應(yīng)用指南 - 質(zhì)粒大規(guī)模生產(chǎn)解決方案

Theworldleaderinservingscience目錄 1 2 4 4 6 8 質(zhì)粒是宿主染色體(或擬核)以外的閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，它們天然存在于E.Coli等細(xì)菌中，并為宿主提供競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，包括抗生素抗性以及在極端環(huán)境中生存的能力，已成為重組DNA技術(shù)的基本工具。在治療水平上，pDNA常被用作病毒載體基因治療、無論是作為關(guān)鍵起始原料，還是作治療性藥物本身，質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)都至關(guān)重要。根據(jù)質(zhì)粒使用的類型(在藥物開發(fā)中是否用作起始/關(guān)鍵原料、中間體、原料藥或藥物產(chǎn)品)，有不同的機(jī)構(gòu)推動(dòng)不同的指南進(jìn)行指導(dǎo)，以規(guī)范質(zhì)粒的生產(chǎn)，克服相應(yīng)的挑戰(zhàn)。鑒于臨床開發(fā)后續(xù)階段的監(jiān)管日益嚴(yán)格，重要的是通過原材料的控制、工藝的開發(fā)、1Gibco?細(xì)胞培養(yǎng)注射用水(WFI)Gibco?Gibco?細(xì)胞培養(yǎng)注射用水(WFI)Gibco?NaOH溶液一次性攪拌罐S.U.M.菌體裂解菌體裂解大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)Gibco?Difco?SoytoneGibco?Bacto?Gibco?Difco?SoytoneGibco?Bacto?ThermoScienti?c?HyPerforma?玻璃反應(yīng)器Gibco?Bacto?CDSupremeFermentationProductionMedium一次性發(fā)酵罐S.U.F./增強(qiáng)型一次性發(fā)酵罐eS.U.F.2ThermoScienti?c?DynaChrom?一次性層析系統(tǒng)POROS?50D弱陰離子交換填料POROS?50ThermoScienti?c?DynaChrom?一次性層析系統(tǒng)POROS?50D弱陰離子交換填料POROS?50HQ強(qiáng)陰離子交換填料疏水層析填料3 質(zhì)粒純化ThermoScientifc?Nalgene?ThermoScientifc?BioProcessBiotainer?生物儲(chǔ)存瓶Containers一次性生物工藝容器5 質(zhì)粒儲(chǔ)存4 放行檢測(cè)4殘留DNA定量系統(tǒng)PrepSEQ?殘留DNA殘留DNA定量系統(tǒng)PrepSEQ?殘留DNA樣品制備試劑盒自動(dòng)核酸提取儀(磁珠法)3以提高質(zhì)粒產(chǎn)量1到50倍。此外，對(duì)于一些大腸?提高大腸桿菌發(fā)酵密度(培養(yǎng)基、補(bǔ)料、培養(yǎng)方式、溶如果使用人源或動(dòng)物源物質(zhì)，應(yīng)符合《中華人民共和國(guó)藥o-《藥品共線生產(chǎn)質(zhì)量管理指南》基因治療和細(xì)胞治療產(chǎn)品由于涉及的活體材料的可變性及可能含有傳染性疾病的病原體，如質(zhì)粒、病毒、病原體類產(chǎn)品的危害性較高，建議專用生產(chǎn)線或使用一次性生產(chǎn)系o-《歐洲藥典》(EP8.0,2014)第5.2.8章醫(yī)用產(chǎn)品的生產(chǎn)應(yīng)優(yōu)先考慮使用“非TSE相關(guān)動(dòng)物物種材為減少TSE傳播的潛在風(fēng)險(xiǎn)，建議使用無動(dòng)物源生產(chǎn)原料4ThermoScientificHyPerforma提供最優(yōu)化的混合效率、平均kLa和最小的剪切力，支持從細(xì)增加冷水循環(huán)面積，降溫效果是其他品牌同類ThermoScientificHyPerforma一次性發(fā)酵罐Hyperforma一次性發(fā)酵罐(S.U.F.)采用傳統(tǒng)的不銹鋼發(fā)酵罐設(shè)計(jì)原理，通過高效的傳質(zhì)、混合和溫度控制，專為微計(jì)。5:1的調(diào)節(jié)比可輕松實(shí)現(xiàn)從小體積至大規(guī)模的放大。增強(qiáng)型eS.U.F.更是通過升級(jí)改良，增加35%的冷卻夾套面積，進(jìn)一步?強(qiáng)大的混合能力，優(yōu)異的氧傳質(zhì)能力，高效的控溫能力?定制化一次性生物反應(yīng)袋可精確匹配工藝需求?應(yīng)用實(shí)例中最高OD600可達(dá)240?不含水解物和動(dòng)物源成分，保證質(zhì)量和一致性?靈活的包裝，輕松放大至大規(guī)模體積發(fā)酵，優(yōu)化發(fā)酵工作流?相比傳統(tǒng)TB培養(yǎng)基質(zhì)粒產(chǎn)量提高30%~40%，且提高批次間穩(wěn)?不含動(dòng)物源成分，完全植物來源的水解物?相比傳統(tǒng)動(dòng)物源和大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基可以更好地提高大腸?不含動(dòng)物源成分，完全植物來源的水解物?相比傳統(tǒng)動(dòng)物源和大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基可以更好地提高質(zhì)粒5降解DNA，將基因組DNA分解成小片段，從而度會(huì)產(chǎn)生很大的剪切力，同樣會(huì)將DNA打斷，?裂解罐集中供堿，造成局部過堿，裂解不充分?采用攪拌的方式進(jìn)行混勻，因其傳質(zhì)是非線性相關(guān)，放?質(zhì)粒DNA對(duì)剪切力敏感，產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中如何保障質(zhì)粒6?根據(jù)客戶需求和包裝規(guī)格不同，我們可以提供瓶子和一次性?除滿足藥典要求外，Gibco高品質(zhì)注射用水每批次還會(huì)額外檢?該產(chǎn)品可用于生物工藝的多個(gè)環(huán)節(jié)，如細(xì)胞培養(yǎng)、緩沖液配?多藥典級(jí)原料?產(chǎn)品可應(yīng)用于pH值調(diào)節(jié)、設(shè)施/設(shè)備消毒以及色譜柱清潔、消ThermoScientificHyPerforma一次性攪拌罐S.U.M.?頂置斜槳機(jī)械攪拌提供穩(wěn)定的功率輸入和平均的徑向輻向液?可在低速攪拌下提供良好的混勻效果，同時(shí)降低剪切力，防?封閉軸承設(shè)計(jì)可減少攪拌過程中產(chǎn)生的顆粒物，符合?蘇州生產(chǎn)的SUM價(jià)格相較進(jìn)口版本下降20%，標(biāo)準(zhǔn)貨號(hào)耗材7菌體裂解后除了目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)粒外，還有菌體碎粒一般比蛋白質(zhì)大得多；第二，質(zhì)粒帶電非常高；第三，pDNA有很多種形式。但是目前質(zhì)粒統(tǒng)層析填料對(duì)pDNA的結(jié)合載量較低。因此在保證產(chǎn)率/回收率和純度的情況下，選擇省時(shí)間、?傳統(tǒng)質(zhì)粒三步純化法純化成本高，生產(chǎn)效率低?大多數(shù)軟膠介質(zhì)，不能在高流速下運(yùn)行，降低純化效率8DynaChrom系統(tǒng)為層析供了完整的一次性解決方案。預(yù)設(shè)的系統(tǒng)選項(xiàng)和模塊化流路組件設(shè)計(jì)可以滿足用戶不同的用于多個(gè)層析步驟，并可與自動(dòng)化功能包相結(jié)合，提供高一致性、高性能的純化工藝平臺(tái)。?ThermoScientific?TruChrom?自動(dòng)化軟件基于Emerson?為技術(shù)轉(zhuǎn)移、數(shù)據(jù)整合和數(shù)據(jù)存儲(chǔ)帶來了便利。可靈活配置?易于放大，同一設(shè)備支持1-1980L/hr流量范圍，可滿足從臨床?硬件可支持四種規(guī)格的一次性管路組件，安裝簡(jiǎn)便，軟件可POROS?灌注層析填料是目前工業(yè)級(jí)生物分離領(lǐng)域中性能最好的層析介質(zhì)，其硬質(zhì)、高效的顆粒將層析通量提高為質(zhì)的2~3倍，并可以獲得高分辨率的分離效果，同時(shí)POROS?灌注層析產(chǎn)品易于清洗和裝柱，越來越多的客戶將POROS?填?可放大性強(qiáng)，可以在高流速下運(yùn)行，表現(xiàn)穩(wěn)定?大孔硬膠介質(zhì)，提高傳質(zhì)流速和結(jié)合載量?填料粒徑小，提高分辨率和雜質(zhì)分離能力?已有許多客戶將POROS?填料用于其FDA認(rèn)證的生物治療產(chǎn)9如鑒別、含量、純度(包括DNA形式及宿主殘留DNA等雜質(zhì))及內(nèi)毒素等。其中E.coli作為質(zhì)粒生產(chǎn)的宿主菌，其殘留宿主DNA作為工藝雜質(zhì)需工藝過程中的原料產(chǎn)品，還是作為病毒載體及mRNA終產(chǎn)品里的雜質(zhì)，其含量同樣需要準(zhǔn)確o-《中國(guó)藥典》2020版三部《人用疫苗總論》對(duì)關(guān)鍵質(zhì)量屬性相關(guān)的工藝雜質(zhì)(如細(xì)胞基質(zhì)殘留DNA)如因產(chǎn)品特性無法在成品中檢測(cè)時(shí)，應(yīng)在適當(dāng)?shù)闹虚g產(chǎn)物取樣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)能準(zhǔn)確反映每一成品劑量中的殘留o-《中國(guó)藥典》2020版三部《人用基因治療制品總論》例如來自包裝細(xì)胞系或細(xì)菌的宿主細(xì)胞DN如使用致瘤細(xì)胞系，殘留DNA水平應(yīng)嚴(yán)格控制并保持在最低水平。如已經(jīng)證明可以有效控制或去除，并達(dá)到可接受?磁珠法提取試劑，支持手工或自動(dòng)化提取?適用于多種復(fù)雜基質(zhì)樣本?適用于不同工藝階段樣品?穩(wěn)定耐用，磁珠法核酸提取經(jīng)典平臺(tái)?高通量，單次完成1-96樣本提取?開放平臺(tái)，支持常見磁珠法試劑盒純化后的質(zhì)粒保存在TE緩沖液中，一般質(zhì)?？梢栽?°C短時(shí)間保存，經(jīng)常使用的質(zhì)粒可以保存在-20°C冰箱中能保存半年，長(zhǎng)期保存建議放在-80°C冰箱。因此儲(chǔ)存容器不僅需要降低殘留污?專為藥物活性成分樣品的儲(chǔ)存和運(yùn)輸設(shè)計(jì)?不同材質(zhì)可選，適用于不同溫度條件儲(chǔ)存?防穿刺，耐碰擊的瓶蓋和瓶體保護(hù)存儲(chǔ)物安全，且有效防止?提供完善的驗(yàn)證文件支撐，節(jié)省您的驗(yàn)證時(shí)間和成本業(yè)的液體處理、儲(chǔ)存和運(yùn)輸而研發(fā)。容量50m?厚度高達(dá)14mil，五層共擠壓結(jié)構(gòu)減少分層的可能?良好的韌性和抗穿刺性，高氣液阻隔性能；支持-80°C至6?蘇州生產(chǎn)，支持定制。貨期短，標(biāo)準(zhǔn)貨號(hào)有安全庫存單組分的干粉培養(yǎng)基用于高效的質(zhì)粒和重組化學(xué)限定的發(fā)酵培養(yǎng)基，支持強(qiáng)大的質(zhì)粒和重組蛋白生產(chǎn)。它是一種不含水解物和動(dòng)物源成分且易于使用的培養(yǎng)基，可用于替代水解物和動(dòng)物源培養(yǎng)基，可節(jié)省時(shí)間和精的營(yíng)養(yǎng)成分。該配方利用了ThermoFisher在蛋白胨、發(fā)酵和創(chuàng)新的化學(xué)限定培養(yǎng)基我們的化學(xué)限定的配方?jīng)]有動(dòng)物源成分，這消除了BSE/TSE相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)，并且監(jiān)管的除大量的原材料管理，稱重，或混合多種成分，您將實(shí)現(xiàn)效率的提高和各種繁瑣步驟?有效期18個(gè)月，儲(chǔ)存在2-8°C的冰箱中?可同時(shí)支持高壓滅菌或者除菌過濾?為標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵設(shè)備而設(shè)計(jì)?可輕松放大至大規(guī)模體積的發(fā)酵CDFPM培養(yǎng)基與TB培養(yǎng)基一致性對(duì)比OD600測(cè)量值低于15。28小時(shí)AB160140100806040200HyPerformaeS.U.F.在罐體底熱夾套，將設(shè)備的冷卻面積增加了25%，與此同時(shí)，側(cè)壁的夾套面積也增加了10%。因此，與原始HyPerformaS.U.F.相比，HyPerformaeS.U.F.的冷卻表面積共增加35%。使用設(shè)定點(diǎn)范圍為-5°C至55°C的24kWThermoScientific?NESLAB?溫度控制裝置(TCU)(460VAC，60Hz，3相，50A；貨號(hào)：SV50239.08)以及300LHyPerformaeS.U.F.進(jìn)行實(shí)際測(cè)試，結(jié)果表明，增加的35%夾套面積使設(shè)備的全體積加熱(從10°C到42°C)時(shí)間縮冷卻時(shí)間縮短20分鐘，改進(jìn)了25%。在開發(fā)HyPerformaeS.U.F時(shí)，我們對(duì)各種葉輪進(jìn)行了研最終我們選定了五種葉輪形制在液體中進(jìn)一步測(cè)試功耗和kLa性能。我們將兩個(gè)選中的最優(yōu)葉輪與Rushton葉輪一起用于極端情況下的大腸桿菌培養(yǎng)。在處于室溫的未通氣的水中進(jìn)行混合時(shí)，第一種葉輪(雖然直徑和葉片高度都大于Rushton葉輪)用電量與Rushton葉輪相等。第二種較大的增強(qiáng)型葉輪所用的電量比Rushton葉輪多50%左右。最后，我們選擇使用第二個(gè)葉輪進(jìn)行生產(chǎn)，因?yàn)橛捎贖yPerformaeS.U.F.s的葉輪比HyPerformaS.U.F.s中原來的Rushton葉輪更大，我們同時(shí)對(duì)變頻器(variable圖2.HyPerformaeS.U.F.中的增強(qiáng)型葉輪提供優(yōu)于HyPerforma為進(jìn)行平行對(duì)照，除葉輪變化之外，其他實(shí)驗(yàn)條件均保持完全一致。增強(qiáng)型葉輪性能的改善是通過減少整個(gè)培養(yǎng)過程中補(bǔ)充的氧氣量來證明的。當(dāng)培養(yǎng)液中的碳源耗盡時(shí)開始補(bǔ)料，當(dāng)系統(tǒng)檢測(cè)到溶解氧(DO)突增時(shí)則開始自動(dòng)補(bǔ)料。圖3是配備增強(qiáng)型葉輪的30L和300LHyPe之間觀察到類似的氧氣消耗量(vvm)(圖3)。與配備配備在HyPerformaS.U.F.即將運(yùn)行結(jié)束時(shí)補(bǔ)氧觀察到噪聲的增加，是由于增加了消泡劑的添加量。而在使用增強(qiáng)型葉輪的eS.U.F.中，消泡劑用量較少。此外，在使用300LHyPerformaS.U.F.培養(yǎng)的最后1.25小時(shí)內(nèi)，由于使用原37°C以上。采用較大型號(hào)的TCU或TCU中的泵可減少或防止這種噪聲。然而，這種噪聲也證明在要求更高的培養(yǎng)的。當(dāng)夾套面積增加時(shí)，即使OD達(dá)到210(比原始300LHyPerformaS.U.F.溫度開始升至設(shè)定點(diǎn)以上時(shí)高70)，溫度也不會(huì)高于37°C設(shè)定值的0.2°C。 時(shí)間(小時(shí))標(biāo)準(zhǔn)化攪拌(最大rpm%)標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)化O(vvm)增強(qiáng)型30L攪拌增強(qiáng)型300L攪拌ORushton30L*O增強(qiáng)型30LO增強(qiáng)型300LEFT(小時(shí))為了針對(duì)HyPerformaeS.U.F.的改造進(jìn)邀請(qǐng)了兩位客戶進(jìn)行了外部驗(yàn)證。由于這些客戶均為現(xiàn)有設(shè)備的用戶，范圍僅限于HyPerformaeS.U.F.葉輪的州劍橋市，官網(wǎng)：)進(jìn)行。Synlogic是一家將合成生物學(xué)的變革潛力帶入醫(yī)學(xué)臨床階段的生物技術(shù)公工藝開發(fā)和放大工具。Synlogic的某些發(fā)酵工藝需要對(duì)部以精確地做到這一點(diǎn)，提供微生物生長(zhǎng)的所需的必要微大氧氣流量減至總發(fā)酵流量的僅7%(圖4)。這使在30L此外，為了評(píng)價(jià)放大情況，客戶還對(duì)300LHyPerforma也產(chǎn)出了相似的結(jié)果，最大補(bǔ)氧量約為20SLPM，而30其未來的工藝開發(fā)提供了信心。鑒于這些成功的結(jié)果，第二個(gè)客戶是亞洲的一個(gè)CDMO，他們面臨著與其他的氧氣；更換多個(gè)高壓氣瓶的需求非常昂貴，需要較大的人力成本。同時(shí)，他們也希望消除一個(gè)長(zhǎng)期存在的物流挑戰(zhàn)?？蛻衄F(xiàn)有設(shè)施中氣體管道的容量有限，因此升級(jí)成本避免了昂貴的設(shè)施升級(jí)或成本負(fù)擔(dān)，以及使用大量高壓氧氣瓶的安全問題。該客戶證明，當(dāng)他們從配備Rushton葉需要使用最大流量為6SLPM的氧氣，不到一個(gè)氣瓶即可完成運(yùn)行。該客戶對(duì)HyPerformaeS.U.F.可與不銹鋼發(fā)酵罐相媲美的性能非常滿意，并計(jì)劃在工藝開發(fā)和GMP生HyPerformaeS.U.F.的設(shè)計(jì)顯著提高了冷卻能力，并降低效率更高的增強(qiáng)型拋物面葉輪。對(duì)增強(qiáng)夾套的測(cè)試證實(shí)，加熱和冷卻的溫度變化分別縮短了23%和25%。在使用相入的氣體更有效地分布在整個(gè)培養(yǎng)過程中，與Rushton葉質(zhì)粒DNA在新型療法中的應(yīng)用廣泛，因此其生產(chǎn)也受到了較大的關(guān)注。利用陰離子交換層析的純化方法可以實(shí)現(xiàn)靈活、可放大的質(zhì)粒DNA的純化工藝。ThermoFisherScientific開發(fā)了多POROS?填料可以在高線性流速下運(yùn)行，與其他填料相比，大孔結(jié)構(gòu)降低了傳質(zhì)阻力，并且小粒徑提高了去除雜質(zhì)的效果。POROS具有一系列不同的陰離子層析填料實(shí)驗(yàn)使用200μLRoboColumn?高通量篩選柱對(duì)表明，在pH7.0,POROSD50表現(xiàn)出最高的回收率(如圖三種AEX填料在pH7.0和60mS/cm的上樣電導(dǎo)率下均表現(xiàn)出最佳回收率(如表一)。實(shí)驗(yàn)使用1mL層析柱測(cè)試AEX以POROS?D50因具備大孔徑和內(nèi)孔表面積的優(yōu)勢(shì)，成capacity77571mS/cm時(shí)流穿，pDNA在電導(dǎo)率150mS/cm時(shí)洗脫，證實(shí)D50填料>10mg/mL的結(jié)合能力，通過在洗脫緩沖液中添加2?手動(dòng)或自動(dòng)樣本制備，從復(fù)雜樣本基質(zhì)中高效回收殘留?從樣本到結(jié)果的完整解決方案，包括樣本制備試劑盒、重組蛋白的E.coli表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞DNA。該系統(tǒng)可靠且快速，通常在4小時(shí)內(nèi)即可對(duì)大腸桿菌DNA進(jìn)行靈敏性(定量限=15pgDNA/ml供試樣本，圖1)和特異性(圖3)定量。該性能有助于以高可信度從包括過程中樣本至原液的多種樣本類型中獲得定量數(shù)據(jù)，無論樣本是含有完整或碎DNA-卡那霉素抗性基因定量試劑盒?通過創(chuàng)新的DNA-free預(yù)混液實(shí)?通過手動(dòng)和自動(dòng)樣本制備提供重現(xiàn)性結(jié)果，經(jīng)優(yōu)化以從?易于使用，5小時(shí)內(nèi)即可獲得結(jié)果?從樣本到結(jié)果的完整解決方案，包括樣本制備試劑盒、AppliedBiosystems?resDNASEQ?質(zhì)粒DNA-霉素抗性基因(pDNA-KanR)定量試劑盒基于qPCR系統(tǒng)，以檢測(cè)含有卡那霉素抗性基因的殘留質(zhì)粒DNA。qPCR法是一種成熟的殘留DNA檢測(cè)方法，通常用于評(píng)估基因治療、疫苗和生物類似藥開發(fā)過程中的產(chǎn)品質(zhì)量和安全性。resDNASEQ系統(tǒng)能夠通過靶向常用質(zhì)粒上存在的多個(gè)KanR等位基因?qū)锌敲顾乜剐曰?KanR)的質(zhì)粒DNA進(jìn)行快速、高靈敏度和高特異性定量。該性能有助于以高可信度從具有不同樣本基質(zhì)的過程樣本至原液的多種TaqMan檢測(cè)技術(shù)提供的寬線性范圍允許檢測(cè)不同濃度的30-300,000拷貝A標(biāo)準(zhǔn)品1(300,000拷貝)B標(biāo)準(zhǔn)品2(30,000拷貝)C標(biāo)準(zhǔn)品3(3,000拷貝)D標(biāo)準(zhǔn)品4(300拷貝)E標(biāo)準(zhǔn)品5(30拷貝)F標(biāo)準(zhǔn)品6(15拷貝)(LOD)G無模板控制斜率：斜率：-3.201效率：105.3可從復(fù)雜樣品中高效穩(wěn)定地提取核酸，全面支磁珠比傳統(tǒng)的樣品提取介質(zhì)具有更大表面積，可懸浮于液體捕獲小分子樣品的效率更高，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化過程因此得到廣泛應(yīng)用。KingFisher磁珠處理技術(shù)(專利號(hào)通過特制磁棒吸附、轉(zhuǎn)移和釋放磁珠，全過程無需離心或核酸自動(dòng)提取系統(tǒng)可以節(jié)省時(shí)間和人力，高工作效率，有降低綜合成本。該系統(tǒng)操作直觀，預(yù)設(shè)程序使用簡(jiǎn)便，并且能從復(fù)雜樣品中進(jìn)行高效穩(wěn)定的樣品制備，對(duì)SEQ檢測(cè)?ThermoScientific?BindIt?軟件可以創(chuàng)建個(gè)性化程序?提取效率高，在復(fù)雜樣品中回收率穩(wěn)定?應(yīng)用領(lǐng)域廣，兼容國(guó)內(nèi)外幾乎所有磁珠法試劑盒，降24/48/9620-5.000uL/孔室溫+5~+115°CMatrixMatrixM2M3M4M3M5382035-0005382035-0020383005-42383110-42383025-42383230-42383415-16383415-42383230-20382019-1000382019-0030382019-0060382019-0125382019-0250382019-0500382019-2000383030-42383120-42383120-42383233-42383405-16383405-4238