血小板功能檢測(cè)

血小板功能檢測(cè)：血小板在止血和動(dòng)脈血栓形成中的作用包括粘附到受損血管處或破裂的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處，形成止血栓或凝塊；加速凝血瀑布導(dǎo)致凝血酶的形成。本文綜述了血小板的作用，列舉了遺傳性的血小板缺陷及異常出血性疾病，并討論了各種血小板致聚劑。本文綜述了各種血小板功能檢測(cè)方法以及它們的優(yōu)缺點(diǎn)：出血時(shí)間測(cè)定；利用透光性的改變來(lái)檢測(cè)枸櫞酸鈉抗凝的富含血小板血漿中血小板的聚集功能；阻抗聚集儀檢測(cè)枸櫞酸鈉抗凝全血中血小板的聚集功能；高切變力血小板功能分析儀（PFA-100）和Ultegra快速血小板功能測(cè)定儀檢測(cè)血小板相關(guān)的止血功能；用錐板分析儀檢測(cè)高切變力下血小板的粘附和聚集功能；檢測(cè)血小板顆粒內(nèi)容物的分泌（ATP,14C-5-羥色胺,血小板第4因子和β－血小板球蛋白）和血栓烷B2的形成；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體內(nèi)和體外使用致聚劑的血小板激活情況（包括血小板膜糖蛋白構(gòu)象改變，P-選擇素和磷脂酰絲氨酸的表達(dá)）；檢測(cè)遺傳性缺陷中血小板膜糖蛋白的水平。1簡(jiǎn)介血小板在止血和血栓中的作用當(dāng)血管損傷時(shí)，血小板會(huì)迅速粘附到損傷處，聚集形成由纖維蛋白固定的止血塊。在微血管損傷處及破裂的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊處也會(huì)發(fā)生類(lèi)似的過(guò)程，最終形成血小板－纖維蛋白血栓，引發(fā)動(dòng)脈硬化癥的血栓性并發(fā)癥。體內(nèi)能夠激活血小板的誘導(dǎo)劑主要有膠原蛋白，ADP，血栓烷A2（TXA2），凝血酶，弱誘導(dǎo)劑有5－羥色胺和腎上腺素。血小板上不僅有針對(duì)這些介質(zhì)的受體，還有纖維蛋白原和VWF的受體。TXA2的形成和釋放以及血小板致密顆粒中分泌的ADP和5－羥色胺會(huì)加速血小板的激活過(guò)程，促凝表面的暴露促進(jìn)凝血酶的形成，而凝血酶是強(qiáng)有效的激活劑。激活也會(huì)誘導(dǎo)α-顆粒內(nèi)容物的分泌和顆粒跨膜蛋白P-選擇素出現(xiàn)在血小板的表面上。所有血小板致聚劑都具有協(xié)同作用，因此當(dāng)凝集過(guò)程的某個(gè)途徑存在缺陷或被抑制時(shí)，血小板的凝集功能將被大大受損。在血管壁的損傷處，血小板與內(nèi)皮下細(xì)胞外基質(zhì)中的VonWillebrand因子（VWF），膠原蛋白和纖維結(jié)合素粘附在一起。在高切變力情況下，血小板糖蛋白GPIb/IX/V復(fù)合物與VWF的相互反應(yīng)是非常短暫的，但當(dāng)VWF與血小板表面的GPIIb/IIIa結(jié)合，這一過(guò)程會(huì)變成不可逆的。血小板表面膠原蛋白受體包括GPIa/IIa（α2β1），它在粘附過(guò)程中具有非常重要的作用；而GPVI在血小板活化引起TXA2的形成和釋放以及致密顆粒和α貯存顆粒內(nèi)容物的分泌過(guò)程中起作用。血小板存在TXA2和ADP受體，在損傷處流動(dòng)的血小板受刺激后會(huì)改變形狀，伸出偽足，進(jìn)而在粘附血小板周?chē)纬删奂?。聚集過(guò)程需要血小板表面的異二聚體整合素分泌和血小板表面磷脂雙分子層翻轉(zhuǎn)暴露促凝磷脂表面，通常為磷脂酰絲氨酸（PS）翻轉(zhuǎn)到血小板表面。也會(huì)產(chǎn)生促凝活性的微粒。PS的暴露大大加速了凝血途徑因子Ⅹ和凝血酶原酶的反應(yīng)，產(chǎn)生了最有效的血小板誘導(dǎo)劑--凝血酶。凝血酶切開(kāi)血小板表面的蛋白酶激活受體，導(dǎo)致GPIIbGPIIb/IIIa復(fù)合物轉(zhuǎn)變成纖維蛋白原的受體或某些情況下作為VWF的受體。這些蛋白會(huì)在鄰近的受刺激的血小板之間搭橋。激活的正常的GPIIb/IIIa在血小板聚集過(guò)程中非常重要。當(dāng)血小板受膠原蛋白和凝血酶等致聚劑刺激，能引起血小板顆粒的/IIIa的激活，形成TXA2和引起血小板顆粒內(nèi)容物的分泌。凝血酶同樣促使纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，包裹在血小板聚合物表面形成堅(jiān)固的止血塊或血栓。在磷脂酶A2作用下膜磷脂釋要目的在于確定異常出血的原因或確保在手術(shù)或牙科侵入性操作（包括拔牙）過(guò)程中的正常止血功能。多種方法嘗試來(lái)證實(shí)高血小板活性有血栓形成的傾向，這個(gè)專(zhuān)題最近被Thiagarajan和Wu等進(jìn)行綜述。異常出血常見(jiàn)的原因?yàn)檠“鍦p少癥，這可通過(guò)血小板計(jì)數(shù)來(lái)確定。當(dāng)血小板計(jì)數(shù)低放出花生四烯酸時(shí)可產(chǎn)生TXA2。在環(huán)氧化酶（COX-1）和血栓烷合酶作用下，花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)XA2。TXA2只能短期存在，很快形成無(wú)活性的穩(wěn)定產(chǎn)物TXB2。COX－1被阿司匹林不可逆地滅活，因此血小板生成TXA2的能力受到它們?cè)谕庵苎h(huán)停留時(shí)間的影響。任何一項(xiàng)血小板功能受損，都會(huì)削弱凝血功能。血小板功能檢測(cè)的主于50-70×109/l，就會(huì)導(dǎo)致瘀斑和凝血異常。血小板減少癥會(huì)影響大多數(shù)血小板功能檢測(cè)方法，但對(duì)流式細(xì)胞術(shù)除外。1.1遺傳性和獲得性血小板功能缺陷表1列舉了部分遺傳性疾病，它們的血小板功能存在某種程度的受損，有明顯的出血癥狀。除VonWillebrand病(VWD)外，大多數(shù)缺陷非常罕見(jiàn)。雖然某些食物和天然物質(zhì)中含有抑制物，但是藥物因素仍是最主要的引起獲得性血小板功能低下的原因。抑制血小板功能的藥物中有能抑制COX的阿斯匹林和其它非甾醇類(lèi)抗感染藥，抗生素如青霉素，thienopyridines（噻氯匹定和clopidogrel），GPIIb/IIIa拮抗劑，影響cAMP水平的藥物，抗凝劑如肝素，纖溶制劑，心血管藥物，神經(jīng)科藥物和麻醉藥物等。到目前為止阿司匹林是最常見(jiàn)的抑制劑，至少有250種藥物中含有這種成分。阿司匹林的作用是長(zhǎng)期的，它對(duì)COX-1的乙?；饔檬遣豢赡娴?。非血液系統(tǒng)疾病引起血小板功能降低的疾病有：尿毒癥，慢性肝病，骨髓增殖性疾病和獲得性VWD。表1遺傳性出血疾病Glanzmann血小板機(jī)能不全：GPIIb/IIIa（αIIbβ3）缺失或異常它是纖維蛋白原和VWF的受體，對(duì)任何血小板致聚劑無(wú)反應(yīng)。Bernard-Soulier巨大血小板綜合癥：GPIb/IX/V缺失或異常它參與血小板與內(nèi)皮下的VWF粘附。對(duì)瑞斯霉素?zé)o反應(yīng)。GPIa/IIa（α2β1）缺失或異常。不能粘附膠原蛋白ADP誘導(dǎo)聚集嚴(yán)重減弱，以及膠原蛋白和凝血酶誘導(dǎo)聚集受損，提示為罕見(jiàn)的P2Y12ADP受體異常。噻氯匹定和clopidogrel通過(guò)此受體作用，產(chǎn)生類(lèi)似的對(duì)ADP誘導(dǎo)選擇性抑制。弱的致聚劑，腎上腺素（5-10uM），可聚集PRP中的血小板，而不改變血小板的形態(tài)，但腎上腺素的致聚作用并不一致。如果服用了阿司匹林或其它抑制TXA2形成的藥物，血小板對(duì)任何濃度的腎上腺素都不反應(yīng)，不會(huì)產(chǎn)生聚集。膠原纖維（1-5μg/ml）會(huì)引起特征性滯后（可達(dá)1分鐘）的血小板聚集,聚集需要TXA2形成和顆粒內(nèi)容物的分泌，而且基本上是不可逆的。雖然血小板形態(tài)發(fā)生了變化，但是阿司匹林及其它抑制TXA2形成的藥物可以阻斷低濃度的膠原蛋白引起的聚集反應(yīng)。罕見(jiàn)的GPVI缺陷癥表現(xiàn)為血小板受膠原蛋白刺激后并不發(fā)生聚集，但在受到其它致聚劑的刺激后通常會(huì)發(fā)生聚集?；ㄉ南┧峥梢赞D(zhuǎn)變?yōu)門(mén)XA2，因此可作為聚集劑。阿司匹林和其它可以抑制環(huán)氧化酶的藥物具有抑制作用。但是TXA2的類(lèi)似物U46619，卻可以在此類(lèi)抑制劑的存在狀況下產(chǎn)生聚集作用。在罕見(jiàn)的環(huán)氧化酶缺失的病人，花生四烯酸不誘導(dǎo)血小板聚集，但U46619會(huì)引起血小板的聚集。SFLLRN(TRAP)具有凝血酶的誘導(dǎo)血小板強(qiáng)聚集作用的功能，只有當(dāng)TXA2形成障礙時(shí)，這一作用才會(huì)稍有減弱。分泌缺陷，特別是致密顆粒缺少ADP的增強(qiáng)作用，會(huì)造成異常的聚集，即存在正常的第一相過(guò)程，而無(wú)第二相過(guò)程。分泌缺陷時(shí)低濃度的膠原蛋白和SFLLRN誘導(dǎo)血小板聚集會(huì)減弱。2.2瑞托霉素聚集血小板這一試驗(yàn)同樣用聚集儀對(duì)枸櫞酸抗凝的PRP進(jìn)行測(cè)試?？股厝鹜忻顾乜勺鳛橹戮蹌?，終濃度常見(jiàn)為1.5mg/ml。正常的樣本是第一相聚集后緊接著會(huì)發(fā)生第二相聚集。缺乏反應(yīng)提示為Bernard-Soulier綜合癥或VWF缺乏。2.3全血血小板聚集用阻抗血小板聚集儀可測(cè)定稀釋的抗凝全血的血小板聚集功能。將兩個(gè)電極插入樣本中，當(dāng)有電流通過(guò)時(shí)，血小板會(huì)粘附到電極上。然后添加致聚劑加以攪拌，在電極上的血小板周?chē)“寰奂?，記錄阻抗變化的速率和幅度。這一試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于不用制備PRP，而且脂血中的血小板功能也可測(cè)量，但不適合血小板計(jì)數(shù)極低的病人。2.4血小板功能分析儀－100DadeBehring血小板功能分析儀（PFA－100）是微處理器控制的儀器，它可定量測(cè)定高切變力下血小板和血小板相關(guān)的止血功能。試驗(yàn)過(guò)程為0.8ml枸櫞酸抗凝血加到裝有一次性試驗(yàn)管的槽內(nèi)（要求4小時(shí)內(nèi)血樣），預(yù)溫到37℃，然后利用真空吸力使血樣通過(guò)一個(gè)直徑200μm的不銹鋼毛細(xì)管和直徑為150μm的硝酸纖維膜微孔，膜上包被膠原蛋白和腎上腺素（CEPI）或膠原蛋白和ADP（CADP）。在5000-6000/s的高切變和誘導(dǎo)劑的作用下，血小板產(chǎn)生聚集，阻礙血液穿過(guò)微孔，堵塞微孔的時(shí)間稱為終止時(shí)間（CT），最大測(cè)定值為300秒。血小板最初通過(guò)GPIb/IX/V和VWF間的相互作用以及GPIa/IIa,VWF的直接連接粘附到膜上的膠原蛋白上導(dǎo)致聚集，而不是由纖維蛋白原連接到活化血小板的GPIIb/IIIa引起聚集。12.9mM的枸櫞酸鈉抗凝時(shí)得到的CT值比濃度為10.9mM枸櫞酸鈉抗凝CT值要大，因此選擇合適的抗凝劑濃度是非常重要的。PPACK也可用作抗凝劑。僅在CEPI管CT時(shí)間延長(zhǎng)，可能是輕微的遺傳性血小板功能缺陷（如貯存池異常）和阿司匹林抑制。CEPI管和CADP管CT時(shí)間均延長(zhǎng)，可能為嚴(yán)重的遺傳性血小板功能障礙（如Glanzmann血小板機(jī)能不全和Bernard-Soulier綜合癥）和VWD。實(shí)際上PFA-100是有效的篩選VWD的手段，特別是1型－VWD，而且對(duì)婦女月經(jīng)過(guò)多及兒童的鼻出血懷疑有血小板異常或VWD進(jìn)行鑒別是非常有用的。它同時(shí)有利于監(jiān)測(cè)1型－VWD患者對(duì)DDAVP的反應(yīng)和PTCA患者對(duì)GPIIb/IIIa拮抗劑的反應(yīng)，也可用于評(píng)估血庫(kù)提供的濃縮血小板質(zhì)量和血小板輸注的效果。PFA-100具有操作簡(jiǎn)單，快速，重復(fù)性好，全血用量少的優(yōu)點(diǎn)。血小板計(jì)數(shù)少于50×109/L和紅細(xì)胞比容＜25％時(shí)會(huì)引起CT時(shí)間延長(zhǎng)。2.5Ultegra快速血小板功能檢測(cè)Accumetrics快速血小板功能實(shí)驗(yàn)（RPFA）提供了一種簡(jiǎn)單，快速，準(zhǔn)確的血小板功能檢測(cè)方法，它用于床邊監(jiān)測(cè)接受GPIIb/IIIa拮抗劑的患者。枸櫞酸鈉抗凝全血采集后，馬上取0.16ml樣本加到有2個(gè)樣本通道的一次性試管中。通過(guò)由微處理器驅(qū)動(dòng)的鋼珠運(yùn)動(dòng)，血液與血小板致聚劑（iso-S）FLLRN和纖維蛋白原包被的聚苯乙烯珠混勻70秒，檢測(cè)樣本的透光強(qiáng)度。激活的血小板和包被纖維蛋白原的珠子之間發(fā)生凝集，沉入底部，引起光透過(guò)率的增加。凝集的速度和強(qiáng)度可用血小板凝集單位（PAU）計(jì)算，當(dāng)有GPIIb/IIIa拮抗劑存在，PAU值會(huì)迅速下降，這是因?yàn)槟l(fā)生與活化血小板上的未被阻斷的GPIIb/IIIa受體成正比關(guān)系。RPFA用來(lái)監(jiān)測(cè)GPIIb/IIIa拮抗劑abciximab,tirofiban,eptifibatide和orofiban對(duì)血小板的阻斷效果。2.6錐板分析儀Varon及其同事開(kāi)發(fā)了錐板分析儀（CPA），在高切變力的條件下使用錐板粘度計(jì)檢測(cè)血小板的粘附和聚集。這一裝置通過(guò)錐體的旋轉(zhuǎn)在板表面產(chǎn)生均一的切變壓力引起層流。0.2ml的枸櫞酸鈉抗凝全血加到聚苯乙烯板上，以1800/s切變速度旋轉(zhuǎn)2分鐘，隨后染色。圖形分析儀分析粘附的血小板和血小板聚集，可提供大小分布的的直方圖，表面覆蓋的百分比(SC)和平均大小(AS)。血小板粘附到聚苯乙烯板上依賴于板上包被的VWF和纖維蛋白原，GPIIb/IIIa，GPIb/IX/V以及血小板的激活。CPA可快速確定先天性和獲得性的血小板缺陷及VWD，也可測(cè)試抗血小板療效和確定血小板功能亢進(jìn)患者的血栓前形成狀態(tài)。CPA的優(yōu)點(diǎn)在于快速，簡(jiǎn)單，只需0.2ml全血。2.7顆粒內(nèi)容物分泌的檢測(cè)發(fā)光聚集儀可同時(shí)檢測(cè)血小板聚集和ATP（一種致密顆粒的組成部分）的釋放。用熒光素酶檢測(cè)ATP，ATP的濃度參照正常人PRP和已知ATP濃度制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。加入誘導(dǎo)劑，檢測(cè)已標(biāo)記血小板的14C-5-羥色胺的分泌狀況可指示致密顆粒的分泌情況。當(dāng)誘導(dǎo)分泌內(nèi)容物時(shí)，α顆粒跨膜蛋白P-選擇素會(huì)出現(xiàn)在血小板的表面，這可通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)（見(jiàn)2.9）。血小板第4因子（PF4）和β－血小板球蛋白是血小板特異性蛋白，貯存于α顆粒，在血小板激活時(shí)釋放?？捎梅派湫悦庖叻椒y(cè)定，但應(yīng)注意靜脈穿刺對(duì)結(jié)果影響比較大。2.8花生四烯酸的動(dòng)員和血栓烷B2的形成在正常情況下，誘導(dǎo)劑可將花生四烯酸從血小板的磷脂層中動(dòng)員出來(lái)，并通過(guò)血小板轉(zhuǎn)變?yōu)檠ㄍ锽2。血栓烷B2是一種穩(wěn)定的復(fù)合物，可通過(guò)商用的放射性免疫測(cè)定法和酶免法來(lái)測(cè)定。2.9流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)可快速檢測(cè)抗凝血、稀釋全血、PRP、人工介質(zhì)中懸浮的少量血小板。使用全血可以避免操作過(guò)程中血小板被激活。通常血小板與聯(lián)接不同光譜的熒光素的兩種單克隆抗體（MoAbs）反應(yīng)。為確定血小板的特異性，第一個(gè)MoAb特異性針對(duì)GPIb,IIb或IIIa，并在近飽和溶液中使用。為確定血小板上的抗原決定簇，血小板還與另一標(biāo)記MoAb反應(yīng)。這種MoAb特異性針對(duì)表位，也在飽和溶液中使用。與抗體孵育后，稀釋樣本以1000-100，000細(xì)胞/min的速度在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。聚焦激光束在其相應(yīng)的吸收光譜內(nèi)激發(fā)了聯(lián)接的熒光。血小板通過(guò)標(biāo)識(shí)的熒光素以及前向角和側(cè)向角的特性進(jìn)行確認(rèn)。第二個(gè)單抗發(fā)出的熒光強(qiáng)弱與某一抗原決定簇的密度成正比，并可通過(guò)獲取上千個(gè)血小板來(lái)計(jì)數(shù)。這些數(shù)據(jù)均可用軟件來(lái)分析。因?yàn)榧ぐl(fā)光譜有部分被重疊，每一混合熒光需設(shè)置補(bǔ)償。如果抗原決定簇的表達(dá)隨著時(shí)間而變化（如膜GPs的滑動(dòng)），著色前血小板可先用1％的多聚甲醛固定，它不干擾抗體結(jié)合。如果不是立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，血小板也可在加入著色劑后再固定（原理同上）。許多熒光素標(biāo)記的抗體及非抗體源的探針均可標(biāo)記血小板抗原決定簇。MoAbs除可以和未被活化血小板的GPs結(jié)合外，某些激活依賴MoAbs可檢測(cè)GPs構(gòu)象變化（如PAC1可檢測(cè)GPIIb/IIIa）或顆粒膜蛋白表達(dá)（如抗P－選擇素）。非抗體探針包括PKH親脂性膜染料，可用鏈親和素標(biāo)記熒光檢測(cè)的生物素和用于檢測(cè)血小板活化促凝表面的暴露情況的熒光標(biāo)記的annexinV。流式細(xì)胞儀可有效評(píng)估離體血小板活化程度及評(píng)價(jià)體外使用致聚劑后血小板的敏感性。它用來(lái)檢測(cè)某些病程中血小板的活化情況，如不穩(wěn)定心絞痛，急性心肌梗死，頑固冠心病，初期子癇，外周血管病，腦血管缺血和冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)。流式細(xì)胞儀還被用來(lái)監(jiān)測(cè)血庫(kù)提供的濃縮血小板的質(zhì)量，因?yàn)楸４嫫趦?nèi)血小板會(huì)有所變化。遺傳性血小板膜GP缺陷如Glanzmann血小板機(jī)能不全和Ber