應(yīng)用指南 - 在3L攪拌罐式生物反應(yīng)器中使用AAV-MAX系統(tǒng)生產(chǎn)AAV

gibco簡(jiǎn)介Gibco?AAV-MAX無(wú)輔助病毒AAV生產(chǎn)系統(tǒng)是一種腺相關(guān)病毒化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基、轉(zhuǎn)染試劑、轉(zhuǎn)染加強(qiáng)劑以及生產(chǎn)增強(qiáng)劑。的生物反應(yīng)器控制和工藝參數(shù)針對(duì)AAV生產(chǎn)進(jìn)行了相關(guān)優(yōu)化。采器中進(jìn)行的AAV生產(chǎn)可實(shí)現(xiàn)與搖瓶生產(chǎn)相當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和代謝材料?Gibco?病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.0?Gibco?病毒生產(chǎn)培養(yǎng)基?Gibco?AAV-MAX轉(zhuǎn)染試劑盒–Gibco?AAV-MAX轉(zhuǎn)染試劑–Gibco?AAV-MAX轉(zhuǎn)染加強(qiáng)劑–Gibco?AAV-MAX增強(qiáng)劑?Gibco?Viral-Plex?絡(luò)合緩沖液方法生物反應(yīng)器制備、細(xì)胞擴(kuò)增和接種擴(kuò)增細(xì)胞（第-4天）輔助生產(chǎn)系統(tǒng)用戶指南（出版號(hào)：MAN0019619解凍并培養(yǎng)細(xì)胞。在接種每個(gè)生物反應(yīng)器前三天，接種搖瓶至最終密度為1.8L。準(zhǔn)備生物反應(yīng)器（第-3天或第-2天）之后將探針連接至生物反應(yīng)器。然后在高壓滅菌器中對(duì)生物反應(yīng)器接種生物反應(yīng)器（第-2天或第-1天）試劑試劑0.15%0.6%5.4mL0.3%1.0%112.05%；葉尖速度：0.66m/s2L40%（通過(guò)氣體分布器中的O控制）延遲收獲時(shí)間時(shí)，根據(jù)策略2向VPC有益。這將最大限度地降低運(yùn)行期間營(yíng)養(yǎng)耗竭的可能性。對(duì)于兩種接種策略1轉(zhuǎn)染前一天（第-1天），向生物反應(yīng)器中加入1LVPM，并在接種），接種策略2），VC/mL（總體積為1L來(lái)接種生物反應(yīng)器。轉(zhuǎn)染當(dāng)天（第0），接種后參數(shù)表2.2L轉(zhuǎn)染的建議試劑體積。2.7mL2.7mL*假定質(zhì)粒DNA儲(chǔ)備液濃度為1mg/mL。轉(zhuǎn)染和收獲檢查細(xì)胞（第0天）轉(zhuǎn)染當(dāng)天，評(píng)估培養(yǎng)物的活細(xì)胞密度（VCD）和活力。在進(jìn)行轉(zhuǎn)染稀釋培養(yǎng)物（第0天）在第0天，將策略2獲得的培養(yǎng)物用新鮮V添加增強(qiáng)劑（第0天）轉(zhuǎn)染前30分鐘，將含有AAV-MAX增強(qiáng)劑的250轉(zhuǎn)染（第0天）AAV-MAX轉(zhuǎn)染試劑。輕輕渦旋錐形管以混合內(nèi)容物，然后在室溫合內(nèi)容物，然后在室溫下孵育10min。孵育期間，在培養(yǎng)瓶上蓋上轉(zhuǎn)移蓋，然后通過(guò)無(wú)菌焊接管將培養(yǎng)瓶連接至生物反應(yīng)器。孵育轉(zhuǎn)染后每天對(duì)每份培養(yǎng)物進(jìn)行采樣。使用Vi-CELL?細(xì)胞活力分析Diagnostics）測(cè)定葡萄糖、谷氨酰胺、谷氨酸鹽、乳酸鹽和氨水收獲（第3天）時(shí)定量PCR（qPCR）測(cè)定滴度。策略1（生物反應(yīng)器）（生物反應(yīng)器）（搖瓶）（搖瓶）（生物反應(yīng)器）（生物反應(yīng)器）（搖瓶）（搖瓶）qPCR法定量病毒基因組滴度述測(cè)定AAV基因組滴度。在qPCR分析前，對(duì)粗品裂解物進(jìn)行處理，從AAV顆粒中釋放衣殼化DNA。使用靶向綠色熒光蛋白（GFP）基因的引物和探針進(jìn)行qPCR，GFP基因兩側(cè)是包裝病毒結(jié)果通過(guò)兩種策略接種后，在生物反應(yīng)器和相應(yīng)的搖瓶對(duì)照中觀察到相似的生長(zhǎng)曲線（圖1A和1B）。每種接種策略也產(chǎn)生了相似的謝特征和滴度進(jìn)行了表征。在生物反應(yīng)器培養(yǎng)物和搖瓶對(duì)照培養(yǎng)物應(yīng)器培養(yǎng)物和搖瓶對(duì)照培養(yǎng)物中觀察到相似的乳酸生成、氨生成和葡萄糖耗竭曲線（圖2D–F）。生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中的AAV2和AAV6基因組滴度均高于相應(yīng)的搖瓶對(duì)照。然而，平均滴度在應(yīng)用于生物反應(yīng)器中，可產(chǎn)生1×1011vg/mL含有GFP基因的結(jié)論生長(zhǎng)，采用生物反應(yīng)器工藝獲得的AAV基因組滴度超過(guò)了采用搖瓶生產(chǎn)獲得的滴度。研究中測(cè)試了兩種接種策略。所選策略性能相當(dāng)，且簡(jiǎn)化了工藝，并將生產(chǎn)時(shí)間降至最低。結(jié)果證明，用AAV-作者附錄3L生物反應(yīng)器方案以便接種1個(gè)生物反應(yīng)器。這相當(dāng)于1.8L接種培養(yǎng)物中6VC/mL的接種密度。注：在轉(zhuǎn)染前，解凍細(xì)胞至少?gòu)?fù)3.對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行滅菌并冷卻至室溫。4.向生物反應(yīng)器中加入1LVPM。設(shè)置并啟用攪拌、頂空通氣和7.轉(zhuǎn)染當(dāng)天，測(cè)定活力和活細(xì)胞密度。我們建議在進(jìn)行轉(zhuǎn)染之8.向生物反應(yīng)器中加入一定體積的AAV-MAX增強(qiáng)劑，使其與初表3.推薦的轉(zhuǎn)染參數(shù)。3.0x10VC/mL*假定質(zhì)粒DNA儲(chǔ)備液濃度為1mg/mL。轉(zhuǎn)染試劑的混合物加入步驟10b中稀釋的質(zhì)粒DNA孵育期間，在培養(yǎng)瓶上蓋上轉(zhuǎn)移蓋，并將培養(yǎng)瓶上的管注：為了實(shí)現(xiàn)最佳AAV生產(chǎn)，我們建議將轉(zhuǎn)染試劑和注：確保所有設(shè)備在使用前均已校準(zhǔn)。使用超出關(guān)于放大至較大容器的建議?需要考慮每體積的功率輸入（P/V）、葉尖速度、混合時(shí)間和轉(zhuǎn)染絡(luò)合物的加入。方案中的P/V為20W/m3,葉尖速度為0.66最佳混合的同時(shí)最大限度地減少來(lái)自葉輪的剪切作用。如果可?可根據(jù)表2中給出的百分比，將體積按比例縮放為待轉(zhuǎn)染培養(yǎng)?注意轉(zhuǎn)染試劑、DNA和轉(zhuǎn)染絡(luò)合物的放置時(shí)間和混合。確保各步驟進(jìn)行適當(dāng)混合，且孵育和添加持續(xù)時(shí)間未出現(xiàn)不必要的延僅供研究使用。不可用于診斷程序。?2022ThermoFisherScientificInc.版權(quán)所有。除另有說(shuō)明外，所有商標(biāo)均為T(mén)hermoFisherScientificInc.及其子公司的財(cái)產(chǎn)。Vi-CELL是BeckmanCoulterInc.的商標(biāo)。StatProfilePrime是NovaBiomedicalCorporation的商標(biāo)。Cedex是RocheMolecularSystemsInc.的商標(biāo)。COL345980322訂購(gòu)信息貨號(hào)Gibco病毒生產(chǎn)細(xì)胞2.0