遺傳重組的分子機制

上一章主要內容回顧幾個主要的概念：轉化轉導普遍性轉導流產(chǎn)轉導幾個主要的知識點：轉化時重組率的計算轉導時基因順序的判斷第八章遺傳重組生物遺傳重組遺傳變異DNA重排DNA突變DNA的復制DNA的修復同源重組位點專一性重組異常重組第一節(jié)同源重組同源重組：依賴大范圍的DNA同源序列的聯(lián)會，重組過程中，兩個染色體或DNA分子交換對等的部分。

例：同源染色體非姐妹單體交換；細菌的轉化、轉導、接合；噬菌體的重組…一、概念條件：2個DNA分子序列同源；不同物種同源重組所需的最小的同源序列不同；

(cmi)λ噬菌體1

13C和14N重鏈

(++)λ噬菌體2

12C和14N輕鏈同時感染E.coli子代噬菌體CsCl密度梯度離心重鏈重鏈+輕鏈輕鏈二、同源重組的分子機制(一)、異源DNA雙鏈斷裂與重(錯)接證據(jù)：1961，M.MeselsonandJ.J.Wergle5’3’5’3’5’3’3’5’3’5’3’5’交叉理論（chiasmatatypehypothesis）

1909年，Janssens提出；斷裂和重接模型1937年，Darlington提出；模板選擇學說（copychoice）BellingJ.首先提出，1933年又撤回；1948年，Hershey再次提出；Holliday模型

1964年RobinHolliday提出；(二)、同源重組的Holliday模型斷裂重接模型和模板選擇復制模型存在的問題斷裂重接模型：不能解釋基因轉變和極化子現(xiàn)象；模板選擇復制模型：(1)違背了半保留復制；(2)DNA復制在S期，重組在偶線期，不應同時發(fā)生；(3)不能解釋3線和4線交換；交叉理論（chiasmatatypehypothesis）

1909年，Janssens提出；斷裂和重接模型1937年，Darlington提出；模板選擇學說（copychoice）BellingJ.首先提出，1933年又撤回；1948年，Hershey再次提出；霍利迪(Holliday)模型

1964年RobinHolliday提出；(二)、同源重組的Holliday模型1.同源的非姐妹染色單體聯(lián)會;2.DNA內切酶在非姐妹染色單體的相同位置同時切開兩個方向相同的一條單鏈；3.切開的單鏈交換重接;4.形成交聯(lián)橋結構；5.分支遷移：形成一大段異源雙鏈DNA(Holliday結構)6.繞交聯(lián)橋旋轉1800，形成Holliday異構體；7.切開與重接：左右切，形成非重組體上下切，形成重組體。12345

67旋轉1800

無論Holliday結構斷裂是否導致旁側遺傳標記的重組，它們都含有一個異源雙鏈區(qū)。1214支持Holliday遺傳重組模型的證據(jù)：

1、形態(tài)學上，Holliday中間體(Chi結構)的電鏡照片；兩個環(huán)狀DNA分子配對、斷裂、重接形成“8”字型結構中間物，根據(jù)切割的位置不同，可分別形成兩個親本環(huán)、大的單體環(huán)或者是滾環(huán)結構，也可以形成“χ”結構。Holliday模型同樣適用于環(huán)狀DNA間的重組支持Holliday遺傳重組模型的證據(jù)：

1、形態(tài)學上，Holliday中間體(Chi結構)的電鏡照片；2、異源雙鏈形成時，產(chǎn)生堿基錯配導致與重組相關聯(lián)的基因轉變的發(fā)生；1、異常分離與基因轉變粗糙脈孢菌：

pdxp：酸度敏感的VB6依賴型pdx：酸度不敏感的VB6依賴型(三)、基因轉變及其分子機理AaAaAAaaAAaaAAAAaaaa減數(shù)分裂I減數(shù)分裂II有絲分裂第一次分裂分離(MI)模式AAAAaaaaaaaa

AAAA20AaaA減數(shù)分裂I減數(shù)分裂II有絲分裂第二次分裂分離(MII)模式AaAaAaaAAAaAaaaAAAaaAAaaaaAAa

aAAaaAAAAaa

AAaaaaAA＋－＋－－＋－＋＋－－＋－＋＋－AAAAaaaaaaaa

AAAA＋＋－－－－＋＋MIMII211、異常分離與基因轉變粗糙脈孢菌：

pdxp：酸度敏感的VB6依賴型pdx：酸度不敏感的VB6依賴型(三)、基因轉變及其分子機理

+pdxp

×

pdx+孢子對子囊①②③④1

+pdxppdx+

++pdx+2

++pdx+

+pdxp

+pdxp3+pdxp

++pdx+

++4pdx+

+pdxppdx+pdx+585個子囊中?-

+-

++++

--

+-

++++

--

+-

++++

--

+-

++++

----

++++

--

+--+++

--

+-

++-+

-基因轉變(geneconversion)：一個基因轉變?yōu)樗牡任换虻倪z傳學現(xiàn)象（源于基因內重組）。26糞生糞殼菌(Olive):g+×g-+-+++++-6:2(或2:6)+-++++--5:3(或3:5)+-+++---3:1:1:3+++-++?-+??-半染色單體轉變染色單體轉變120/200000100/20000016/20000027(1).染色單體轉變:(chromatidconversion)6:2/2:6分離(2).半染色單體轉變:

(half-chromatidconversion)5:3/3:53:1:1:3①在5：3和6：2分離的子囊中，約有30%也在g基因兩側發(fā)生重組；②發(fā)生基因轉變的子囊中，基因轉變和遺傳重組都發(fā)生于同樣的兩個染色單體上的子囊的比例高達90%；2、基因轉變的分子機制基因轉變的實質：重組過程中留下的局部異源雙鏈區(qū)，在細胞內的修復系統(tǒng)識別下不同的修復產(chǎn)生的結果；Holliday模型中，由于重組而產(chǎn)生的異源雙鏈區(qū)存在不配對堿基，可被細胞內的修復系統(tǒng)能夠識別并以一條鏈為模板進行切除修復：(1).兩個雜種分子均未得到校正，有絲分裂后分離形成4:4或3:1:1:3的異常孢子分離比，屬于半染色單體轉變；(2).一個雜種分子得到校正，另一條未校正，有絲分裂后分離形成5:3或3:5的分離比，屬于半染色單體轉變；(3).兩個雜種分子都被校正到同一種類型，有絲分裂后分離形成6:2或2:6的分離比，屬于染色單體轉變；(4).兩個雜種分子都被校正到不同類型，有絲分裂后分離形成4:4分離比，未出現(xiàn)基因轉變；Holliday模型中為對稱的雜合雙鏈，而實際情況有不均等分離現(xiàn)象，1975年Meselson-Radding提出模型解釋這種不對稱重組現(xiàn)象；(四)、同源重組的Meselson–Radding模型＞＞+/++/g+/g

g/g++++g+gg++g+++

gg修復校正：若一個雜種分子被校正為野生型(突變型)，另一個未被校正+++g++gg+++++ggg三型子囊四型子囊Meselson-Radding模型困難35負干涉：兩個鄰近基因，或者是同一基因不同突變點間，雙交換的頻率比預期高，并發(fā)系數(shù)C>1，即一個區(qū)域的交換引起鄰近區(qū)域交換的增加；局部負干涉：有些噬菌體、細菌或真菌的某些局部位點明顯的出現(xiàn)負干涉的現(xiàn)象；(五)基因轉變與高度負干涉基因轉變時的高度負干涉：伴隨重組的基因轉換常常能模仿雙交換的結果，仿佛是一次交換增加了附近基因交換的幾率；共轉變：子囊中幾個相近位點同時發(fā)生轉換的現(xiàn)象；m1+m1+m1+m1+m1+++m1++m2+m2+m2m1++m2+m2+m2+m2+m2未轉變單轉變共轉變共轉變極化子：距離單鏈斷裂點的位置越近越容易發(fā)生基因轉變，越遠越不易發(fā)生轉變，由此基因轉變頻率由高到低形成一個梯度，染色體上呈現(xiàn)基因轉變極化現(xiàn)象的區(qū)域稱為極化子；m3m2m1m4m5轉變頻率單鏈斷裂點(一)、細菌同源重組的特點①發(fā)生在環(huán)狀雙鏈DNA分子與一個雙鏈或單鏈DNA分子之間；轉化：單鏈×雙鏈接合：雙鏈×雙鏈轉導：雙鏈×雙鏈三、細菌的同源重組②存在8個堿基組成的重組熱點(Chi位點)[E.coli5-10Kb]：

chi位點

5'GCTGGTGG3'

3'CGACCACC5'③需要幾種重要的蛋白質：RecBCD復合體：具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性，在Chi位點產(chǎn)生單鏈3'游離未端；

RecA：促進DNA單鏈的同化，即促進單鏈與同源雙鏈分子發(fā)生鏈的交換；

RuvAB復合體：促進分支遷移；RuvC：核酸內切酶，切開重組中間體(Holliday連接體)；(二)、細菌同源重組的機制---接合和轉導(雙鏈和雙鏈)411).RecA蛋白與單鏈DNA結合，形成螺旋狀纖絲；2).螺旋狀纖絲與同源雙鏈DNA結合；3).螺旋狀纖絲中的單鏈(入侵單鏈)與雙鏈中的互補鏈配對，同源鏈被置換出來；RecA蛋白介導的DNA鏈交換模型游離的3'單鏈末端單鏈侵入并置換形成Holliday連接體RuvAB復合物結合于Holliday連接體RuvC蛋白切開Holliday連接體置換延伸(recA)

內切酶(recBCD)DNA侵擾(recA)

內切酶(recBCD)

DNA連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′5′5′3′3′5′3′5′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′47分支遷移(RuvAB)5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內切酶(RuvC)內切酶(RuvC)DNA連接酶DNA連接酶上下切左右切48實質：單鏈DNA片段與雙鏈環(huán)狀DNA之間的重組(三)、細菌的重組機制--轉化(單鏈和雙鏈)①切除外源DNA——無重組②切除受體DNA——發(fā)生重組③無修復作用——子代細胞出現(xiàn)兩種基因型（受體基因型和重組體基因型）通常采用有利于重組體基因型生長的選擇條件(四)、細菌修復系統(tǒng)對異源雙鏈區(qū)的校正：高效率標記(high-efficiencymaker)：在轉化中，有些遺傳標記或是很少發(fā)生校正作用，或是校正切除幾乎總是在受體DNA上，因此轉化頻率較高，這類遺傳標記稱為~。低效率標記(low-efficiencymaker)：轉化中一些標記的校正切除總是傾向于發(fā)生在供體單鏈上，因而出現(xiàn)很低的轉化頻率，這類標記稱為~。(一)、λ噬菌體的整合和切除1、整合和切除的分子基礎O:15bp(核心)；富含A-TP:-160bp~0P':0~80bp

λ噬菌體attP(POP')

O:15bp(核心)；富含A-TB:-11bp~0B':0~11bp

大腸桿菌attB(BOB')

共240bp共23bp參與的酶：整合酶(Int)、整合宿主因子(IHF)和切除酶四、λ噬菌體與E.coli的重組－140－120－100－80－60－40－20＋20＋40＋60