils

/

Adenoids(NALT)TCellZone(35-40%)BCellZone(45-50%)CD4+TCells-naiveCD4+TCells-activatedCD4+TCells-memoryCD8+CTLsgdTCellsSurfaceIgA+ActivatedResting5-8%~40%~60%MHC

Class

II+

APCsDendritic

and

B

Cells,

M?BloodMucosalEffectorSitesMucosalInductiveSitesAreMALTMCellLymphoepitheliumEpithelialCellsPlasmaCellJchainmIgAdIgAS-IgASCpIgATransportAgUptake唾液分泌性IgA(sIgA)是唾液中的主要免疫球蛋白，其功能包括：抑制微生物在粘膜上皮和牙齒表面的黏附中和毒素和酶類（如GTF）中和病毒抗原捕獲和抗原清除與非特異性防御機制相互作用（如黏液素、乳鐵蛋白、溶菌酶等）免疫防齲的理論基礎致齲菌明確：

S.mutans和S.sobrinus被認為是主要致齲菌抗原清楚：表面蛋白抗原PAc、SpaA

葡糖基轉移酶（GTFs）葡聚糖結合蛋白（Gbp）免疫系統(tǒng)的作用成分已知：唾液中的sIgA抗體對防齲起主要作用S.mutans和S.sobrinus在幼兒18-24個月的時候開始穩(wěn)定定植于口腔，這段時間稱為“感染窗口”。致齲菌一旦穩(wěn)定定植，則很難再徹底清除。因此最佳的免疫時段應該在致齲菌穩(wěn)定定植前，大約幼兒1歲左右。免疫時機盡管剛出生的嬰兒唾液中不含分泌性IgA，嬰兒1個月時成熟的IgA已經(jīng)是唾液中主要的免疫球蛋白了;6~9個月時，大多數(shù)嬰兒已具有了類似成人的IgA1和IgA2亞型分布（SmithandTaubman,1993）;提示嬰兒接近1歲的時候，粘膜免疫反應開始出現(xiàn)明顯的成熟.？粘膜免疫系統(tǒng)是否足夠成熟免疫途徑口腔免疫通過誘導腸相關淋巴組織產(chǎn)生粘膜IgA反應，可采用口服、灌胃等方法;缺點是胃酸和各種酶會對抗原產(chǎn)生破壞作用，并且誘導位點（腸）和效應位點（口腔）距離遠;通過口腔免疫可以改變變形鏈球菌的感染和齲病發(fā)生進程;動物模型（Smithetal.,1979);人體實驗（SmithandTaubman,1987).鼻腔免疫較新使用的免疫途徑，通過誘導鼻相關淋巴組織產(chǎn)生粘膜IgA反應優(yōu)點是鼻腔環(huán)境對抗原的降解作用小，因此需要的抗原劑量小；易于操作；誘導位點（鼻腔）和效應位點（口腔）距離近；同時誘導粘膜和系統(tǒng)免疫通過鼻腔免疫可以獲得明顯的防齲保護效果（Katsetal.,1993；Fanetal.,2002）扁桃體免疫通過刺激腭扁桃體誘導免疫反應兔扁桃體局部給予福爾馬林滅活的S.sobrinus細胞能夠誘導唾液免疫反應，明顯降低S.sobrinus的感染（Fukuizumietal.,1999）重復扁桃體免疫能夠誘導兔大小唾液腺中產(chǎn)生IgA抗體分泌細胞（Inoueetal.,1999）小唾液腺免疫唇、頰、軟腭小唾液腺，它們具有與淋巴組織緊密相連的分泌導管S.sobrinusGTF局部用于年輕成人的下唇粘膜表面，與安慰劑組相比，免疫組在隨后6周的時間里全唾液中的總鏈球菌比例明顯降低（SmithandTaubman,1990）直腸免疫一個遠端的粘膜免疫誘導位點，分布著高密度的淋巴濾泡初步研究表明這一途徑也能誘導針對GTF的唾液IgA反應.（Lametal.,2001）使用肛栓可作為幼兒使用鼻腔免疫的替代皮下和其它系統(tǒng)免疫最初使用S.mutans全細胞作為免疫原;為了避免產(chǎn)生心臟交叉反應性抗體，亞單位疫苗和多肽疫苗被用于系統(tǒng)免疫以控制齲齒;大鼠唾液腺周圍皮下注射GTF或合成肽誘導了高水平的血清和唾液IgA反應，抑制了致齲菌口腔定植和齲病發(fā)生（Taubmanetal.）。

免疫效果評價體內(nèi)研究：唾液中特異性的sIgA抗體水平（ELISA）是否干擾致齲菌在牙面的定植（細菌培養(yǎng)計數(shù)）齲齒動物模型的患齲水平（Keyes記分）體外研究：免疫血清/唾液引起致齲菌的凝集抑制致齲菌在羥磷灰石表面的黏附影響生物膜的形成和結構免疫防齲研究方向主動免疫防齲（防齲疫苗）亞單位疫苗合成肽疫苗細菌活載體疫苗DNA疫苗被動免疫防齲在牛奶或雞蛋黃中產(chǎn)生針對變形鏈球菌的抗體鼠單克隆抗體

牛奶多克隆抗體

雞蛋黃IgY抗體被動免疫

constructionofGTase-IoverexpressingstrainB29-33

intramuscularimmunization

specificcowmilkantibodies

mouthrinsing

colonizationlevelofS.mutanonteethsurface

EffectofspecificbovinemilkantibodiesagainstdentalcarieskilledS.mutans,S.sobrinuswholecells

eggyolkIgY

effectofspecificIgYoncariespreventioninanimalmodelsintramuscularimmunizationEffectofspecificIgYonpreventionofdentalcaries（江千舟，樊明文等，2001）主動免疫亞單位疫苗以生物化學和物理方法提取純化PAc、GTFs等特異性抗原，或利用基因重組技術將PAc、GTFs等抗原的基因片段克隆到原核高效表達載體中，使之大量表達，再將其提取純化制成的疫苗。代表性研究Childers等提取了GTF蛋白用于臨床研究（2002,2003,2006）Michalek等制備了融合PAcSBR區(qū)和GTFGLU區(qū)的重組蛋白（2002）合成肽疫苗合成肽疫苗是根據(jù)致齲菌毒力因子的重要免疫原性和功能區(qū)的氨基酸序列，人工合成的十到數(shù)十個氨基酸殘基的短肽疫苗。Taubman，Smith等合成了對應GTF的CAT區(qū)和GLU區(qū)的多肽（2005，2007）代表性研究將PAc和GTFs等抗原的基因克隆到原核表達質(zhì)粒中，然后將質(zhì)粒克隆到載體菌中，由載體菌在體內(nèi)攜帶和表達。常用的載體菌有減毒沙門氏菌和乳鏈球菌。細菌活載體疫苗代表性研究Redman等構建了表達S.sobrinus表面蛋白SpaA的重組沙門氏菌（1994）凌均棨等研究了基因重組乳鏈球菌防齲疫苗（1999）

DNA疫苗將攜帶抗原基因的真核表達載體直接導入宿主細胞內(nèi)，誘導宿主免疫系統(tǒng)對抗原基因所表達的蛋白發(fā)生免疫反應。代表性研究樊明文等分別以pCI和pVAX1為載體研制了針對PAc和GTF的防齲DNA疫苗（口腔醫(yī)學縱橫,2000；JDentRes,2002；Vaccine,2006）劉天佳等以pcDNA3.1為載體，研制了分別針對PAc和GTF的防齲DNA疫苗（華西口腔醫(yī)學雜志,2001）Han等構建了編碼變鏈菌壁相關蛋白WapA的DNA疫苗（DNACellBiol,2005）防齲DNA疫苗防齲DNA疫苗pCIA-P融合防齲DNA疫苗pGLUA-P靶向融合防齲DNA疫苗pGJA-P人用靶向融合防齲DNA疫苗pGJA-P/VAX復合防齲DNA疫苗pGJGAC/VAXcy3-SABC法，抗PAc抗體cy3-SABC法，抗GTF抗體陰性對照防齲質(zhì)粒DNA在體外真核細胞中表達抗原蛋白在大鼠股四頭肌中的表達陰性對照防齲質(zhì)粒DNA在肌肉組織中表達抗原蛋白在大鼠頜下腺導管中的表達陰性對照防齲質(zhì)粒DNA在頜下腺組織中表達抗原蛋白動物實驗研究BALB/c小鼠疫苗防齲保護實驗（大鼠齲病模型）日本大耳白兔金黃毛地鼠通過粘膜途徑免疫，靶向防齲DNA疫苗能夠在小鼠、大鼠、金黃毛地鼠、兔等多種動物體內(nèi)誘導特異性的唾液IgA和血清IgG抗體齲齒模型研究顯示靶向防齲DNA疫苗能夠顯著降低實驗動物的齲齒水平

肌肉注射免疫鼻腔粘膜免疫

EDSDMEDSDM

49%43%52%57%63%70%靶向防齲DNA疫苗免疫金黃毛地鼠后的齲齒降低率正常大鼠磨牙縱切面齲壞防齲質(zhì)粒DNA免疫定菌鼠磨牙縱切面患齲情況未免疫大鼠磨牙縱切面患齲情況靶向疫苗pGJA-P/VAX免疫獼猴實驗研究采集鼻腔分泌物樣本采集唾液樣本采集血液樣本A組（2只，1＃和2＃）經(jīng)三角肌注射pGJA-P/VAXB組（2只，3＃和4＃）經(jīng)鼻滴注pGJA-P/VAX/bupivacaine復合物C組（1只，5＃）經(jīng)三角肌注射pVAX1D組（1只，6＃）經(jīng)鼻滴注pVAX1/bupivacaine復合物唾液抗PAc特異性SIgA抗體中，2、3和4號猴免疫后2月和3月時較免疫前顯著升高，并以2、4號猴水平最高。1號和對照猴（5和6號）沒有顯著變化。唾液抗GTF特異性SIgA抗體中，2、3和4號猴免疫后2月和3月時較免疫前顯著升高，并以2、4號猴水平最高。1號和對照猴（5和6號）沒有顯著變化鼻腔分泌物抗PAc特異性SIgA抗體中，2、3和4號猴免疫后2月和3月時較免疫前顯著升高，并以2、4號猴水平最高；1號和對照猴（5和6號）沒有顯著變化。鼻腔分泌物抗GTF特異性SIgA抗體中，2、3和4號猴免疫后2月和3月時較免疫前顯著升高，并以2、4號猴水平最高；1號和對照猴（5和6號）沒有顯著變化。

□1號猴，○

2號猴，

3號猴，△

4號猴，●

5號猴，

■6號猴

1號和2號猴免疫后一個月時血清抗PAcIgG抗體水平就比免疫前高16倍；3號猴免疫后3個月時血清抗PAcIgG抗體水平也達到比免疫前高16倍；4號猴免疫后3個月時血清抗PAcIgG抗體水平達到比免疫前高8倍；5號和6號免疫前后血清抗PAcIgG抗體水平無顯著變化。

1號和2號猴免疫后一個月時血清抗GTFIgG抗體水平就比免疫前高16倍，2個月時達32倍；3號猴免疫后2個月時血清抗PAcIgG抗體水平也達到比免疫前高8倍；4號猴免疫后1個月時血清抗PAcIgG抗體水平達到比免疫前高16倍，3個月時達32倍；5號和6號免疫前后血清抗PAcIgG抗體水平無顯著變化。

防齲DNA疫苗現(xiàn)狀研制融合疫苗從實驗室研究到中試生產(chǎn)

DNA疫苗的免疫機制

與武漢生物制品研究所合作正在進行防齲DNA疫苗的中試研究，小規(guī)模中試產(chǎn)品質(zhì)量已達到《預防用DNA疫苗臨床前研究技術指導原則》的要求。1.發(fā)酵工藝用14升罐發(fā)酵，獲得濕菌67克用50升發(fā)酵罐發(fā)酵，獲得濕菌450克2.質(zhì)粒純化工藝研究（1）質(zhì)粒的粗提:堿裂解法

防齲DNA疫苗的中試生產(chǎn)（2）Ⅰ號柱層析：去除RNA、細菌蛋白、宿主菌基因組DNA

（3）Ⅱ號柱層析：捕獲超螺旋質(zhì)粒0D260/OD280大于1.75

細菌殘余蛋白含量小于0.001ug/ug質(zhì)粒瓊脂糖電泳后RNA肉眼不可見超螺旋質(zhì)粒含量＞80%（4）Ⅲ號柱層析：去除內(nèi)毒素內(nèi)毒素降至≤0.01EU/ug3.建立了產(chǎn)品質(zhì)量控制標準：

細菌蛋白定量檢測方法RNA殘留檢測方法細菌殘余DNA檢測方法內(nèi)毒素檢測方法小規(guī)模中試產(chǎn)品樹突狀細胞在靶向防齲DNA疫苗免疫中的作用機制研究靶向防齲DNA疫苗編碼的蛋白能否與樹突狀細胞特異結合？靶向疫苗對樹突狀細胞的免疫相關基因表達產(chǎn)生的影響。粘膜免疫誘導部位和系統(tǒng)免疫部位的樹突狀細胞基因表達譜的差異。靶向防齲DNA疫苗編碼的蛋白能否與樹突狀細胞（DC）特異結合？問題1靶向融合蛋白與DC的靶向結合能力研究1.人外周血來源的DC的培養(yǎng)和鑒定

淋巴細胞分離液離心400g×30min外周血單個核細胞單核細胞磁珠分選樹突狀細胞體外培養(yǎng)MorphologySurfacemarkerFunction稀釋外周血典型的樹突狀細胞形態(tài)（×40）典型的表面分子標志低表達CD14、CD83，高表達CD1a、CD80、CD86、CD40明顯的刺激T細胞增殖功能2.靶向融合蛋白與DC的靶向結合作用研究1）靶向質(zhì)粒轉染COS-7細胞，收集培養(yǎng)上清，制備靶向融合蛋白2）分組：

A:單純DCB:DC與靶向融合蛋白共孵育

C:封閉B7分子的DC與靶向融合蛋白共孵育3）流式細胞術比較三組DC結合靶向融合蛋白的量三組之間平均熒光強度比較分組

平均熒光強度單位*

p<0.05，單因素方差分析和LSD檢驗A

3.797.814.49B*

7.3410.868.95C

4.936.687.77問題2

靶向防齲DNA疫苗與樹突狀細胞相互作用后，樹突狀細胞有哪些特異的基因表達變化？靶向防齲DNA疫苗和非靶向防齲DNA疫苗分別轉染樹突狀細胞3天后收集樹突狀細胞分離RNA合成探針與樹突狀細胞/抗原提呈細胞芯片雜交芯片掃描及數(shù)據(jù)分析Targetedgroupnon-targetedgroup與非靶向組相比，靶向DNA疫苗轉染的樹突狀細胞有27個免疫相關基因上調(diào)，7個免疫相關基因下調(diào)。差異表達基因按功能分為5類：

1）細胞因子、趨化因子及其受體

2）抗原攝取

3）抗原提呈

4）細胞表面受體

5）信號轉導熒光定量PCR驗證芯片結果genenameprimersannealingTemperature(℃)Pouductlength(bp)GAPDHF:5'AAGAAGGTGGTGAAGCAGGC3'R:5'TCCACCACCCTGTTGCTGTA3'57203Ccl17F:5'TGCTGCCTGGATTACTTCAA3'R:5'CCCTGGACAGTCAGAAACAC3'58110Ccl19F:5'AGCCTTCCGCTACCTTCTTA3'R:5'GCTGTTGCCTTTGTTCTTGG3'58160CD207F:5'CTACAAGGCAGCAGATGGAA3'R:5'GACACCCTGATATTGGCACA3'58177cd209aF:5'GAGATGACGGCTGGAATGAC3'R:5'GAGATGGTGGAGGGAGTTGG3'58109Cst7F:5'CTTGCCCTCTGCTGCCTAA3'R:5'GCACTCCTGGGTTATTGGTC3'59127IFNγF:5'AGCAACAACATAAGCGTCAT3'R:5'CCTCAAACTTGGCAATACTC3'58100IL-4F:5'CATCCTGCTCTTCTTTCTCG3'R:5'CCTTCTCCTGTGACCTCGTT3'58105GenenamesTargetedgroupNon-targetedgroupRatioCCL172.14E-022.27E-039.43CCL191.56E-011.24E-0212.58CD2073.71E-021.13E-023.28CD209a1.43E-012.63E-025.44CST72.37E-021.11E-022.14IFNr2.33E-021.16E-022.00IL-43.04E-021.07E-022.84結論：

一組免疫相關基因在靶向DNA疫苗增強免疫反應的過程中發(fā)揮作用，其中CCL17和CCL19可能更為關鍵。問題3DNA疫苗通過粘膜途徑和系統(tǒng)途徑免疫后誘導的抗體反應具有明顯的差異。是否粘膜免疫誘導部位的樹突狀細胞和系統(tǒng)免疫部位不同？免疫磁珠法從小鼠派伊爾結分離粘膜樹突狀細胞單細胞懸液與抗小鼠CD11c抗體包被的磁珠共孵育過分離柱洗脫陽性細胞免疫磁珠法從小鼠皮膚分離系統(tǒng)樹突狀細胞單細胞懸