食品中志賀氏菌檢驗(yàn)

關(guān)于食品中志賀氏菌檢驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

了解食品安全與志賀氏菌檢驗(yàn)關(guān)系1

了解志賀氏菌生理形態(tài)化學(xué)性質(zhì)2

掌握志賀氏菌檢驗(yàn)方法和結(jié)果判斷3檢驗(yàn)食品中是否有志賀氏菌4第2頁,共19頁，星期六，2024年，5月二.實(shí)驗(yàn)原理需氧或兼性厭氧。營養(yǎng)要求不高，能在普通培養(yǎng)基上生長，最適溫度為37℃，最適pH為6.4-7.8。37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)后菌落呈圓形、微凸、光滑濕潤、無色、半透明、邊緣整齊，直徑約2nm，能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。不發(fā)酵乳糖，靛基質(zhì)產(chǎn)生不定，甲基紅陽性，VP試驗(yàn)陰性，不分解尿素，不產(chǎn)生H2S。根據(jù)生化反應(yīng)可進(jìn)行初步分類。第3頁,共19頁，星期六，2024年，5月三、實(shí)驗(yàn)的試劑和儀器儀器與設(shè)備試劑和儀器培養(yǎng)基與試劑第4頁,共19頁，星期六，2024年，5月儀器與設(shè)備

規(guī)格名稱 數(shù)量 用途

1、500ml廣口瓶 1個(gè) 稀釋樣品

2、500ml三角瓶 1個(gè) 制增菌液

3、250ml三角瓶 4個(gè) 制培養(yǎng)基

4、18×180mm試管 制三糖鐵培養(yǎng)基

5、13×100mm試管 制蛋白胨水等

6、1ml移液管

7、10ml移液管

8、直徑為90mm平皿5副 制SS、EMB平板

9、250ml量筒 1個(gè)

10、玻璃棒

11.、恒水浴箱1個(gè)

12、顯微鏡1臺鏡檢第5頁,共19頁，星期六，2024年，5月培養(yǎng)基與試劑GN增菌液 225ml/瓶 1瓶 500ml三角瓶EMB培養(yǎng)基 100ml/瓶 1瓶 250ml三角瓶SS瓊脂 100ml/瓶 1瓶 250ml三角瓶三糖鐵斜面 6ml/支 6支15×150mm試管葡萄糖半固體培養(yǎng)費(fèi)基4ml/支 5支13×100mm試管蛋白胨水 2ml/支 5支13×100mm試管 5%乳糖發(fā)酵管 3ml/支 5支13×100mm試管甘露醇發(fā)酵管3ml/支 5支 13×100mm試管棉子糖發(fā)酵管 3ml/支 5支13×100mm試管 甘油發(fā)酵管 3ml/支 5支 13×100mm試管 第6頁,共19頁，星期六，2024年，5月四、實(shí)驗(yàn)步驟驗(yàn)步驟實(shí)流程圖操作步驟第7頁,共19頁，星期六，2024年，5月流程圖

采樣

↓樣品處理↓選擇性增菌↓選擇性平板劃分↓生化實(shí)驗(yàn)↓鏡檢↓結(jié)果報(bào)告

第8頁,共19頁，星期六，2024年，5月實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備對燒杯、玻璃棒、移液管、試管、培養(yǎng)皿、錐形瓶的清洗注意：洗滌后的儀器應(yīng)達(dá)到玻璃壁能被水均勻濕潤而無條紋和水珠對試管、玻璃棒、移液管、錐形瓶、燒杯、培養(yǎng)皿進(jìn)行包扎：要將報(bào)紙裁成5-10公分，成30°卷起，結(jié)尾處向上折疊即。包扎滅菌第9頁,共19頁，星期六，2024年，5月培養(yǎng)基的制備1.CN增菌液成分:胰蛋白胨20g檸檬酸鈉5g磷酸二氫鉀1.5g葡萄糖1g去氧膽堿酸鈉0.5g氯化鈉5g甘露醇2g磷酸氫二鉀4g蒸餾水1000mlph7.0制法：按上述成分配好，加熱溶解，校正PH。分裝每瓶225ml，115C高溫滅菌15min2、HE瓊脂成分：蛋白胨12g水楊素2g蒸餾水1000ml乙液20ml牛肉膏3g膽鹽20g0.4%溴麝香草芬蘭鈉溶液16ml乳糖12g氯化鈉5g蔗糖12g瓊脂20g甲液20mlHP7.5制法：將蛋白胨、乳糖、水楊素、氯化鈉、蔗糖、牛肉膏、膽鹽等溶解于400ml蒸餾水中作為基礎(chǔ)液；加瓊脂與600ml蒸餾水中，加熱溶解。加入甲液乙液與基礎(chǔ)液中，校正HP,再加指示劑。并與瓊脂液合并，冷卻，傾注平板，第10頁,共19頁，星期六，2024年，5月培養(yǎng)基的制備3、SS瓊脂液的配制成分：牛肉膏0.6g瓊脂2.04g三號膽鹽0.42g蒸餾水120ml，月示胨0.6g制法：將牛肉膏、月示胨和膽鹽溶解于400ml蒸餾水中，將瓊脂加入600ml蒸餾水中，煮沸使其溶解，再將兩液混合121℃高壓滅菌15min,保存?zhèn)溆谩?、麥慷慨瓊脂液的配制成分：蛋白胨2.04g脙胨0.36g豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)5g氯化鈉0.6g瓊脂2.04g蒸餾水120mL乳糖1.2g0.01%結(jié)晶紫水溶液1.2mL0.5%中性紅水溶液0.6mL制法：ⅰ將蛋白胨、胨、膽鹽和氯化鈉溶解于400mL蒸餾水中，校正pH7.2，將瓊脂加入于600ML蒸餾水中，加熱溶解。將兩液合并，分裝于121℃高壓滅菌15min備用。ⅱ臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，趁熱加入乳糖，冷至50～55℃時(shí)，加入結(jié)晶紫和中性紅水溶液，搖勻后傾注平板。第11頁,共19頁，星期六，2024年，5月培養(yǎng)基的制備5、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）成分：蛋白胨10g2%伊紅溶液20ml乳糖10g0.65%美蘭溶液10ml磷酸二氫鉀28g蒸餾水1000ml瓊脂17gPH7.1制法：將蛋白胨、磷酸鹽、瓊脂溶解于蒸餾水中，校正ph，分裝于燒杯內(nèi)，121c高壓滅菌15min備用。臨用時(shí)加入乳糖并加熱溶解瓊脂，冷卻，加入伊紅和美藍(lán)溶液，搖勻。傾注平板。6、三糖鐵瓊脂的配制成分：蛋白胨4.8g牛肉膏0.6g乳糖1.2g蔗糖1.2g葡萄糖0.12g氯化鈉0.6g硫酸亞鐵胺0.024g硫代硫酸鈉0.024g瓊脂0.72g酚紅0.003g蒸餾水120mLpH7.4制法：將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，校正pH。加入瓊脂，加熱煮沸，以溶化瓊脂。加入0.2%酚紅水溶液12.5mL，搖勻。分裝試管，裝量宜多些，以便得到較高的底層。121℃高壓滅菌15min。放置高層斜面?zhèn)溆?。?2頁,共19頁，星期六，2024年，5月培養(yǎng)基的制備7、生理鹽水的配制成分Nacl0.9g,蒸餾水100ml制法一般每種檢樣配制250ml生理鹽水。稱取2.2gNacl，加入250ml蒸餾水溶液；分裝于2支大試管中，每支9ml，再量取225ml裝入500ml廣口瓶中，并加入適量的玻璃珠；剩余的裝人另1支試管中，包扎后于121度高壓滅菌15min8、氯化鈉結(jié)晶紫增菌液的配制成分：蛋白胨2.4g氯化鈉4.8g0.01%結(jié)晶紫溶液0.6mL蒸餾水120mLpH9.0制法：胨晶晶紫外，其他按上述成分配好，加熱溶解。約加30%氫氧化鉀溶液4.5mL，校正pH。加熱煮沸，過濾。再加入結(jié)晶紫溶液，混合后分裝試管。121℃高壓滅菌15min第13頁,共19頁，星期六，2024年，5月

操作步驟1.滅菌干熱滅菌：剪刀及棉繩等干熱滅菌濕熱滅菌：均質(zhì)袋、紗布、各種培養(yǎng)基、生理鹽水、增菌液2.采樣從食堂中取一個(gè)雞蛋3.樣品處理將雞蛋打碎放入無菌碗里，然后用殺菌的玻璃棒攪拌，在放入到均質(zhì)袋中用均質(zhì)器打勻4.增菌稱取檢樣25g，加入裝有225mlGN增菌液的500ml的廣口瓶內(nèi)，于（36±1）℃培養(yǎng)6-8h第14頁,共19頁，星期六，2024年，5月操作步驟5.分離取增菌液一環(huán)，劃線接種于SS瓊脂平板一個(gè)，伊紅美藍(lán)瓊脂平板一個(gè)，于（36±1）℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。志賀菌在這些培養(yǎng)基上呈現(xiàn)無色透明不發(fā)酵乳糖的菌落。6.生化試驗(yàn)挑取平板上的可疑菌落，接種三塘鐵瓊脂和半固體各一管，一般應(yīng)多挑取幾個(gè)以防遺漏，志賀菌屬在三糖鐵瓊脂內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果為底層產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣，斜面產(chǎn)堿，不產(chǎn)生硫化氫，無動(dòng)力，在半固體管內(nèi)，沿穿刺線生長。7.鏡檢從三塘鐵瓊脂和半固體各一管中挑取生長出來的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，然后放在顯微鏡下觀察。8.結(jié)果報(bào)告第15頁,共19頁，星期六，2024年，5月五．注意事項(xiàng)1、志賀菌在常溫存活期很短。因此，當(dāng)樣品采集后，應(yīng)盡快進(jìn)行檢驗(yàn)。如果在24h內(nèi)檢驗(yàn)，樣品可保存在冰箱內(nèi)，入欲保存較長時(shí)間，必須放在低溫冰箱內(nèi)。2、迄今沒有很好的曾菌培養(yǎng)基。目前仍然認(rèn)為用GN肉湯曾菌檢查食品中和糞便中的志賀菌是有效的。第16頁,共19頁，星期六，2024年，5月注意事項(xiàng)3、增加鑒別培養(yǎng)基的數(shù)目，可以增加志賀菌的陽性檢出率。用于分離的鑒別培養(yǎng)基一般不少于兩個(gè)。中等選擇性的，HE或SS瓊脂平板一個(gè)；弱選擇性的。麥康凱或EMB瓊脂平板一個(gè)。WS瓊脂可作為中等選擇性培養(yǎng)基使用，F(xiàn)X瓊脂可作為弱選擇性培養(yǎng)基使用。4、動(dòng)力的觀