完善血友病的基因診斷體系

完善血友病的基因診斷體系FVIII(Xq28)FIX(Xq27)qp染色體X血友病A、B血友病替代治療疾病傳播，費(fèi)用昂貴基因治療沒(méi)有突破攜帶者及產(chǎn)前檢查杜絕患兒出生、根治疾病血友病A為例說(shuō)明

基因診斷的臨床應(yīng)用血友病攜帶者和產(chǎn)前診斷流程PCR擴(kuò)增外周血DNA抽提（攜帶者）直接核酸測(cè)序間接聯(lián)鎖分析明確診斷長(zhǎng)鏈PCR檢測(cè)內(nèi)含子1,22倒位血友病A①、②、③羊水DNA抽提（胎兒）①③②FVIII(Xq28)FIX(Xq27)qpX染色體血友病A、B內(nèi)含子22倒位結(jié)果（1）

內(nèi)含子22倒位檢測(cè)結(jié)果內(nèi)含子1倒位機(jī)制內(nèi)含子1倒位檢測(cè)方法2Kb1.5Kb2Kb1.5Kb間接基因診斷血友病A第一代標(biāo)志

(參照國(guó)外）F8基因內(nèi)的BclⅠRFLPF8基因內(nèi)兩個(gè)STR位點(diǎn)F8基因外的St14VNTR

家系15BclIRFLP位點(diǎn)多態(tài)性連鎖分析家系13st14位點(diǎn)VNTR多態(tài)的基因連鎖分析內(nèi)含子13中STR多態(tài)位點(diǎn)用于家系12基因連鎖分析147/147/147145/147149/147/149147/149145/147147/國(guó)外：4個(gè)位點(diǎn)2個(gè)STR（CA13、CA22），2個(gè)SNPs（BcII、HindⅢ）診斷率約為80％(Hemophilia.Chapman&Hall,London,63-74)中國(guó)人：用上述4個(gè)位點(diǎn)信息量?jī)H為27%(ClinChemLabMed2001;39(12):1204－1208)間接診斷——血友病A新位點(diǎn)的探索6個(gè)與F8緊密連鎖的STR位點(diǎn)：

DXS15、DXS9901、G6PD、DXS1073和DXS1108距F81.5Mb內(nèi)1個(gè)F8內(nèi)的STR位點(diǎn)(F8Civs13)性別位點(diǎn)為牙釉蛋白基因（Amelogeningene）終產(chǎn)物X染色體102bp，Y染色體108bp第二代標(biāo)志（自主開發(fā)）遺傳連鎖分析的多態(tài)性位點(diǎn)的相對(duì)位置F8F8Civs13DXS1073G6PDDXS9901DXS15DXS1108ST14CA22

所用STR位點(diǎn)在正常人群中檢測(cè)的結(jié)果STR位點(diǎn)片段長(zhǎng)度(bp)不同等位基因的數(shù)目等位基因頻率(%)期望雜合度(%)觀察雜合度(%)DXS15145~164100.59~37.8774.9788.24(45/51)DXS9901186~214120.59~37.8779.7782.35(42/51)G6PD168~18860.59~52.0756.0621.57(11/51)DXS1073120~13890.59~49.1159.9262.75(32/51)DXS110876~9640.59~73.3739.9735.29(18/51)F8Civs13152~16860.59~69.8247.6152.94(27/51)第三代標(biāo)志（自主開發(fā)）對(duì)象：69名正常女性、31個(gè)HA家系（120名成員）方法：人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇了位于F8基因兩端0.5CM內(nèi)的3個(gè)STR位點(diǎn)（5_226、5_147及3_486），F(xiàn)8基因內(nèi)的1個(gè)STR位點(diǎn)（INTRON25）及距離F8基因2CM內(nèi)的DXS8069位點(diǎn)，以多重?zé)晒釶CR法檢測(cè)5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性F8CA22DXS1073G6PDDXS9901DXS15DXS1108ST14F8Civs13F8Intron25DXS10735-226F8Civs133-4865-147DXS8069Marker雜合度多態(tài)性單獨(dú)可診斷率5_22672.46%1280.65%5_14749.27%654.84%DXS806972.46%664.52%3_48649.27%658.06%INTRON2531.88%341.94%聯(lián)合5個(gè)STR位點(diǎn)可對(duì)所有要求做攜帶者及產(chǎn)前診斷的血友病A家系提供遺傳連鎖分析結(jié)果且與F8基因直接檢測(cè)結(jié)果相符

結(jié)果與討論7重?zé)晒釶CR技術(shù)降低重組發(fā)生率未見(jiàn)漏診和誤診診斷率和準(zhǔn)確率100％F8Intron25DXS10735-226F8Civs133-4865-147DXS8069特殊血友病A家系的基因診斷

先證者自幼皮膚、頭顱撞傷后及拔牙及手術(shù)后有出血難止，曾發(fā)生過(guò)顱內(nèi)出血BT、PT正常APTT延長(zhǎng)，F(xiàn)VIII:C2%輸注全血或抗血友病球蛋白治療有效先證者已故家系1家系2FⅧ:C2%直接基因測(cè)序結(jié)果：攜帶者外周血DNA直接測(cè)序未檢測(cè)出突變?cè)颍簱?jù)文獻(xiàn)報(bào)道FVIII直接基因測(cè)序有1%-10%的患者查不到基因突變（HumMutat.2002Oct;20(4):267-74）存在大的缺失?

內(nèi)含子突變？

攜帶者診斷結(jié)果攜帶者及待檢者F8內(nèi)含子22,1倒位均為陰性

2Kb1.5Kb2Kb1.5Kb間接診斷結(jié)果

BclI酶切圖

III-1表姐：

-/-II-2舅媽：-/-II-3母親：+/-II-4父親：+/+III-2待檢者：+/+

MBclI酶切圖測(cè)序圖BclI酶切識(shí)別位點(diǎn)T/GATCA圖a待檢者測(cè)序圖，含BclI酶切位點(diǎn)圖b表姐測(cè)序圖，不含BclI酶切位點(diǎn)ab間接診斷結(jié)果

ca13基因掃描III-1表姐：144/144III-2待檢者：142/142II-3母親：142/144II-2舅媽：140/144II-4父親：142/-間接診斷結(jié)果

ca22基因掃描III-1表姐：79/79III-2待檢者：79/83II-3母親：83/79II-2舅媽：79/79II-4父親：79/-血友病A攜帶者間接診斷結(jié)果分析表姐舅媽父親母親待檢者綜合A13、CA22及BclI信息，待檢者與其表姐有不同的X染色體舅舅女性血友病A的基因及產(chǎn)前診斷標(biāo)本來(lái)源

先證者（II-1），女，21歲，漢族，自幼有踝關(guān)節(jié)及膝關(guān)節(jié)有自發(fā)出血，臨床診斷為血友病A，冷沉淀及濃縮FVIII輸注有效，因懷孕要求作基因診斷及產(chǎn)前診斷？？APTTsPTsTTsFgg/LvWF%FVIII：C%I-128.911.317.73.3141121I-227.21018.62.4124118II-175.212.117.72.11212.1II-23911.518.82.8142107II-340.112.520.651.9164119基因檢測(cè)結(jié)果

F8內(nèi)含子22倒位F8內(nèi)含子1倒位先證者陽(yáng)性（攜帶者）陰性胎兒陰性陰性其他人陰性陰性先證者F8基因所有外顯子及其側(cè)翼序列擴(kuò)增測(cè)序（-）遺傳連鎖分析319218150282340172374323212150282346172365319218150282340172374325220150280340172374325220150280340172374319218150282340172374325220150280340172374323212150282346172365325220150280340172374HA患者正常男性胎兒正常女性先證者圖2家系多態(tài)性位點(diǎn)遺傳連鎖分析圖IIIIII1212341325212130280340172374325212130280340172374發(fā)病機(jī)制

先證者來(lái)自母系的X染色體大部分被滅活，而來(lái)自父系的X染色體保留活性家系其他成員及胎兒為X染色體隨機(jī)滅活

家系成員HpaII酶切前HpaII酶切后SizeHeightSizeHeight父I-131074483104083母I-2298/3041502/1183298/304285/135先證者II-1304/3102543/2424304/3101233/49妹II-2298/3106054/5233298/3103208/2166弟II-33047122304917胎兒III-1307/3106475/6024307/3101337/2163發(fā)病機(jī)制

先證者一條X染色體發(fā)生了F8基因內(nèi)含子22倒位，而未檢測(cè)到其它F8基因相關(guān)突變遺傳連鎖分析發(fā)現(xiàn)該女性患者的兩條X染色體分別遺傳自其父母，排除其為單親二倍體先證者的X染色體滅活呈非隨機(jī)性滅活，其遺傳自父親的X染色體大部分保留了活性女性血友病A(2)

女性血友?。?FVIII:C3.4%,FVIII:Ag4.2%Leu1975Pro

和3637-3638insA父親：(FVIII:C6.9%,FVIII:Ag7.4%),Leu1975PromutationJThrombosisandhaemostasis20063637-3638insA突變是如何產(chǎn)生的?母親外周血DNA的F8沒(méi)有檢測(cè)到基因突變母親不同組織DNAF8基因檢測(cè)也沒(méi)有檢測(cè)到突變，不是體細(xì)胞的嵌和體患者3637-3638insA自發(fā)突變（denovo）框移突變(3637-3638insA)定量

RT-PCR顯示：患者的FVIIImRNA減少結(jié)論：女性血友病A患者是其F8基因中來(lái)自父親的Leu1975Pro突變和自發(fā)突變

3637-3638insA，雙重雜合突變導(dǎo)致的一個(gè)血友病家系，父親為血友病A，兒子為血友病B同時(shí)存在HA和HB患者家系的基因診斷HAHBFVIII(Xq28)FIX(Xq27)qp染色體X血友病A、B＋ResultofphynotypedetectionFamilymember

APTT（s）PT（s）TT（s）Fg（g/L）FⅧ:C（%）FⅨ:C（%）I-337.312.316.82.8149.0104.7I-442.514.017.04.3128.094.4II-139.512.116.42.5154.078.3II-340.612.517.02.5145.068.4II-688.012.215.33.20.398.3II-739.912.519.82.198.082.2II-836.611.616.32.8139.098.1III-790.012.016.22.375.81.9Referencerange

35±1013±317±32.0-4.050-15050-150基因診斷結(jié)果

F8INV22：父親（＋）其他成員（－）

F8INV1：所有成員（－）F9測(cè)序:兒子mutation(32772A→T，Ser365Cys),

母親同位置雜合子阿姨、外公（－）父親（－）

Resultoflinkageanalysis

399340208166313365399340208166313365399340208166313365399340208166313365389336210164313358395350212180313358395350212180313358395350212180313358ⅠⅡⅢ346789

107？？＋：FIX基因缺陷＋＋__外周血細(xì)胞、組織細(xì)胞外公體細(xì)胞、生殖細(xì)胞嵌合體外公

阿姨Peripheralbloodbuccalcavitycells

Enqomphesisrate:14.1%嵌合體檢測(cè)

凝血因子V和VIII聯(lián)合缺陷；常染色體隱性遺傳性疾病；發(fā)病率為1/100萬(wàn)，男女均可發(fā)病致病基因并非F5，F(xiàn)8基因，而是與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)受體的編碼基因突變導(dǎo)致：LMAN1（70%），MCFD2（30%）分子發(fā)病機(jī)制研究

F5F8D家系基因診斷F5F8D家系基因診斷(1)先證者1：10歲女孩，口腔粘膜反復(fù)出血患者母親懷孕要求做產(chǎn)前診斷F5F8D家系基因診斷(2)先證者2：50歲女性，貧血，凝血功能不佳，長(zhǎng)期痔瘡出血先證者3：47歲女性，凝血功能不佳F5F8D家系基因診斷(4)先證者4：50歲男性，平時(shí)無(wú)明顯的凝血功能異常現(xiàn)象，因痔瘡出血難止于術(shù)前進(jìn)行凝血功能篩查先證者APTTsPTsFV:C%FVIII:C%182.219.69.124.2271.622.17.625374.618.314.519.6470.318.29.415.7F5F8D家系實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果F5F8D家系基因檢測(cè)結(jié)果先證者1：LMAN1：Exon8nt925-933insA305frameshift編碼20個(gè)氨基酸后終止LMAN1：Exon11nt1387C>CT(X71661.1)456Arg>Stop母親父親產(chǎn)前診斷：胎兒為女性，且攜帶了來(lái)自父親的突變先證者2、3：MCFD2：Exon4nt501T>C，導(dǎo)致第136位氨基酸錯(cuò)義突變，13