人類染色體標(biāo)本制備及核型分析VIP

人類染色體標(biāo)本制備及核型分析實(shí)驗(yàn)三2021/5/2711、掌握人類外周血細(xì)胞常規(guī)核型的標(biāo)本制備方法；2、掌握胰酶法G顯帶的技術(shù)；3、掌握G顯帶核型分析的基本過程和技術(shù)；4、熟悉快速線條圖的繪制；5、了解染色體自動分析系統(tǒng)的原理和使用方法。一、目的與要求

2021/5/272二、基本原理

（一）染色體標(biāo)本制備

外周血中的淋巴細(xì)胞幾乎都是處在G0期或G1期，一般情況下是不分裂的。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入植物血凝素（phytohemagglutinin,PHA）時(shí)，這種小淋巴細(xì)胞受到刺激后轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，并開始進(jìn)行有絲分裂。經(jīng)過短期培養(yǎng)后，用秋水仙素處理、低滲、固定、滴片和染色，就可獲得大量中期分裂相的細(xì)胞，制片后可以清楚地對染色體進(jìn)行觀察。2021/5/273染色體標(biāo)本制作技術(shù)有下述四大發(fā)現(xiàn)：

一、美籍華人徐道覺(1952)從助手工作中的失誤發(fā)現(xiàn)采用蒸餾水低滲處理分裂細(xì)胞可使染色體展開；二、Tjio(1956)發(fā)現(xiàn)秋水仙素可使分裂的細(xì)胞停止在中期；三、LiJ．G．發(fā)現(xiàn)PHA(phytohemagglutin)(植物血球凝集素)可使淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，呈分裂狀態(tài)；四、標(biāo)本的空氣干燥法使細(xì)胞和染色體展平。2021/5/274這種培養(yǎng)方法是Moorhead于1960年建立的。在人類遺傳分析中普遍采用外周血培養(yǎng)的方法獲取分裂的細(xì)胞，進(jìn)而開展臨床和基礎(chǔ)遺傳學(xué)的研究。這對于遺傳疾病的檢出以及遺傳咨詢等工作發(fā)揮了重要作用。2021/5/275（二）染色體顯帶

人們將用各種不同的方法，以及用不同的染料處理染色體標(biāo)本后，使每條染色體上出現(xiàn)明暗相間，或深淺不同帶紋的技術(shù)稱為顯帶技術(shù)（bandingtechnique）。2021/5/276

研究發(fā)現(xiàn)，人染色體標(biāo)本經(jīng)胰蛋白酶、Na0H、檸檬酸鹽或尿素等試劑處理后，再用Giemsa染色，可使每條染色體上顯示出深淺交替的橫紋，這就是染色體的G帶。每條染色體都有其較為恒定的帶紋特征，所以G顯帶后，可以較為準(zhǔn)確的識別每條染色體，并可發(fā)現(xiàn)染色體上較細(xì)微的結(jié)構(gòu)畸變。2021/5/277

關(guān)于G顯帶的機(jī)理目前有多種說法，較常見的有

1、Lee等（1973）認(rèn)為染色體上與DNA結(jié)合疏松的組蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后這些區(qū)段成為淺帶，而那些組蛋白和DNA結(jié)合牢固的區(qū)段可被染成深帶。2021/5/278

2、有人認(rèn)為，染色體顯帶現(xiàn)象是染色體本身存在著帶的結(jié)構(gòu)。比如用相差顯微鏡觀察未染色的染色體時(shí)，就能直接觀察到帶的存在。用特殊方法處理后，再用染料染色，則帶更加清楚，隨顯帶方法不同，顯出來的帶特點(diǎn)也不一樣，說明帶的出現(xiàn)又與染料特異結(jié)合有關(guān)。2021/5/279

一般認(rèn)為，易著色的陽性帶為含有AT多的染色體節(jié)段，相反，含GC多的染色體段則不易著色?？偟膩碚f，G顯帶的機(jī)理還未搞清。2021/5/2710三、內(nèi)容與操作一、染色體G顯帶標(biāo)本的制備

1.采血：采血過程中嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作。

2．接種：超凈工作臺內(nèi)0.3～0.5ml

輕輕水平搖動混勻。３．培養(yǎng)：5%CO2，37℃±5℃恒溫箱培養(yǎng)64-65小時(shí)；卡介苗注射器(5號針頭)向培養(yǎng)瓶中加入20μg/ml秋水仙素（0.01%）一滴，輕輕搖勻，放回溫箱繼續(xù)培養(yǎng)至68小時(shí)。

2021/5/27114、離心：10分鐘（1500轉(zhuǎn)／分），棄上清液，留下沉淀物。5、低滲：6～8m1預(yù)溫37℃的0.075MKCl溶液，沉淀細(xì)胞重重沖散，37℃水浴箱30-35分鐘。6、預(yù)固定：1ml新配制的固定劑，輕輕沖打，37℃水浴箱中靜置5分鐘。7、離心：1500轉(zhuǎn)／分離心10分鐘，棄上清液。6．第一次固定：固定液6～8m1，沉淀物輕輕沖打均勻，37℃水浴箱中靜置固定10分鐘。7、第一次離心10分鐘(1500轉(zhuǎn)／分)，棄上清液。8、重復(fù)第6、7步。2021/5/27129、制片：留固定液0.2ml～0.4ml，輕輕沖打制成細(xì)胞懸液。冰凍載波片，滴管口距離載玻片10～15cm，每片2～3滴。10、烤片：75℃烤箱烤3小時(shí)。自然冷卻。2021/5/271311、胰酶預(yù)溫：立式染色缸中磷酸緩沖液100ml（1／15MNaH2PO480.8ml，KH2PO419.2ml)，2.5％的胰蛋白酶原液1ml配成0.025％的工作液。37℃的恒溫水浴箱內(nèi)預(yù)溫。12、顯帶：不斷輕輕擺動，使胰酶作用均勻，處理時(shí)間25～90秒鐘左右（較陳舊標(biāo)本時(shí)間適當(dāng)延長，隨著處理標(biāo)本數(shù)量增加，胰酶逐漸消耗，胰酶作用時(shí)間逐漸延長，精確的時(shí)間自行摸索）。取出標(biāo)本片，立即用37℃預(yù)溫的生理鹽水輕輕漂洗兩次，去除片子上的胰酶溶液。2021/5/271413、染色：37℃預(yù)溫的Giemsa工作液染色1－2分鐘，自來水沖洗，氣干。14、鏡檢：低倍鏡下選擇分散良好的長度適中的分裂相轉(zhuǎn)換油鏡觀察，若染色體未出現(xiàn)帶紋，則為顯帶不足；若染色體邊緣發(fā)毛為顯帶過頭，此時(shí)應(yīng)根據(jù)具體情況增減胰蛋白酶處理時(shí)間重新處理一張標(biāo)本。

2021/5/2715注意事項(xiàng)玻片完全干后，才可置油鏡下進(jìn)行觀察。

每次顯帶均應(yīng)做予實(shí)驗(yàn)處理，以決定正確的顯帶時(shí)間，不可盲目處理所有玻片。

顯帶效果的判斷，應(yīng)多觀察幾個(gè)長度適中的分裂相,不能僅憑1、2個(gè)分裂相的顯帶效果決定下一步顯帶時(shí)間。2021/5/2716二、G顯帶標(biāo)本的核型分析

一禿二蛇三蝶飛，四象鞭炮五黑腰。 六號短臂小白臉，七上八下九苗條。 十號長臂三條帶，十一低來十二高， 十三十四十五號，三個(gè)一樣一二一。 十六長臂近點(diǎn)深，十七遠(yuǎn)端帶腳鐐。 十八人小肚皮大，十九中間一點(diǎn)腰。 二十頭重腳底輕，二十一象葫蘆瓢。二十二一點(diǎn)Y黑腰，Xpq一肩挑。2021/5/27171號染色體中央著絲粒和次縊痕染色深。?短臂：近側(cè)段和中段各有一條深帶，其中段深帶稍寬，在處理較好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段可顯出2-3條淡染的深帶。此臂分為3個(gè)區(qū)，近側(cè)的深帶為2區(qū)1號帶，中段深帶為3區(qū)1號帶。

?長臂：次溢痕緊貼著絲粒，染色濃。其遠(yuǎn)側(cè)為一寬的淺帶，中段和遠(yuǎn)側(cè)段各有兩條深帶，以中段第2深帶染色較濃，中段兩條深帶稍靠近。此臂分為4個(gè)區(qū)，次溢痕遠(yuǎn)側(cè)的淺帶為2區(qū)1號帶，中段第2深帶為3區(qū)1號帶，遠(yuǎn)側(cè)段第3深帶為4區(qū)1號帶。一禿2021/5/27182號染色體

?短臂：可見4條深帶，中段的兩條深帶稍靠近。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段第2、3深帶之間的淺帶為2區(qū)1號帶。

?長臂：可見6-7條深帶，此臂分為3個(gè)區(qū)，第2和第3深帶之間的淺帶為2區(qū)1號帶，第4和第5深帶之間的淺帶為3區(qū)1號帶。二蛇2021/5/27193號染色體著絲粒染色濃。在短臂和長臂的中短各有一條明顯而寬闊的淺帶。

?短臂：一般在近側(cè)段可見兩條深帶，遠(yuǎn)側(cè)段可見3條深帶，其中遠(yuǎn)側(cè)近端部的一條較窄，且著色較淡，這是區(qū)別3號染色體短臂的顯著特征。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1號帶。

?長臂：一般在近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段各有一條較寬的深帶。在處理較好的標(biāo)本上，近側(cè)段的深帶可分為3條深帶，此臂分為2個(gè)區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1號帶。三蝶飛2021/5/27204號染色體

?短臂：可見1-2條深帶，短臂只有1個(gè)區(qū)。

?長臂：可見均勻分布的4條深帶，在處理較好的標(biāo)本上，在2、3深帶間還可顯出一條較窄的深帶。此臂分為3個(gè)區(qū)，近側(cè)段第1、2深帶間的淺帶為2區(qū)1號帶；遠(yuǎn)側(cè)段第3、4深帶間的淺帶為3區(qū)1號帶。四象鞭炮2021/5/27215號染色體

?短臂：可見1-2條深帶，其遠(yuǎn)側(cè)的深帶寬而且色濃。此臂只有1個(gè)區(qū)。

?長臂：近側(cè)段有一條深帶，染色較淡；中段可見3條深帶，染色較濃；遠(yuǎn)側(cè)段可見1-2條深帶，近末段的一條著色較濃。此臂分為3個(gè)區(qū)，中段第

2深帶為2區(qū)1號帶；中段第3深帶與遠(yuǎn)側(cè)段第1深帶之間寬闊的淺帶為3區(qū)1號帶。五黑腰2021/5/27226號染色體著絲粒染色濃。

?短臂：中段有一條明顯而寬闊的淺帶，近側(cè)段和遠(yuǎn)側(cè)段各有一條深帶，近側(cè)段的深帶緊貼著絲粒。在處理較好的標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段的深帶可分為2條深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段的明顯而寬闊的淺帶為2區(qū)1號帶。?長臂：可見5條深帶，近側(cè)的一條緊貼著絲粒。遠(yuǎn)側(cè)段末段的一條深帶窄而且著色較淡。此臂分為2個(gè)區(qū)，第2和第3深帶之間的淺帶為2區(qū)1號帶。六號短臂小白臉2021/5/27237號染色體著絲粒染色濃。

?短臂：有3條深帶，中間的一條深帶窄而且著色極淡，有時(shí)不明顯，遠(yuǎn)側(cè)近末段的深帶著色濃而稍寬，宛如“瓶蓋”，這常常是辨別7號染色體的明顯特征。此臂分為2個(gè)區(qū)，遠(yuǎn)側(cè)深帶為2區(qū)1號帶。

?長臂：有3條明顯的深帶，遠(yuǎn)側(cè)近末段的一條深帶著色較淡，第2和第3深帶稍接近。此臂分為3個(gè)區(qū)，近側(cè)第1深帶為2區(qū)1號帶；中段的第2深帶為3區(qū)1號帶。七上2021/5/27248號染色體

?短臂：有2條深帶，其間有一條較明顯的淺帶，這是與10號染色體相區(qū)別的主要特征。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段淺帶為2區(qū)1號帶。

?長臂：近側(cè)段可見2-3條分界不明顯的深帶，遠(yuǎn)側(cè)段有一明顯而恒定的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段深帶為2區(qū)1號帶。八下2021/5/27259號染色體著絲粒染色濃。

?短臂：遠(yuǎn)側(cè)段可見兩條深帶，在有的標(biāo)本上融合成一條深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，近側(cè)的第1深帶為2區(qū)1號帶。

?長臂：可見兩條明顯的深帶，次溢痕一般不著色，在有些標(biāo)本上呈現(xiàn)特有的狹長“頸部區(qū)”。此臂分為3個(gè)區(qū)，近中段的一深帶為2區(qū)1號帶，遠(yuǎn)側(cè)段的一深帶為3區(qū)1號帶。九苗條2021/5/272610號染色體著絲粒染色濃。

?短臂：近中段有一條深帶。此臂只有1個(gè)區(qū)。

?長臂：可見明顯的3條深帶，近側(cè)的一條著色最濃。該長臂上的這3條明顯的深帶是與8號染色體相區(qū)別的一個(gè)主要特征。此臂分為2個(gè)區(qū)，近側(cè)段的第1深帶為2區(qū)1號帶。十號長臂三條帶2021/5/272711號染色體著絲粒染色濃。

?短臂：近中段可見一條寬的深帶，在處理較好的標(biāo)本上，這條深帶可分為兩條較窄的深帶。此臂只有1個(gè)區(qū)。

?長臂：近側(cè)有一條深帶，緊貼著絲粒，近中段可見一條明顯的較寬的深帶，在這條深帶與近側(cè)深帶之間有一條寬闊的淺帶。在處理較好的標(biāo)本上，近中段的這條較寬的深帶可分成兩條較窄的深帶，兩深帶之間有一條很窄的淺帶，后者雖常不明顯，但卻是分區(qū)上的一個(gè)界標(biāo)。在有些標(biāo)本上近末端處尚可見一條窄的淺色的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，界標(biāo)即2區(qū)1號帶為上述近中段兩深帶之間的那條很窄的淺帶。十一低來2021/5/272812號染色體著絲粒染色濃。

?短臂：中段可見一條深帶，此臂只有一個(gè)區(qū)。

?長臂：近側(cè)有一條深帶緊貼著絲粒。中段有一條寬的深帶，這條深帶與近側(cè)深帶之間有一條明顯的淺帶，但與11號染色體比較，這條淺帶較窄，這是鑒別11號與12號染色體的一個(gè)主要的特征。在處理較好的標(biāo)本上，中段這條較寬的深帶可顯出3條較窄的深帶，且正中一條著色較濃。在有些標(biāo)本上，遠(yuǎn)側(cè)段還可見1-2條窄的染色較淡的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段正中著色較濃的深帶為2區(qū)1號帶。十二高2021/5/272913號染色體著絲粒和短臂染色濃。

?長臂：可見4條深帶，第1和第4深帶較窄、染色較淡；第2和第3深帶較寬、染色較濃。此臂分為3個(gè)區(qū)，第2深帶為2區(qū)1號帶，第3深帶為3區(qū)1號帶。十三十四十五號，三個(gè)一樣一二一2021/5/273014號染色體著絲粒和短臂染色深。

?長臂：

近中段和遠(yuǎn)側(cè)段各有一條較明顯的深帶。在處理較好的標(biāo)本上其近側(cè)可顯出一條深帶，其中段可顯出一條著色較淡的深帶。此臂分為

3個(gè)區(qū)，近側(cè)第2條深帶為2區(qū)1號帶，遠(yuǎn)側(cè)第4深帶為3區(qū)1號帶。2021/5/273115號染色體著絲粒和短臂染色濃。

?長臂：中段有一條明顯的深帶，染色較濃。在有的標(biāo)本上其近側(cè)段可見1-2條

淡染的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段深帶為2區(qū)1號帶。2021/5/273216號染色體中央著絲粒和次縊痕染色濃。

?短臂：中段有一條著色較淡的深帶，在有的標(biāo)本上可見兩條深帶。此臂只有

一個(gè)區(qū)。

?長臂：除次縊痕外有兩條深帶，遠(yuǎn)側(cè)段的一條有時(shí)不明顯。此臂分為2個(gè)區(qū)，中段深帶為2區(qū)1號帶。十六長臂近點(diǎn)深2021/5/273317號染色體著絲粒染色濃。

?短臂：中段有一條深帶。此臂只有一個(gè)區(qū)。

?長臂：遠(yuǎn)側(cè)段可見一條深帶，這條深帶與著絲粒相連的深帶之間為一明顯而寬的淺帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，上述淺帶為2區(qū)1號帶。十七遠(yuǎn)端帶腳鐐2021/5/273418號染色體

?短臂：一般為淺帶。此臂只有一個(gè)區(qū)。

?長臂：近側(cè)和遠(yuǎn)側(cè)各有一條明顯的深帶。此臂分為2個(gè)區(qū)，兩條帶之間的淺帶為2區(qū)1號帶。十八人小肚皮大2021/5/273519號染色體著絲粒及其周圍為深帶，其余均為淺帶。在有的標(biāo)本上其長臂近中部可顯出一條著色極淡的深帶。短臂和長臂均只有一個(gè)區(qū)。十九中間一點(diǎn)腰2021/5/