原生質(zhì)體的分離培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)-原生質(zhì)體的分離培養(yǎng)

原生質(zhì)體培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交

——原生質(zhì)分離培養(yǎng)

主講人：姜放軍湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院植物組織培養(yǎng)技術(shù)工作任務(wù)原生質(zhì)體的培養(yǎng)及活力鑒定任務(wù)3對(duì)向日葵下胚軸和子葉的原生質(zhì)游離任務(wù)1原生質(zhì)體融合及融合體的培養(yǎng)

任務(wù)4融合體的選擇及雜種細(xì)胞進(jìn)行鑒定

任務(wù)5

對(duì)獲得的原生質(zhì)體純化任務(wù)2原生質(zhì)體存活率測(cè)定原生質(zhì)體純化原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體融合融合體培養(yǎng)原生質(zhì)體分離融合體的選擇雜種細(xì)胞鑒定原生質(zhì)體培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交基本流程及常用方法實(shí)踐知識(shí)一、向日葵下胚軸和子葉的原生質(zhì)體分離（酶解法）

（一）無(wú)菌苗培育

選取仔粒飽滿日葵種子去殼后,消毒將消毒的種子接種于不含任何激素的MS固體培養(yǎng)基上。置于暗處發(fā)芽,溫度為(26±1)℃。（二）酶液的配制

酶液Ⅰ組成：纖維素酶酶液Ⅱ組成：纖維素酶（三）原生質(zhì)體分離(一步分離法)

取前面培育的無(wú)菌苗，用刀片切下下胚軸后撕去表皮，縱剖若干細(xì)條，再橫切成2～3mm小段放入酶液Ⅰ中。撕去葉片的小表皮，切成小塊放入酶液Ⅱ中。每10mL酶液中約放2g材料，在26℃下酶解3～4h，其間搖動(dòng)幾次。

（四）向日葵下胚軸原生質(zhì)體的純化（漂浮法）漂浮法：是指應(yīng)用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質(zhì)體漂浮于液體表面，來(lái)進(jìn)行原生質(zhì)體純化的方法。

向日葵下胚軸原生質(zhì)體的純化具體方法步驟如下：

1.將酶解后的向日葵下胚軸原生質(zhì)體用200目不繡鋼網(wǎng)過(guò)濾，除去未解離的組織，再用22%的蔗糖溶液沖洗網(wǎng)上殘?jiān)ㄕ崽侨芤后w積與酶液相等）。

2.濾液（即酶液和蔗糖液）裝入離心管，以600r/min離心3～6min。

3.待原生質(zhì)體漂浮后吸去下面的液體及殘?jiān)?.加入17%蔗糖溶液6～8ml，混勻后離心（600r/min，5分鐘），吸去下面的液體及殘?jiān)?，重?fù)一次。5.加入1～2ml0.16mol/LCaCl2?2H2O（加1%MES，pH=5.8），使原生質(zhì)體的密度在2103g/ml條件下懸浮，以備后面進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)和融合之用。

（五）向日葵子葉原生質(zhì)體的純化（界面法）界面法：是指選用兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液的密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液密度小于原生質(zhì)體的密度，原生質(zhì)體即介于兩種溶液之間，從而對(duì)原生質(zhì)體進(jìn)行純化的方法。

原生質(zhì)體分離及純化

一、原生質(zhì)體分離雙子葉外植體胚性細(xì)胞（一）材料來(lái)源多數(shù)植物分離原生質(zhì)體的經(jīng)典材料-----葉肉細(xì)胞。問(wèn)題探究

禾本科植物：愈傷組織或懸浮細(xì)胞。供體材料的重要性

供體材料是影響原生質(zhì)體培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。理論上植物的各種器官、組織和細(xì)胞都可作為分離原生質(zhì)體的供體材料，但目前常用葉片、分裂旺盛和再生能力強(qiáng)的愈傷組織及懸浮細(xì)胞系，尤其是胚性愈傷組織或胚性懸浮細(xì)胞系是最理想的原生質(zhì)體分離材料。（二）分離方法機(jī)械分離法酶法分離法最初用的是機(jī)械分離的辦法，但是效率極低。英國(guó)科學(xué)家Cocking于1960年利用酶.降解去細(xì)胞壁的辦法從番茄根尖分離了大量的原生質(zhì)體，成為現(xiàn)在廣泛使用的方法。首先對(duì)外植體進(jìn)行預(yù)處理有兩種方法：低溫處理：外植體放在4℃下，黑暗中1-2天。等滲溶液處理：外植體放在等滲溶液中數(shù)小時(shí)。1、機(jī)械分離法優(yōu)點(diǎn)：

（1）能排除酶的有害影響；

缺點(diǎn)：

（1）原生質(zhì)體的產(chǎn)量低；

（2）方法繁瑣費(fèi)力；

（3）液泡化程度低的細(xì)胞也不能采用,此方法局限性大步驟：使細(xì)胞質(zhì)壁分離→切開(kāi)細(xì)胞壁→獲得原生質(zhì)體。（1）確定酶的種類(lèi)纖維素酶類(lèi)（Cellulase）果膠酶類(lèi)（Pectolyase）半纖維素酶類(lèi)（Hemicellulase）崩潰酶蝸牛酶2、酶法分離（Enzymaticisolation）

植物細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的構(gòu)成：細(xì)胞膜：脂類(lèi)、蛋白質(zhì)細(xì)胞壁：初生壁（纖維素、半纖維素、果膠、量結(jié)構(gòu)蛋白）、次生壁（纖維素、半纖維素）兩個(gè)相鄰細(xì)胞的初生壁之間有胞間層。（2）酶液的配制酶的配比及濃度滲透壓穩(wěn)定劑及pH（3）分離原生質(zhì)體一步法：外植體放入酶液，真空泵抽引滲透處理、26℃搖床振蕩2-8小時(shí)方法有二：

葉肉原生質(zhì)體分離提純兩步分離法一步分離法兩步法：果膠酶處理材料、游離出單細(xì)胞、纖維素酶處理單細(xì)胞、分離出原生質(zhì)體優(yōu)點(diǎn)：所獲得的原生質(zhì)體均勻一致、質(zhì)量好；缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，已被淘汰。圖示一步法原生質(zhì)體分離過(guò)程（以葉片為例）過(guò)濾、離心加果膠酶和纖維素酶原生質(zhì)體純化與活力測(cè)定（一）原生質(zhì)體純化方法三種離心沉淀法漂浮法界面法

純化原因：上述酶處理后的混合物含有：未消化組織、破碎細(xì)胞和原生質(zhì)體。所以，必須對(duì)得到的混合液體進(jìn)行純化，以得到純凈的原生質(zhì)體。問(wèn)題探究1、離心沉淀法

原理：應(yīng)用原生質(zhì)體的比重大于溶液，離心后原生質(zhì)體沉于底部。步驟：第一步原生質(zhì)體溶液用400目網(wǎng)篩過(guò)濾，除去未消化的組織細(xì)胞。第二步離心（500-1000r/min，離心5-6min）。第三步吸去上清液，洗滌液重新懸浮，再離心沉淀。如此2-3次。第四步用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗1次，收集原生質(zhì)體。沉降法的優(yōu)點(diǎn)：純化收集方便，原生質(zhì)體丟失少；目前被廣泛采用。缺點(diǎn)：原生質(zhì)體純度不高。2、漂浮法原理：應(yīng)用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質(zhì)體漂浮在液體的表面。步驟：第一步：400目網(wǎng)篩過(guò)濾。第二步：離心。第三步：吸去上清液，洗滌液重懸，離心沉淀。2-3次。第四步：收集溶液表面原生質(zhì)體，用培養(yǎng)液洗1次。漂浮法的優(yōu)點(diǎn)：原生質(zhì)體純度高。缺點(diǎn)：原生質(zhì)體收率低。3、界面法(不連續(xù)梯度法)

原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度。25%蔗糖溶液13%甘露醇溶液

步驟離心管中配制成不同的濃度梯度加入原生質(zhì)體混合液離心5min，原生質(zhì)體位于某一濃度梯度，用吸管收集液體培養(yǎng)基。懸浮洗滌原生質(zhì)體2-3次將原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中備用優(yōu)點(diǎn)：獲得的原生質(zhì)體大小均勻一致，純度高；

缺點(diǎn)：操作繁瑣，原生質(zhì)體收率低。（二）原生質(zhì)體活力測(cè)定1、形態(tài)識(shí)別：形態(tài)上完整，呈圓形，含有飽滿的細(xì)胞質(zhì)，顏色鮮艷的即為存活的原生質(zhì)體。2、染色識(shí)別

1）0.1%酚番紅或Evans藍(lán)染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。

2）雙醋酸鹽熒光素(FDA)染色法：在熒光顯微鏡下有熒光的即為有活性的原生質(zhì)體。影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素原生質(zhì)體活力原生質(zhì)體起始密度：過(guò)低過(guò)高均不利滲透壓穩(wěn)定劑：常用甘露醇培養(yǎng)基成分培養(yǎng)條件：初期培養(yǎng)是暗培養(yǎng)植物種類(lèi)

原生質(zhì)體培養(yǎng)一、培養(yǎng)基pH滲透壓鈣鎂生長(zhǎng)物質(zhì)氮源碳源培養(yǎng)基

（1）碳源

葡糖糖是最佳碳源，蔗糖單獨(dú)使用效果較差，與葡萄糖配合使用效果較好。碳源的作用一是保持細(xì)胞滲透壓，另一方面是作為細(xì)胞分裂時(shí)的能源物質(zhì)和組成原料。（2）氮源

適當(dāng)濃度的谷氨酰胺有利于原生質(zhì)體的的細(xì)胞再生、分裂、生長(zhǎng)。NH4+濃度太高不利于原生質(zhì)體的培養(yǎng)，有毒害作用，在馬鈴薯上已有研究證明。（3）生長(zhǎng)物質(zhì)

生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是細(xì)胞分裂分化所需要的通常物質(zhì)，原生質(zhì)體培養(yǎng)也需要這些生長(zhǎng)調(diào)劑。但不同植物對(duì)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度要求不同。（4）鈣鎂

研究指出在原生質(zhì)體培養(yǎng)中增加Ca2+的濃度?？稍鰪?qiáng)原生質(zhì)體的穩(wěn)定性，提高原生質(zhì)體的分裂能力率。明顯改變細(xì)胞內(nèi)外的離子交換。（5）滲透壓

最常用的滲透調(diào)節(jié)劑是山梨醇和甘露醇，兩者常結(jié)合在一起配合使用?，F(xiàn)在很多人用葡萄糖代替糖醇。（6）pH及滅菌

一般pH為5.6-6.0之間，培養(yǎng)基偏酸不利于與原生質(zhì)體的培養(yǎng)。（7）常用培養(yǎng)基：MS、B5、N6.2、養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度25-27度，光照16h/d左右，靜置為主，但為了不使細(xì)胞集聚，最初幾天需要經(jīng)常輕輕搖動(dòng)，以助通氣。有些材料不需要光照，所以依材料而定培養(yǎng)條件。3、與同種材料的不同基因型二、培養(yǎng)方法培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)平板培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法飼養(yǎng)層培養(yǎng)法原生質(zhì)體懸浮液1mm厚液體培養(yǎng)基2x105/ml1、液體淺層培養(yǎng)2、平板培養(yǎng)

原生質(zhì)體純化、離心、稀釋后，再與1.4%瓊脂或瓊脂糖（37

C左右）等體積混合成0.7%，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。3、雙層培養(yǎng)法（固、液培養(yǎng)）

培養(yǎng)皿底部鋪一層0.7%瓊脂糖的固體培養(yǎng)基，在其上進(jìn)行原生質(zhì)體淺層培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基4、飼養(yǎng)層培養(yǎng)方法一：X-射線殺死原生質(zhì)體，與生活力正常的原生質(zhì)體混合，加入0.7%瓊脂，制成混合液，培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中。方法二：X-射線殺死原生質(zhì)體，與0.7%瓊脂混合，在培養(yǎng)皿中鋪成平板，作為飼養(yǎng)層，再將生活力正常的原生質(zhì)體與0.7%瓊脂混合，培養(yǎng)于飼養(yǎng)層上。4、飼養(yǎng)層培養(yǎng)1、細(xì)胞壁再生：原生質(zhì)體培養(yǎng)后1-2天即可合成完整細(xì)胞壁，只有形成完整細(xì)胞壁的細(xì)胞才能進(jìn)入細(xì)胞分裂。2、細(xì)胞分裂、愈傷組織或胚狀體形成3、植株再生途徑：（1）通過(guò)愈傷組織形成不定芽；該途徑占多數(shù)。（2）原生質(zhì)體再生細(xì)胞直接形成胚狀體。植株再生問(wèn)題探究第一次分裂第二次分裂第三次分裂