細(xì)菌的標(biāo)本片制備及染色課件講解

動物微生物

http://婁底職業(yè)技術(shù)學(xué)院任務(wù)3

細(xì)菌抹片的制備及染色一、目的要求

1、了解細(xì)菌簡單染色法和革蘭氏染色法的原理。

2

、掌握細(xì)菌抹片技術(shù)及幾種常用染色法的操作步驟。二、原理

由于細(xì)菌體積小且透明，在活體細(xì)胞內(nèi)又含有大量的水分，因此，對光線的吸收和反射與水溶液相差不大。當(dāng)把細(xì)菌懸浮在水滴內(nèi)，放在顯微鏡下觀察時，由于與周圍背景沒有顯著的明暗差，難于看清它們的形狀，更談不上識別其細(xì)微結(jié)構(gòu)。而經(jīng)過染色，就可借助顏色的反襯作用比較清楚地看到菌體形態(tài)，這樣便可在普通光學(xué)顯微鏡下清晰地觀察到微生物的形狀和結(jié)構(gòu)，而且還可以通過不同的染色反應(yīng)來鑒別細(xì)菌。三、器材

1、大腸桿菌、葡萄球菌18-24h液體培養(yǎng)物和斜面培養(yǎng)物

2、美蘭染色液，革蘭氏染色液

3、載玻片、接種杯、酒精燈、染色架、吸水紙、蠟筆、擦鏡紙、顯微鏡、香柏油等四、內(nèi)容和方法（一）細(xì)菌抹片的制備1、涂片方法

（1）菌落涂片方法：用經(jīng)酒精燈火焰滅菌過的接種環(huán)，蘸取生理鹽水1滴于載玻片中央，再勾取細(xì)菌的固體培養(yǎng)物少許混于生理鹽水中，涂抹成直徑1－1.5cm大小均勻的抹片，此膜應(yīng)既薄又均勻?yàn)楹?，待干即成。?）菌液涂片法：用滅菌接種環(huán)蘸取菌液1－2接種環(huán)，均勻涂抹再載玻片上，呈直徑1－1.5cm左右的圓形涂膜，自然干燥后備用。（3）組織涂片方法：先用鑷子夾持組織局部，以滅菌剪刀剪取一小塊，夾出后以其新鮮切面在載玻片上壓印或涂成一薄層。2、干燥涂片最好在室溫自然干燥。必要時，可將標(biāo)本面向上，在離酒精燈火焰遠(yuǎn)處烘干，切勿緊靠火焰，以免標(biāo)本糊焦而不能檢查。3、固定（1）火焰固定將已干燥好的抹片，使涂面向上，以鐘擺速度通過酒精燈火焰3－4此，以標(biāo)本片不燙手為度。放置冷卻后，進(jìn)行染色。（2）化學(xué)固定血液、組織臟器等抹片做姬姆薩染色或單染色時，不能用火焰固定?？蓪⒏稍锏哪ㄆ爰状?－3min，取出晾干；或者在抹片上滴加數(shù)滴甲醇使其作用2－3min，自然揮發(fā)干燥。抹片做瑞特氏染色時則不必做特別固定，染色液中含有的甲醇可以達(dá)到固定的目的。抹片固定的目的：（1）使菌體蛋白凝固附著在載玻片上，以防染色過程中被水沖掉。（2）殺死細(xì)菌以改變細(xì)菌對染料的通透性。（3）能殺死抹片中的部分微生物。（二）細(xì)菌常用的染色方法

1、簡單染色法：所謂單染色法是利用單一染料對細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法。此法操作簡便，適用于菌體一般形態(tài)的觀察。如。美藍(lán)染色法：在已干燥、固定好的抹片上，滴加適量的（足夠覆蓋抹片點(diǎn)即可）美藍(lán)染色液，經(jīng)1－2min，水洗，瀝去多余的水分，吸干或烘干（不能太熱），然后鏡檢2、復(fù)染色法：應(yīng)用兩種或兩種以上的染料或再加助染劑進(jìn)行染色的方法。染色后不同細(xì)菌和物體或細(xì)菌結(jié)構(gòu)的不同部分科呈現(xiàn)不同顏色，有鑒別細(xì)菌的作用。如革蘭氏染色法、抗酸染色法和姬姆薩染色法等。革蘭氏染色法：（1）在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色液，經(jīng)1-2min，水洗。（2）加革蘭氏碘液于抹片上媒染，1-3min，水洗。（3）加95%乙醇于抹片上脫色，約30s至1min，水洗。（4）加石炭酸復(fù)紅液復(fù)染1-2min，水洗。（5）吸干或烘干，鏡檢。革蘭氏陽性菌呈藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。葡萄球菌G+菌----藍(lán)紫色大腸桿菌G-菌----淡紅色五、思考題

1、革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？

2、細(xì)菌為何在染色前固定？

3、試述革蘭氏染色的原理和步驟。

4、繪出你所觀察到的細(xì)菌形態(tài)。附：載玻片處理載玻片應(yīng)清晰透明，清潔而無油漬，如有殘余油漬，可按下列方法處理。

1.滴上95％酒精