醫(yī)學分子生物學實驗技術教材

醫(yī)學分子生物學6/24/20241第一章蛋白質的分離純化生命大分子物質的特點：1、生命大分子是動物、植物和微生物在進行新陳代謝時所產生的活性物質2、生命大分子的特殊性和復雜性3、生命大分子都是由簡單的小分子構成的物4、具有特殊的結構和功能5、生命大分子不穩(wěn)定6/24/20242材料的選擇與處理材料的選擇有效成分：欲純化的某種單一的生命大分子物質。相對于有效成分以外的物質稱雜質。材料來源動物植物根、莖、葉微生物組織、器官血液、分泌物6/24/20243選材原則：①含有效成分豐富、穩(wěn)定性好；②來源豐富、保持新鮮；③材料適合加工提??；④具有經濟利用價值。組織差異性時間差異性生理狀態(tài)差異性研究對象的選擇6/24/20244蛋白質在組織或細胞中一般都是以復雜的混合形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質。蛋白質的分離(separation，isolation)和純化(purification)工作是生物化學中一項艱巨而繁重的任務。6/24/20245蛋白質純化的總目標是增加制品的純度(purity)或比活(specificactivity)，以增加單位蛋白質重量中所要蛋白質的含量或生物活性(比活常以活力單位數／毫克蛋白質表示)。分離純化某一特定蛋白質的一般程序可以分為前處理、粗分級分離和細分級分離3步6/24/20246(1)前處理(pretreatment)

分離純化某一蛋白質，首先要求把蛋白質從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟失生物活性。動物材料應先剔除結締組織和脂肪組織。6/24/20247種子材料應先去殼甚至去種皮以免受雜質的污染，油料種子最好先用低沸點的有機溶劑如乙醚等脫脂。然后根據不同的情況，選擇適當的方法，將組織和細胞破碎。6/24/20248機械破碎法搗碎法研磨法勻漿法物理破碎法溫度差破碎法壓力差破碎法超聲破碎法化學破碎法利用化學滲透的方法，通過有機溶劑、抗生素、表面活性劑、金屬熬合劑、變性劑等，使細胞膜破碎的方法。酶促破碎法利用酶的活性破壞細胞膜的化學結構使細胞膜破碎的方法。6/24/20249如果所要的蛋白質主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性的細胞質等，則可利用差速離心方法將它們分開在不同離心力場下沉降的細胞器6/24/202410如果碰上所要蛋白質是與細胞膜或膜質細胞器結合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結構解聚，然后用適當的介質提取。6/24/202411(2)粗分級分離(roughfractionation)

當蛋白質提取液(有時還雜有核酸、多糖之類)獲得后，選用一套適當的方法，將所要的蛋白質與其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分級分離用鹽析、等電點沉淀和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大，既能除去大量雜質(包括脫鹽)，又能濃縮蛋白質溶液。有些蛋白質提取液體積較大，又不適于用沉淀或鹽析法濃縮，則可采用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空干燥或其他方法(如聚乙二醇濃縮法)進行濃縮。6/24/202412(3)細分級分離(finefractionation)

進一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾，離子交換層析，吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，包括區(qū)帶電泳、等電聚焦等作為最后的純化步驟。用于細分級分離的方法一般規(guī)模較小，但分辨率很高。

6/24/202413(4)結晶

結晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，蛋白質純度愈高，溶液愈濃就愈容易結晶。盡管結晶并不能保證蛋白質一定是均一的，但只有某種蛋白質在溶液中數量上占優(yōu)勢時才能形成結晶。由于結晶中從未發(fā)現過變性蛋白質，因此蛋白質的結晶不僅是純度的一個標志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。結晶也是進行X射線晶體學分析所要求的，結晶的最佳條件是使溶液略處于過飽和狀態(tài)，此時較易得到結晶。接入晶種常能加速結晶過程。

6/24/202414第二節(jié)確立測定方法尋找哪些生物材料中含有有效成分監(jiān)測有效成分提純程度光譜法吸收光譜熒光光譜濁度分析電化學法生物活性檢測法免疫分析法6/24/202415吸收光譜根據有效成分的顏色、對紫外吸收能力進行測定；利用有效成分與生色基團所進行的特殊的呈色反應進行測定。熒光法：利用有效成分所進行的特殊的化學反應并偶聯NAD＋或NADP＋的還原反應產生NADH或NADPH。還原型尼克酰胺發(fā)熒光。也可利用NAD和NADP的光譜變化進行測定6/24/2024166/24/202417比色法葡萄糖＋O2

＋H2O葡萄糖酸＋H2O2葡萄糖氧化酶H2O2＋酚＋4－AAP醌亞胺＋H2O濁度法：測定懸浮液在不被吸收的波長下表觀的消光值。電化學法：測定反應過程中H＋的濃度變化從而計算出有效成分含量。生物活性檢測免疫分析法6/24/202418純化方案的設計與評價純化方案：在純化某一物質過程中，根據被分離物質的理化性質、分離方法的優(yōu)劣，將幾種分離方法有機地結合并靈活應用，實現提取被分離物質的技術路線，稱純化方案。6/24/202419初分離精細分離鹽析法有機溶劑沉淀法電泳法層析法離心法離子交換層析排阻層析親和層析純化方案的設計與評價6/24/202420純化方案的設計與評價純化方案的評價：是對組成純化方案的每一種分離方法的評價。有效成分的含量測定比活力測定()活力單位數毫克蛋白純化倍數()每步的比活力粗提液比活力收得率(×100％)每步的總活力粗提液總活力評價指標6/24/202421蛋白質純度和性質的分析純度分析性質分析比活性電泳分析高壓液相或氣相色譜免疫分析分子質量測定分子結構測定6/24/202422幾種常用的蛋白質純化方法：根據蛋白質在溶液中的性質分離純化蛋白質的方法：①分子大小；②溶解度；③電荷；④吸附性質；⑤對配體分子的生物學親和力等。

6/24/202423根據分子大小不同的純化方法

1．透析和超過濾透析(dialysis)是利用蛋白質分子不能通過半透膜的性質，使蛋白質和其他小分子物質如無機鹽、單糖等分開。常用的半透膜是玻璃紙和其他改型的纖維素材料。6/24/202424超濾是利用壓力或離心力，強行使水和其他小分子溶質通過半透膜，而蛋白質被截留在膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的。6/24/2024252．密度梯度(區(qū)帶)離心

蛋白質顆粒在具有密度梯度的介質中離心時，質量和密度大的顆粒比質量和密度小的顆粒沉降得快，并且每種蛋白質顆粒沉降到與自身密度相等的介質密度梯度時，即停止不前，最后各種蛋白質在離心管中被分離成獨立的區(qū)帶，

6/24/202426密度梯度常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度。蔗糖便宜，純度高，濃溶液(60％，W／W)密度可達1.28g／cm3。聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1—氯—2，3—環(huán)氧丙烷合成的高聚物，Mr約400000。密度梯度在離心管內的分布是管底的密度最大，向上逐漸減小

6/24/202427凝膠過濾層析(分子排阻

)（1）凝膠過濾的介質

凝膠過濾所用的介質是凝膠顆粒，其內部是多孔的網狀結構，

6/24/202428二、利用溶解度差別的純化方法

影響蛋白質溶解度的外部因素很多，其中主要有：①溶液的pH，②離子強度，③介電常數，④溫度。自身因素：在同一的外部條件下，不同蛋白質具有不同的溶解度，這是因為溶解度歸根結底取決于它們本身的分子結構，例如分子所帶電荷的性質和數量、親水基團與疏水基團的比例，它們在蛋白質分子表面的排列以及由此而產生的偶極矩等。

6/24/2024291.pH控制蛋白質的沉淀蛋白質處于等電點時，其靜電荷為零，由于相鄰蛋白質分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀。不同的蛋白質具有不同的等電點，利用蛋白質在等電點時溶解度最低的原理，可以把蛋白質混合物分開。

6/24/2024302.蛋白質的鹽溶和鹽析

鹽溶：低濃度時，中性鹽可以增加蛋白質的溶解度，這種現象稱為鹽溶。由于蛋白質分子吸附某種鹽類離子后，帶電層使蛋白質分子彼此排斥，而蛋白質分子與水分子間的相互作用卻加強，因而溶解度增高鹽溶6/24/202431鹽析：當溶液的離子強度增加到一定數值時，蛋白質溶解度開始下降。當離子強度增加到足夠高時，例如飽和或半飽和的程度，很多蛋白質可以從水溶液中沉淀出來，這種現象稱為鹽析（saltingout）。大量中性鹽的加入使水的活度降低，原來溶液中的大部分甚至全部的自由水轉變?yōu)辂}離子的水化水。導致蛋白質表面的疏水基團的暴露鹽析（（NH4）2SO4）6/24/2024323．有機溶劑分級分離法

與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白質在水中的溶解度顯著降低。在室溫下，這些有機溶劑不僅能引起蛋白質沉淀，而且伴隨著變性。6/24/2024333．有機溶劑分級分離的機理有機溶劑引起蛋白質沉淀的主要原因之一是改變了介質的介電常數。水是高介電常數物質(20℃時，80)，有機溶劑是低介電常數物質(20℃時，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)，因此有機溶劑的加入使水溶液的介電常數降低。這樣，蛋白質分子表面可解離基團的離子化程度減弱，水化程度降低，因此促進了蛋白質分子的聚集和沉淀。有機溶劑引起蛋白質沉淀的另一重要方式可能與鹽析相似，與蛋白質直接爭奪水化水，致使蛋白質聚集而沉淀。

6/24/2024344．溫度對蛋白質溶解度的影響

在一定溫度范圍內，約0～40℃之間，大部分球狀蛋白質的溶解度隨溫度升高而增加，

在40～50℃以上，大部分蛋白質變得不穩(wěn)定并開始變性，一般在中性pH介質中即失去溶解能力。大多數蛋白質在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質的分級分離操作一般都在0℃或更低的溫度下進行。

6/24/202435電泳

是指帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動的現象

正極負極帶負電粒子帶正電粒子蛋白質的電泳分離6/24/202436++++++++--------++++++++--------蛋白質膠體顆粒的沉淀

帶正電荷的蛋白質帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質酸酸堿堿脫水脫水脫水不穩(wěn)定的蛋白質顆粒（沉淀）帶正電荷的蛋白質（疏水膠體）帶負電荷的蛋白質（疏水膠體）堿酸（親水膠體）（親水膠體）（親水膠體）6/24/202437

帶電顆粒在電場中所受到的電場力F=EQ

根據Stoke定律，球形分子在液體中泳動所受到的阻力F’=6πrηv電泳原理：6/24/202438F=F’即：EQ=6πrηv時，V=EQ6πrη當物質在電場中移動時，受到電場力和液體阻力兩方面的力的影響，當電場力和阻力平衡時，帶電顆粒作勻速運動，6/24/202439兩個帶電顆粒能否分開，由兩個顆粒在電泳過程中的遷移率所決定，即U=dlVt或d=UVtldU==VEtVl=dlVt或d1-d2=(U1-U2)VtlΔd=6/24/202440遷移率（或泳動度）是指帶電顆粒在單位電場強度下泳動的速度，可用下列公式計算：

Ｕ=υ/E=(d/t)/(V/l)=dl/Vt

Ｕ為遷移率（cm2·V-1·min-1）；υ為顆粒泳動速度（cm·s-1）；E為電場強度（V·cm-1）；d為顆粒泳動的距離（cm）；l為濾紙有效長度（cm）；V為實際電壓（V）；t為通電時間（s或min）。通過測量d,l,V,t,即可計算出被分離物質的遷移率。

6/24/202441影響電泳的因素1、帶電粒子的性質與電泳行為2、電場強度對帶電粒子遷移的影響：電場強度也稱電位梯度，是指單位長度（每一厘米）支持物體上的電位降，它對泳動速度起著十分重要的作用。一般，電場強度越高，帶電顆粒移動速度越快。6/24/2024423、溶液的pH對帶電粒子遷移的影響：溶液的pH值決定了帶電顆粒解離的程度，也決定了物質所帶凈電荷的多少。4、電滲對電泳的影響：電滲是在電場中液體對固體的相對移動。6/24/202443電滲作用6/24/2024445、離子強度對電泳的影響：電泳液中的離子增加會使電泳遷移率降低，原因是帶電的離子會吸引相反符號的離子聚集在其周圍，形成一個與運動粒子符號相反的離子氛，它使該離子向相反的方向運動，從而降低了該粒子的遷移率。6/24/2024456、溫度對的電泳的影響：電泳過程中由于通電產生焦耳熱，熱對電泳有很大的影響。溫度每升高1℃，遷移率約增加2.4%。為降低熱效應對電泳的影響，可控制電壓或電流，或在電泳系統中安裝冷卻散熱裝置。6/24/202446

電泳的分類和特點電泳的分類自由移動界面電泳區(qū)帶電泳穩(wěn)態(tài)電泳6/24/202447自由移動界面電泳（movingboundaryelectrophoresis），沒有支持物，在一個U形管中進行電泳，目前已被區(qū)帶電泳所取代。區(qū)帶電泳（zoneelectrophoresis）在一定的支持物上進行的電泳，電泳結果形成一條條的區(qū)帶而得名。穩(wěn)態(tài)電泳（steadystateelectrophoresis）帶電顆粒電泳一定時間后達到穩(wěn)態(tài)而停止移動。6/24/2024486/24/202449根據電荷不同的純化方法

根據蛋白質的電荷不同即酸堿性質不同分離蛋白質混合物的方法有電泳和離子交換層析兩類。

1.電泳(electrophoresis)在外電場的作用下，帶電顆粒，向著與其電性相反的電極移動，這種現象稱為電泳。

蛋白質電泳分離原理：分子大小不同的蛋白質所帶電種類不同，凈電荷密度不同，遷移率不同，因此，在電泳時可以分開。6/24/202450電泳的類型目前電泳的類型很多，最常見的是區(qū)帶電泳，由于在支持物上電泳時蛋白質混合物被分離成若干區(qū)帶而得名。6/24/202451區(qū)帶電泳按其支持物的物理性狀不同可以分成4類：①濾紙電泳和薄膜電泳(如醋酸纖維薄膜電泳和聚酰胺薄膜電泳)；②粉末電泳，支持介質是淀粉、纖維素粉或硅膠粉等，粉末與適當的溶劑調和，鋪設成平板；6/24/202452③細絲電泳，如尼龍絲和其他人造絲電泳，這是一類微量電泳；④凝膠電泳，最常用的支持介質有聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠，前者適于分離蛋白質和多核苷酸，后者適于分離核酸，這兩種凝膠電泳的分辨率都很高，

-++—6/24/2024536/24/202454雙向電泳(two-dimensionalelectrophoresis)6/24/2024552.聚丙烯酰胺凝膠電泳

(polyacrylamindegelelectrophoresis，簡稱PAGE)也稱圓盤電泳，它是在區(qū)帶電泳的基礎上發(fā)展起來的。它以聚丙烯酰胺凝膠為支持物,一般制作成凝膠柱或凝膠板，6/24/202456按其凝膠的組成系統可分成四種：(1)連續(xù)凝膠電泳：只用一層凝膠，采用相同的pH值和相同的緩沖液。(2)不連續(xù)凝膠電泳：采用二層或三層性質不同的凝膠(即：樣品膠、濃縮膠和分離膠)重疊起來，使用兩種不同的pH值（6.7和8.3）和不同的緩沖液（Tris-HCl和Tris-Gly）(3)梯度凝膠電泳：采用梯度混合裝置，使制得的凝膠由上至下孔徑逐漸減小(即凝膠濃度由上至下逐漸增高)。梯度凝膠電泳主要適宜于測定球蛋白的相對分子質量。(4)SDS—凝膠電泳：在聚丙烯酰胺凝膠中加入SDS(十二烷基硫酸鈉)6/24/2024574．等電聚焦

(isoelectricfocusing，IEF)

等電聚焦是60年代建立的一種高分辨率的蛋白質分離和分析技術。它是利用蛋白質分子或其他兩性電解質分子具有不同的等電點，從而在一個穩(wěn)定、連續(xù)、線性的pH梯度中得到分離。

近年來，等電聚焦電泳技術的分辨率有了很大提高，可以分辨pI只差0.001的生物大分子，這是等電聚焦最突出的優(yōu)點，6/24/202458凝膠聚合的原理及有關特性

1．聚合反應

凝膠的聚合單體:丙烯酰胺(Acr)和交聯劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)；常用過硫酸銨(AP)為催化劑，四甲基乙二胺(TEMED)為加速劑。TEMED的堿基可催化AP水溶液產生游離氧原子，激活Acr單體，使其聚合成單體長鏈，在Bis作用下，聚合成網狀凝膠。堿性條件下凝膠易聚合，室溫下7.5％的凝膠在pH8.8時30min聚合，在pH4.3時約需90min。

此外，核黃素亦可為催化劑，聚合需光照，故使用不多。6/24/202459丙烯酰胺凝膠聚合原理

6/24/2024606/24/202461凝膠濃度與被分離物相對分子質量的關系6/24/202462PAGE原理

PAGE根據其有無濃縮效應，分為連續(xù)系統：電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩效應；不連續(xù)系統：由電極緩沖液、樣品膠、濃縮膠及分離膠組成，兩層玻璃板中排列順序依次為上層樣品膠、中間濃縮膠、下層分離膠。電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性。6/24/202463不連續(xù)PAGE系統：

樣品膠的T=3％，c=2％，緩沖液為pH6.7的Tris-HCl，其作用是防止對流，促使樣品濃縮以免被電極緩沖溶稀釋。目前，一般不用樣品膠，直接在樣品液中加入等體積40％蔗糖，同樣具有防止對流及樣品被稀釋的作用。

T％=(a+b)/m×l00％c％=b/(a+b)×100％式中a：Acr克數；b：Bis克數；

m：緩沖液體積(ml)。

T：Acr和Bis總濃度

c：交聯劑百分比6/24/202464

濃縮膠是樣品膠的延續(xù)，凝膠濃度及pH值與樣品膠完全相同，其作用是使樣品進入分離膠前，被濃縮成窄的區(qū)帶，從而提高分離效果。

分離膠的T=7.0％一7.5%，c=2.5％，緩沖液為pH8.9的Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷)，大部分蛋白質在此pH條件下帶負電荷。此膠主要起分子篩作用。

6/24/202465不連續(xù)PAGE電泳的3種物理效應：①樣品的濃縮效應；②凝膠對被分離分子的篩選效應(顆粒小的移動快，顆粒大的移動慢)；③一般電泳分離的電荷效應。由于這3種物理效應，使樣品分離效果好，分辨率高。人血清用紙電泳只能分成5～7個組分，而圓盤電泳則可分成幾十個清晰的條帶。

6/24/202466樣品濃縮效應(由三種不連續(xù)性造成)（1）凝膠孔徑的不連續(xù)性上述三層凝膠中，樣品膠及濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠。在電場作用下，樣品顆粒在大孔膠中泳動的阻力小，移動速度快；當進入小孔膠時，受到的阻力大，移動速度減慢。因而在兩層凝膠交界處，樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。濃縮膠分離膠6/24/202467(2)緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性

HCl在任何pH溶液中均易解離出Cl—，在電場中遷移率快，走在最前面稱為快離子。在電極緩沖液中，除有Tris外，還有甘氨酸，其pI=6.0，在pH8.9的電極緩沖液中，易解離出甘氨酸根(NH2CH2COO—)，而在pH6.7的凝膠緩沖體系中，甘氨酸解離度僅有0.1％～1％，因而在電場中遷移很慢，稱為慢離子。Tris-HClpH=6.7pH=8.9GlyCl-Gly-Tris-HCl血清中大多數蛋白質pI在5.0左右,遷移率介于快離子與慢離子之間，—+凝膠緩沖體系，Tris-Gly,pH=8.36/24/202468(3)電位梯度的不連續(xù)性電泳開始后，快離子的快速移動會在其后形成一個離子強度很低的低電導區(qū)，使局部電位梯度增高，將蛋白質濃縮成狹窄的區(qū)帶。6/24/202469分子篩效應

大小和形狀不同的蛋白質通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現出不同的遷移率，這就是分子篩效應。蛋白質進入pH8.9的同一孔徑的分離膠后，分子小且為球狀的蛋白質分子所受阻力小，移動快，走在前面；反之，則阻力大，移動慢，走在后面，從而通過凝膠的分子篩作用將各種蛋白質分成各自的區(qū)帶。

這種分子篩效應不同于柱層析中的分子篩效應，后者是大分子先從凝膠顆粒間的縫隙流出，小分子后流出。6/24/202470電荷效應

在pH8.9的分離膠中，各種帶凈電荷不同的蛋白質有不同的遷移率。凈電荷多，則遷移快；反之，則遷移慢。因此，各種蛋白質按電荷多少、相對分子質量及形狀，以一定順序排成一個個區(qū)帶，因而稱為區(qū)帶電泳。6/24/2024716/24/202472蛋白質的層析分離層析的分類分配層析吸附層析離子交換層析分子篩（凝膠過濾）層析親和層析6/24/202473層析技術的基本原理任何一種層析技術都由互不相溶的兩相組成，分別稱為固定相和流動相。被分離的物質由于其本身的物理性質或化學性質的不同，在兩相中的分配系數（溶解度）不同，經過一定的時間后，混合在一起的物質彼此實現分離。Ｋ＝＝溶質在固定相中的濃度溶質在流動相中的濃度CsCm6/24/2024746/24/2024756/24/2024766/24/202477遷移率(Rf)：層析過程中，樣品移動的相對速率或相對距離。abRf==溶質斑點中心移動的距離溶劑前沿移動的距離ab濾紙前沿原點影響Rf值的主要因素物質的結構和極性的影響：一般來說，物質分子中極性基團增加，物質的極性就隨著增加，則分配系數變大，Rf值變小。而分子中(-CH2-)增加分子極性變小，Rf值相應變大。6/24/202478常用參數：

1/2h0.607h6/24/202479如圖所示為一色譜流出曲線：6/24/202480基線：在正常的操作條件下，僅有流動相（無被分離樣品）通過檢測器時所產生的信號。層析峰：樣品從洗脫開始到樣品流出層析柱時，檢測器對層析樣品和層析時間所產生的信號。峰高：峰的最大值到峰底的距離。峰寬：層析峰半高峰時的寬。峰面積：峰與峰底間的面積。6/24/202481層析峰區(qū)域寬度半峰寬：峰高一半處的峰寬度。峰寬：峰的基線寬度，通過層析峰兩側拐點作切線交于基線上的距離。標準差：樣品組分被帶出層析柱的分散度，用σ表示。兩側拐點之間的距離為2個標準差。Wb=4σ=1.699W1/2W1/2=2.354σ6/24/202482保留值：表示樣品中各組分在層析柱中停留時間的長短或組分流出時所需流動相體積的大小。保留時間和保留體積：樣品組分通過層析柱出峰所需的時間稱保留時間；樣品組分通過層析柱出峰時所需流動相的體積稱保留體積。6/24/202483死時間或死體積：柱中未被固定相所占有的空間，如柱的接口、柱出口管路、檢測器內腔空間及柱內填充空隙等稱為死體積；流動相流經死體積所需的時間稱死時間。調整保留時間或調整保留體積：保留時間中扣除死時間后的時間；或保留體積中扣除死體積后的體積。6/24/202484分離度：指相鄰兩峰的保留時間差值是兩峰寬平均值的幾倍。因Wb=4σ，即分離度為1時，ΔtR＝4σ。兩峰有98％分離。Rs＝＝

tR2-tR1?(W1+W2)

2(tR2-tR1)

W1+W2當W1=W2，且峰面積相等時

Rs＝ΔtR/W6/24/202485柱效：層析過程是一個連續(xù)過程，流動相不斷流過，在任何一點上實際上都無法獲得平衡，當流動相通過柱的一定高度，在離開這段柱時，流動相中某組分的平均濃度與固定相中的平均濃度可以達到分配平衡，完成這一平衡所需要的柱長稱為理論塔板等效高度，簡稱板高N=L/H6/24/202486層析的主要設備6/24/2024876/24/202488自動分步收集器6/24/202489離子交換層析法離子交換層析利用物質的電荷與層析載體(離子交換劑)電荷之間的相互作用達到分離純化目的的技術。離子交換層析分離蛋白的依據是其帶電狀態(tài)，當溶液pH高于目的蛋白等電點時，蛋白帶凈負電荷，可與陰離子交換劑結合；如pH低于蛋白等電點時蛋白帶凈正電荷，與陽離子交換劑結合。6/24/202490

+6/24/202491常用離子交換纖維素的種類和特性6/24/202492離子交換層析技術的基本操作1、樣品的準備2、離子交換劑和層析柱的準備1）纖維素離子交換劑的預處理0.5mol/LNaCl

浸泡30min，蒸餾水洗至pH8.00.5mol/LHCl浸泡30min，蒸餾水洗至中性0.5mol/LNaCl

浸泡30min，蒸餾水洗至pH8.0最后用上樣緩沖液平衡6/24/2024932）葡聚糖離子交換劑的預處理Sephadex用前在上樣緩沖液中室溫浸泡一天DEAE－SephadexCL－6B使用前用1~2mol/LNaCl浸泡，然后用上樣緩沖液平衡DEAE－Sephadex是以24%乙醇中提供的，用前要用起始緩沖液充分洗滌。6/24/2024943、層析柱的準備：將層析介質均勻的裝入適當的玻璃管中組成離子交換柱。離子交換層析柱一般較短粗，高徑比一般在10:1~15:1。層析柱太高將使樣品擴散而稀釋。上樣量根據層析柱的交換容量決定，一般為交換容量的1/10。6/24/2024956/24/202496低鹽洗脫液高鹽洗脫液混合蛋白質6/24/2024974、目的蛋白的洗脫樣品上樣后，用特定的緩沖液從被離子交換劑吸附的組分從層析柱上洗脫下來，這一過程稱為洗脫。離子交換層析的洗脫有兩種方式：1)改變洗脫液的離子強度；2)改變洗脫液的pH值6/24/202498每種方式又分為階段洗脫和梯度洗脫兩種類型。階段洗脫：用一系列不同濃度的洗脫液逐次對層析柱進行洗脫的方式6/24/202499

1、階段洗脫：用幾種具有不同洗脫能力的緩沖液相繼進行活脫階段洗脫的優(yōu)點：①設備和操作簡單②洗脫迅速③洗脫液體積小這種洗脫方式適合于混合物組成簡單，目的物在層析行為上和其它有組分有顯著差別或需要快速分離時。6/24/2024100階段洗脫的缺點：①親和力相近的不同組分不易分開，而生物介質中具有相似層析特性的組分往往是很多的，很難找到使某一種組分解吸，而其它組分皆不解吸的條件。②拖尾現象：生物大分子和離子交換纖維素表面的電荷分布都是不規(guī)則的，電荷密度大，排列恰當的部位親和力大，另一些部位親和力小，所以同一個組分的不同分子所遇到的微環(huán)境有差別，吸附緊密程度不同。在一個恒定的洗脫條件下，吸附較緊密的分子落在后面形成拖尾現象。6/24/2024101

③同一個組分的多峰現象：由于同一個組分的不同分子吸附緊密程度不同，每當改換一次洗脫能力較大的洗脫液時，便出現一個峰，導致一個組分出現幾個假峰。6/24/2024102梯度洗脫：用連續(xù)濃度的溶液對層析柱進行連續(xù)洗脫的洗脫方式。6/24/2024103

2、梯度洗脫：在梯度活脫中緩沖液的洗脫能力是逐漸的連續(xù)的加強。在梯度洗脫的條件下，同種組分中那些因為吸附較緊密而落在后面的分子，會因為洗脫能力的逐步加強而趕上前面的分子，克服了階段洗脫中的拖尾現象和假峰。同時，混合物中的各個組分將逐個地進入解吸狀態(tài)，而被逐次洗脫為峰形對稱的各個清晰層析譜峰，分辨力大大超過階段洗脫。6/24/2024104連續(xù)梯度的形式及連續(xù)梯度的建立6/24/20241056/24/2024106緩沖液的選擇1、對緩沖液pH的選擇：決定于被分離物質的等電點、穩(wěn)定性和溶解度，也要根據交換纖維素解離基團的pK值。用陰離子交換纖維素時要選用低于其pK值的緩沖液，用陽離子交換纖維素則要選用高于其pK值的緩沖液。pH值一經選定，便限制了緩沖液種類選擇。適用于不同pH范圍的一些常用緩沖液種類如下表：6/24/2024107常用緩沖液種類6/24/2024108§3.1.2緩沖液的選擇

2、為了獲得足夠的緩沖容量，選用的緩沖離子，其pK值要盡量接近起始緩沖液的pH值(最好約在0.5個pH單位之內)。這樣可降低因緩沖液離子與離子交換纖維素的相互作用和由吸附過程本身所引起的pH紊亂。否則會出現pH的交錯界面而形成假峰。6/24/2024109§3.1.2緩沖液的選擇

3、適宜的緩沖液必須在所選擇的pH范圍內有足夠的緩沖能力，而且必須不影響目的物的活性，并且不干擾洗脫液的分析。如用紫外吸收法來分析洗脫液中的蛋白質和核酸含量時不能選用含芳香族化合物(如吡啶、巴比妥)的緩沖液。而假如用215－225nm波長光測吸收進行分析時，則不能用含有羧基的緩沖液。選用的緩沖液也必須不影響樣品的溶解性或與一些活性保護劑(如Ca＋＋、Mg＋＋)等生成沉淀。6/24/2024110§3.1.2緩沖液的選擇

4、用陽離子交換纖維素時一般應使用陰離子型緩沖液(如磷酸、醋酸等)，而用陰離子纖維素時則應使用陽離子型緩沖液(如Tris，吡啶等)，以避免緩沖液離子被吸附而形成人為的pH和鹽濃度交錯界面。

5、為了結合盡可能多的樣品，起始緩沖液的離子強度一般較低，為0.001~0.01M。當用增加離子強度進行洗脫時，為使層析系統盡可能地單一，可以用單純增加緩沖液離子濃度的辦法來達到，這樣便于控制pH。6/24/2024111§3.1.2緩沖液的選擇

6、當需要將洗脫液分部干燥后測量放射性時，殘渣中的鹽會妨礙放射性的正常測量或分離較小的分子時去鹽也常常出現困難，在這些情況下可選用揮發(fā)性緩沖液。

7、在進行某些容易丟失活性的物質的層析分離時，緩沖液中可適當加入保護劑，如巰基保護劑：半胱氨酸、巰基乙醇；螯合劑：EDTA、甘氨酸；無機離子等。6/24/2024112洗脫液按一定的體積分別收集后逐管進行分析，最后將分析結果對收集管號作圖。6/24/2024113分析分為兩種類型：1、非特異性分析，反映各組分的分離情況；2、特異性分析，反映目的物的具體位置。洗脫峰純度鑒定理論上應出現一個對稱的峰，但實際上吸附層析得到的峰幾乎都有拖尾現象。鑒定可用圓盤電泳和凝膠過濾法。6/24/2024114§3.6應用實例DEAE纖維素柱層析分離甘露醇脫氫酶6/24/2024115DEAE纖維素柱上的層析分離人血清免疫球蛋白的分離情況6/24/2024116兔γ－球蛋白的木瓜蛋白酶水解物在CM纖維素柱上的層析分離6/24/2024117天花粉各成分用特種離子交換劑層析分離6/24/20241186/24/2024119天花粉各成分用特種離子交換劑層析分離6/24/20241206/24/2024121E.Coli核酸在甲基血清白蛋白硅藻土層析柱上的分部分離情況6/24/2024122凝膠過濾(分子篩層析)6/24/20241236/24/20241246/24/2024125凝膠層析中常用的術語和參數6/24/2024126床體積：膨脹后的基質在層析柱中所占有的體積（Vt）表示。Vt=V0+Vi+Vg內水體積：是層析基質顆粒內部所含水的體積，用（V0）表示。外水體積：層析基質顆粒之間所含水的體積，用（Vi）表示?；|體積：層析基質本身在層析柱中所占有的體積（Vg）表示。6/24/2024127凝膠過濾的分配常數Kav=

Vt-VoVe-Vo在給定的條件下，Vt和Vo都為恒定值，而Ve隨著分離物分子質量的變化而變化。對凝膠過濾，其分配常數應在0≥Kav≥1。當被分離物質完全排阻時，Kav等于0，Ve等于V0；當被分離物質自由擴散時，Kav等于1，Ve等于Vo＋Vi。6/24/2024128從上式可以看出，Ve、Vo可通過層析過程中測定，只要測出Vt即可計算出Kav。Vt是凝膠過濾柱床總體積，由三部分組成，即Vo＋Vi＋Vg。

Vt＝πr2h或用Vt＝Vo＋Vi＋VgVg很小，可忽略不計。V0一般用藍色葡聚糖2000測定，其分子是為200萬，呈藍色，在各種型號的葡聚糖凝膠中都被完全排阻，并可直接觀察。6/24/2024129Vi的測定：選用一種分子量小于凝膠工作范圍下限的化合物，測出洗脫體積，減去V0就是Vi。常用鉻酸鉀來測定，鉻酸鉀為黃色化合物，可直接觀察，優(yōu)點為不與葡聚糖起任何反應；也可用硫酸銨測定，用硝酸銀檢出洗脫峰。6/24/2024130凝及的選擇和處理凝膠的選擇凝膠的型號和粒度的選擇型號的選擇：選擇時主要根據凝膠的篩分范圍、凝膠分辨率及分離目的而確定。粒度的選擇：根據層析對分辨率及流速的要求合理的選擇凝膠的粒度。6/24/2024131主要凝膠過濾介質的牌號及骨架結構6/24/20241326/24/2024133性能：(1)溶脹性Sephadex系均以干態(tài)供應，使用前必須在過量的溶劑中充分溶脹后才能使用。(2)化學穩(wěn)定性Sephadex不溶于一切溶劑，在水、鹽溶液、有機溶劑、堿及弱酸溶劑中均較穩(wěn)定。因葡聚糖中的糖苷鍵在強酸中可發(fā)生降解作用，所以只能接觸強酸的稀溶液，在0.1mol/L鹽酸中可接觸1～2小時，在0.02mol/L鹽酸中經6個月均無明顯變化，但要避免作用氧化劑。6/24/2024134(3)物理穩(wěn)定性pH中性濕態(tài)珠體可經受120℃、30min高壓滅菌而不影響色譜性能(4)機械強度Sephadex凝膠的機械強度取決于交聯度，交聯度越大，機械強度越高。機械強度與柱床所能承受的壓力有關，其壓力與流速的關系為：V=K×ΔPLV：線速度，cm/h；ΔP：壓力降，cm水柱；L：床高；K：比滲透率，受粒徑影響較大。6/24/2024135葡聚糖凝膠(G)型號分離范圍(分子量)吸水量(克／克干凝膠)膨脹體積(毫升／克干凝膠)浸泡時間蛋白質多糖20～25℃90~100℃10<700<7001.02-33115<1500<15001.52.5-3.531251000-5000100-50002.54-631501500-30000500-100005.09-1131753000-700001000-500007.512-152431004000-1500001000-1000001015-207251505000-4000001000-1500001520-307252005000-8000001000-2000002030-407256/24/2024136Sephadex的型號及性能6/24/2024137(二)、瓊脂糖系由經過純化的瓊脂糖制備，其中含有極小的帶電基團。利用瓊脂糖熱溶液冷卻時可凝膠化的特點，能方便地制成珠狀物。在凝膠過程中由單獨的多糖鏈先形成雙螺旋，然后聚集成膠束。膠束之間有孔，孔的大小取決于膠束的多少即瓊脂糖的濃度。傳統的瓊脂糖凝膠非特異性吸附極低，分離范圍很廣，分離范圍從10000～40000000，所以適用于分子量差距較大的分子間分離，分辨率不很高。瓊脂糖凝膠有兩種牌號Bio－GelA系和Sepharose6/24/20241386/24/2024139Bio－GelA系型號及性能6/24/2024140Sepharose系型號能性能6/24/2024141Sepharose是該系中最早的產品，為非交聯結構，因此不能進行高壓滅菌，僅能在2～40℃范圍內使用。根據瓊脂糖含量的不同，對含量為2％、4％及6％的產品分別命名為2B、4B和6B。由于新型凝膠的不斷出現，此型凝膠有逐漸被淘汰的趨勢。6/24/2024142Superose為剛性－半剛性珠體，在高黏性液體如8mol/L尿素下也能保持適當流速將廣泛的分離范圍及高分辨率集于一身，適用于糖類、核酸、病毒等的分離，特別是包含體蛋白在促溶劑中的純化。能一次性分離生物分子大小差異較大按的混合物。由于顆粒細小，粒度分布均勻，柱效高，可允許高流速，適用于中、高壓層析系統分離。6/24/2024143SepharoseFastFlow是新型的BioProcess凝膠介質，經過高度交聯的瓊脂糖珠體。具有機械強度高、流速快、極高的物理化學穩(wěn)定性及非特異性吸附極低等特點，而適合工業(yè)規(guī)模生產使用。對蛋白質的回收率很高，并可用多種促溶劑及有機溶劑或1～2mol/L的NaOH進行清洗。6/24/2024144聚丙烯酰胺系由丙烯酰胺與N,N’－亞甲基雙丙烯酰胺共聚而成的親水性凝膠。是結構穩(wěn)定的合成高聚物，不受微生物侵蝕，可在120℃消毒30min后，色譜性能不變。干膠的羧基含量≤3.0mmol/g，含有極少的游離電荷，所以非特異性吸附很小。還可以通過改變交聯劑的用量控制凝膠孔徑的大小，得到不同排阻極限的系列產品。6/24/20241