《植物生物技術(shù)概論》2課件

第二章基因工程1《植物生物技術(shù)概論》22《植物生物技術(shù)概論》2基因工程(geneengineering)的概念基因工程也叫基因操作、遺傳工程，或DNA重組技術(shù)。是按人們的需要，用類(lèi)似工程設(shè)計(jì)的方法將不同來(lái)源的基因（DNA分子），在體外構(gòu)建成雜種DNA分子，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、表達(dá)的操作。優(yōu)點(diǎn)：打破了常規(guī)育種難以突破的物種之間的限制。3《植物生物技術(shù)概論》2理論依據(jù)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)基因是可切割的基因是可以轉(zhuǎn)移的多肽與基因之間存在對(duì)應(yīng)關(guān)系遺傳密碼是通用的基因可以通過(guò)復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代4《植物生物技術(shù)概論》2基因工程的基本過(guò)程它所涉及的過(guò)程可用“分(合成)、切、連、轉(zhuǎn)、選、鑒”六個(gè)字表示。分(合成)∶指DNA的制備，包括從生物體中分離或人工合成。切∶即在體外將DNA進(jìn)行切割，使之片段化或線性化。連∶即在體外將不同來(lái)源的DNA分子重新連接起來(lái)，構(gòu)建重組DNA分子。轉(zhuǎn)∶即將重組連接的DNA分子通過(guò)一定的方法重新送入或細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)。選∶從轉(zhuǎn)化的全群體中將所需要的目的克隆挑選出來(lái)；鑒∶就是進(jìn)行對(duì)篩選出來(lái)的重組體進(jìn)行鑒定5《植物生物技術(shù)概論》2基因克隆示意圖6《植物生物技術(shù)概論》2第一節(jié)DNA重組技術(shù)7《植物生物技術(shù)概論》2一、DNA的結(jié)構(gòu)與功能8《植物生物技術(shù)概論》2脫氧核糖核苷酸分子由脫氧核糖、堿基和磷酸基團(tuán)（base）組成。1.組成9《植物生物技術(shù)概論》2多個(gè)脫氧核苷酸按此方式連接成多聚脫氧核苷酸，其一端為游離的5’磷酸基團(tuán)(5'-P)，稱(chēng)為5’端，而另一端為游離的3’羥基(3'-OH)，稱(chēng)為3’端。10《植物生物技術(shù)概論》2Chargaff規(guī)則的內(nèi)容所有DNA：A=T、G=C，即A+G=T+C。DNA的堿基組成具有種的特異性，即不同種的DNA堿基組成不一樣。對(duì)同一生物物種，DNA的堿基組成沒(méi)有組織和器官的特異性。DNA的堿基組成不隨年齡、營(yíng)養(yǎng)狀況及環(huán)境的改變而改變。11《植物生物技術(shù)概論》22.結(jié)構(gòu)（1）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)脫氧核苷酸在長(zhǎng)鏈上的排列順序就是DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)。不同種DNA之間的千差萬(wàn)別只是在堿基排列順序不同。DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)也稱(chēng)為核苷酸序列或堿基序列。12《植物生物技術(shù)概論》2（2）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)即DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型

(DNADoubleHelixModel).13《植物生物技術(shù)概論》21952.King’sLab.UKM.H.F.Wilkins&RosalindFrankinDNA的高質(zhì)量X射線衍射圖14《植物生物技術(shù)概論》21953.Watson&Crick

B-DNA的右手雙螺旋模型

15《植物生物技術(shù)概論》2DNA雙螺旋的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

l

兩股單鏈"糖-磷酸"構(gòu)成骨架，居雙螺旋外側(cè)。堿基位于雙螺旋內(nèi)側(cè)，并與中心軸垂直。l

每圈螺旋含10個(gè)核苷酸殘基，螺距：3.4nm,直徑:2nm。有兩個(gè)溝：大溝和小溝。l

堿基嚴(yán)格配對(duì):A與T、C與G互補(bǔ)堿基與互補(bǔ)鏈。l

由兩條反向平行的脫氧多核苷酸鏈圍繞同一中心軸構(gòu)成右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。16《植物生物技術(shù)概論》2影響雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素

氫鍵

(Hydrogenbond)弱鍵,可加熱解鏈.磷酸酯鍵

(phosphoesterbond),也叫離子鍵。強(qiáng)鍵,需酶促解鏈.堿基堆積力

(非特異性結(jié)合力).

☆磷酸骨架,氨基,酮基周?chē)肿娱g的有序排列

☆Vandewaalsforce

☆疏水作用力(Hydrophobicinteraction)

17《植物生物技術(shù)概論》2Z-DNAZ-DNAA-DNAB-DNADNA的分子構(gòu)型（B/Z/A）比較18《植物生物技術(shù)概論》2

由于雙鏈DNA是靠互補(bǔ)配對(duì)的堿基之間的氫鍵維持的，因此當(dāng)溶解在溶液中的雙鏈DNA處于較高溫度條件下時(shí)，因氫鍵斷開(kāi)而解鏈成單鏈DNA，此過(guò)程稱(chēng)為DNA變性。

DNA溶液加熱到90℃時(shí)，就足以使DNA完全變性。高溫變性的DNA被逐漸冷卻時(shí)，分開(kāi)的兩條單鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈DNA，此過(guò)程稱(chēng)為復(fù)性。DNA的變性與復(fù)性19《植物生物技術(shù)概論》2DNA的變性與復(fù)性20《植物生物技術(shù)概論》2DNA分子雜交21《植物生物技術(shù)概論》2雙螺旋DNA進(jìn)一步扭曲盤(pán)繞則形成其三級(jí)結(jié)構(gòu)，超螺旋是DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式。絕大多數(shù)原核生物都是共價(jià)封閉環(huán)(covalentlyclosedcircle,CCC)分子，這種雙螺旋環(huán)狀分子再度螺旋化成為超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)。超螺旋按其方向分為正超螺旋和負(fù)超螺旋兩種。（3）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)22《植物生物技術(shù)概論》223《植物生物技術(shù)概論》2（1）DNA分子能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制以親代DNA的一條單鏈為模板，按照堿基互補(bǔ)原則，合成另一條具有互補(bǔ)堿基的新鏈。通過(guò)復(fù)制所形成的新DNA子鏈，含有原來(lái)親本DNA雙鏈分子的一條親代鏈和一條新的子代鏈，所以DNA這種自我復(fù)制方式稱(chēng)為半保留復(fù)制。3.DNA的功能24《植物生物技術(shù)概論》225《植物生物技術(shù)概論》2DNA的功能——起著貯存和傳遞遺傳信息的作用?；颉蚓褪荄NA的功能片斷，或者說(shuō)基因是一段DNA順序。（2）貯存和傳遞遺傳信息26《植物生物技術(shù)概論》2DNA的基本功能就是作為生物遺傳信息復(fù)制的模板和基因轉(zhuǎn)錄的模板，是生命遺傳繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個(gè)體生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。27《植物生物技術(shù)概論》2DNA體外重組，首先必須獲得重組和能夠重組的DNA片段。如何獲得DNA片段呢？二、限制性內(nèi)切酶與DNA片段化28《植物生物技術(shù)概論》2一把特殊的剪刀

——限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內(nèi)森斯(Nathans)，獲1978年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)29《植物生物技術(shù)概論》230《植物生物技術(shù)概論》2限制性內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)是指一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA中特殊核苷酸序列，并在合適反應(yīng)條件下使每一條鏈一定位點(diǎn)上的磷酸二酯鍵斷開(kāi)，產(chǎn)生具有3’-OH基團(tuán)和5’-P基團(tuán)的DNA片段。內(nèi)切核酸酶有Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。1個(gè)單位限制性內(nèi)切酶是指在最適條件下，在50μl體積1小時(shí)內(nèi)完全切開(kāi)1μg

λ噬菌體DNA所需的酶量。1.限制性內(nèi)切酶31《植物生物技術(shù)概論》2限制性內(nèi)切酶的種類(lèi)32《植物生物技術(shù)概論》2（1）限制性核酸內(nèi)切酶的命名一般是以微生物屬名的第一個(gè)字母和種名的前兩個(gè)字母組成，第四個(gè)字母表示菌株(品系)。前三個(gè)字母必須是斜體。例如，從BacillusamyloliquefaciensH中提取的限制性內(nèi)切酶稱(chēng)為BamH。在同一品系細(xì)菌中得到的識(shí)別不同堿基順序的幾種不同特異性的酶，可以編成不同的號(hào)，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboII等。EcoRⅠ(E：屬名；co：種名；R：株；Ⅰ：發(fā)現(xiàn)次序)。EcoR

IEscharichiacoliRy13first33《植物生物技術(shù)概論》2（2）識(shí)別序列限制性內(nèi)切酶可特異地結(jié)合于一段被稱(chēng)為限制酶識(shí)別序列的DNA序列位點(diǎn)上并在此切割雙鏈DNA。絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶識(shí)別長(zhǎng)度為6個(gè)核苷酸的特異序列，切割位點(diǎn)相對(duì)于二重對(duì)稱(chēng)軸的位置因酶而異。少數(shù)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列由4個(gè)或者5個(gè)核苷酸對(duì)組成。34《植物生物技術(shù)概論》235《植物生物技術(shù)概論》2（3）酶切位點(diǎn)DNA在限制性內(nèi)切核酸酶的作用下，使多聚核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開(kāi)的位置被稱(chēng)為酶切位點(diǎn)，可用↓表示。一般酶切位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部，如G↓GATCC；少數(shù)在識(shí)別序列兩側(cè)，如：↓GATC、CATG↓等。一些酶恰在對(duì)稱(chēng)軸處同時(shí)切割DNA雙鏈而產(chǎn)生帶平端的DNA片段；另一些酶則在對(duì)稱(chēng)軸兩側(cè)相對(duì)的位置上分別切斷兩條鏈，產(chǎn)生帶有單鏈突出端（即黏端）的DNA片段36《植物生物技術(shù)概論》2平末端與黏性末端37《植物生物技術(shù)概論》238《植物生物技術(shù)概論》239《植物生物技術(shù)概論》2反應(yīng)只需Mg2+的存在，并且具有以下兩個(gè)特點(diǎn)，使這類(lèi)酶在基因工程研究中，得到廣泛的應(yīng)用。識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)上。許多Ⅱ型酶切割DNA后，可在DNA上形成黏性末端，有利于DNA片段的重組。II型酶40《植物生物技術(shù)概論》2Ⅱ類(lèi)酶識(shí)別序列特點(diǎn)41《植物生物技術(shù)概論》2

同裂酶（isoschizomers)：

指來(lái)源不同但識(shí)別相同靶序列的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。但有些同裂酶對(duì)甲基化位點(diǎn)的敏感性不同。Example:限制酶HpaⅡ和MspⅠ是一對(duì)同裂酶（CCGG)，當(dāng)靶序列中一個(gè)5-甲基胞嘧啶時(shí)HpaⅡ不能進(jìn)行切割，而MspⅠ可以。同裂酶與同尾酶42《植物生物技術(shù)概論》2同尾酶（isocaudamer）序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。利用同尾酶可使切割位點(diǎn)的選擇余地更大。43《植物生物技術(shù)概論》2三、特異DNA片段的PCR擴(kuò)增PCR技術(shù)(Polymerase

ChainReaction):是在模板DNA、引物和四種dNTP

等存在的條件下,依賴于DNA聚合酶(Taq酶)的酶促合成反應(yīng)。其具體反應(yīng)分三步:

變性、退火、延伸。以上三步為一個(gè)循環(huán),經(jīng)25～30次循環(huán)DNA數(shù)量可達(dá)2×106～7拷貝數(shù)。44《植物生物技術(shù)概論》21983年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)PCR技術(shù)的發(fā)明45《植物生物技術(shù)概論》2KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR

為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。46《植物生物技術(shù)概論》2PCR技術(shù)的反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物

各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L47《植物生物技術(shù)概論》2(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴(kuò)增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補(bǔ)鏈引物1互補(bǔ)鏈單位長(zhǎng)度的鏈不同長(zhǎng)度的鏈5’3’3’5’引物1互補(bǔ)鏈引物2互補(bǔ)鏈目的片段（不同長(zhǎng)度的鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)48《植物生物技術(shù)概論》2溫度（℃）時(shí)間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。49《植物生物技術(shù)概論》2反應(yīng)初期，目的DNA片段呈指數(shù)形式增加；隨著目的DNA的積累，在引物、模板與DNA聚合酶達(dá)到一定比例時(shí)，酶的催化反應(yīng)趨于飽和平臺(tái)期（25個(gè)循環(huán)）。50《植物生物技術(shù)概論》21.雙鏈DNA變性（一）PCR的反應(yīng)過(guò)程51《植物生物技術(shù)概論》22.引物與模板DNA退火52《植物生物技術(shù)概論》23.引物延伸DNA合成53《植物生物技術(shù)概論》24.第二輪循環(huán)的變性54《植物生物技術(shù)概論》25.第二輪循環(huán)的引物延伸DNA合成55《植物生物技術(shù)概論》256《植物生物技術(shù)概論》2PCR反應(yīng)的特點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克(mg=10-6)水平簡(jiǎn)便、快速：PCR反應(yīng)一般在2～4小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA粗制品及總RNA均可作為擴(kuò)增模板。57《植物生物技術(shù)概論》2（二）RT-PCR（reversetranscriptionPCR）反轉(zhuǎn)錄PCR是一種從RNA擴(kuò)增cDNA的方法。提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA；再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。58《植物生物技術(shù)概論》259《植物生物技術(shù)概論》2四DNA片段的化學(xué)合成利用DNA合成儀，根據(jù)待合成的DNA片段預(yù)定的核苷酸序列，可自動(dòng)的將4種核苷酸單體按3’-5’磷酸酯鍵連接成寡核苷酸片段。合成引物合成DNA寡核苷酸連桿(linker)合成基因片段60《植物生物技術(shù)概論》2寡核苷酸連桿也稱(chēng)為銜接物或接頭，是一種按預(yù)先設(shè)計(jì)，化學(xué)合成的寡核苷酸片段。有一種或幾種限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列，使連接了寡核苷酸連桿的DNA片段經(jīng)過(guò)這些限制性內(nèi)切核酸酶酶切后，可以產(chǎn)生一定的黏性末端，便于與具有相同黏性末端的另一DNA片段連接。61《植物生物技術(shù)概論》2有的寡核苷酸連桿超過(guò)100個(gè)核苷酸，其上有多種限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列，不僅可作為連桿，而且被組裝在克隆載體上成為多克隆位點(diǎn)(MCS)。這樣的連桿被稱(chēng)為多克隆位點(diǎn)核苷酸連桿或簡(jiǎn)稱(chēng)MCS連桿。MCS連桿62《植物生物技術(shù)概論》2五DNA片段的連接重組DNA連接酶(DNAligase)

能催化雙鏈DNA片段緊靠在一起的3’-OH末端和5’-P末端之間形成磷酸二酯鍵，使兩末端連接。目前用于試管中連接DNA片段的DNA連接酶E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。E.coliDNA連接酶只能催化雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接；而T4DNA連接酶既可用于雙鏈DNA片段互補(bǔ)黏性末端之間的連接，也能催化雙鏈DNA片段平末端之間的連接。1.DNA連接酶63《植物生物技術(shù)概論》2DNA連接酶只能連接缺口（nick），不能連接裂口（gap）。而且被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。64《植物生物技術(shù)概論》2DNA連接酶利用NAD或ATP中的能量催化兩個(gè)核酸鏈之間形成磷酸二酯鍵。DNA連接酶－－NAD+T4DNA連接酶－－ATP65《植物生物技術(shù)概論》2（1）具互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接連接反應(yīng)可用E.coliDNA連接酶，也可用T4DNA連接酶；待連接的兩個(gè)DNA片段的末端如果是用同一種限制性內(nèi)切核酸酶酶切的，連接后仍保留原限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列。如果是用兩種同尾酶酶切的，雖然產(chǎn)生相同的互補(bǔ)黏性末端，可以有效地進(jìn)行連接，但是獲得的重組DNA分子往往消失了原來(lái)用于酶切的那兩種限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列。2.DNA片段之間的連接66《植物生物技術(shù)概論》2BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGDNA連接酶GATCCGGCCTAG+重組體目的基因自連

載體自連2.DNA片段之間的連接（1）具互補(bǔ)黏性末端片段之間的連接《植物生物技術(shù)概論》2目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切