分離分析技術課件

分離分析技術5.分離分析技術5.分離分析技術

分離（separation）的概念含有m種化學組分的混合物被分成m個常量范圍。把m種化學組分分成m種純的形式，并把它們置于m個獨立的容器中。利用混合物中各組分在物理或化學性質上的差異，通過適當的裝置或方法，使各組分分配至不同的空間區(qū)域或者在不同的時間依次分配至同一空間區(qū)域的過程。什么是分離5.分離分析技術可用于分離的物質性質物理性質力學性質密度、摩擦因素、表面張力、尺寸、質量熱力學性質熔點、沸點、臨界點、蒸汽壓、溶解度、分配系數、吸附電磁性質電導率、介電常數、遷移率、電荷、淌度、磁化率輸送性質擴散系數、分子飛行速度化學性質熱力學性質反應平衡常數、化學吸附平衡常數、離解常數、電離電位反應速度反應速度常數生物學性質

生物親和力、生物吸附平衡、生物學反應速度常數分離方法的類型5.分離分析技術分類一：按被分離物質的性質1.物理分離法－按被分離組分在物理性質上的差異，采用適當的物理手段進行分離。

如：離心分離、電磁分離。2.化學分離法－按被分離組分在化學性質上的差異，通過適當的化學過程使其分離。

如：沉淀分離、溶劑萃取、色譜分離、選擇性溶解。3.物理化學分離法－按被分離組分在物理化學性質上的差異進行分離。

如：蒸餾、揮發(fā)、電泳、區(qū)帶熔融、膜分離。分離方法的類型5.分離分析技術分類二：按分離過程的實質1.平衡分離過程－使原混合物系形成新的相界面。利用互不相溶的兩相界面上的平衡關系使均相混合物得以分離。

如：蒸餾、升華、超臨界萃取、固相萃取、吸附。2.速度差分離過程－強化特殊梯度場。用于非均相混合物的分離。

如：沉降、離心、電泳、透析、反滲透。3.反應分離過程－促進化學反應達到分離。

如：沉淀、離子交換、反應晶析、反應萃取。分離方法的類型5.分離分析技術色譜法5.分離分析技術色譜法（Chromatography）是一種分離分析方法，它是利用各物質在兩相中具有不同的分配系數，當兩相作相對運動時，這些物質在兩相中進行多次反復的分配來達到分離的目的。色譜法5.分離分析技術歷史茨維特(M.S.Tswett1872-1919)俄羅斯植物學家色譜學之父以他的名字命名的Tswett獎，是色譜界的最高榮譽獎。

5.分離分析技術歷史1940s紙色譜（paperchromatography，PC）1950s薄層色譜（thinlayerchromatography，TLC）1950s氣相色譜（gaschromatography，GC）1960s高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）1970s毛細管氣相色譜（capillarygaschromatography，CGC）1980s毛細管電泳（capillaryelectrophoresis，CE）5.分離分析技術1948,8daysseparationfor16aminoacids色譜的發(fā)展5.分離分析技術1958,22hoursseparationfor19ofaminoacids色譜的發(fā)展5.分離分析技術1982,lessthan30minutesseparationfor18ofaminoacids色譜的發(fā)展5.分離分析技術（一）從兩相的狀態(tài)分類：色譜法中，流動相可以是氣體，也可以是液體，由此可分為氣相色譜法（GC）和液相色譜法（LC）。固定相既可以是固體，也可以是涂在固體上的液體，由此又可將氣相色譜法和液相色譜法分為氣-液色譜、氣-固色譜、液-固色譜、液-液色譜。色譜的分類5.分離分析技術（二）按分離原理分類：吸附色譜法：利用吸附劑（固定相一般是固體）表面對不同組分吸附能力的差別進行分離的方法；分配色譜法：利用組分在固定液（固定相）中溶解度不同進行分離的方法。離子交換色譜：利用溶液中不同離子與離子交換劑間的交換能力的不同而進行分離的方法。尺寸排阻色譜法：利用多孔性物質對不同大小的分子的排阻作用進行分離的方法。親和色譜法：利用不同組分與固定相（固定化分子）的特異性親和作用進行分離的方法。色譜的分類5.分離分析技術色譜的分類（三）按固定相的形式分類：按固定相的狀態(tài)可分為：柱色譜：固定相裝在色譜柱中；紙色譜：利用濾紙作載體，吸附在紙上的水作固定相；薄層色譜：將固體吸附劑在玻璃板或塑料板上制成薄層作固定相。5.分離分析技術

紙色譜示意圖溶劑前沿起始線（原點）展開劑yx2x1層析缸層析紙紙色譜5.分離分析技術定性檢出氨基蒽醌試樣中的各種異構體樣品：氨基蒽醌固定相：

-溴代萘附著于濾紙纖維素上.展開劑：吡啶:水（1:1）1,7-氨基蒽醌1,6-氨基蒽醌1,8-氨基蒽醌1-氨基蒽醌硝基蒽醌溶劑前沿原點紙色譜5.分離分析技術色譜的工作過程5.分離分析技術色譜流出曲線色譜流出曲線（chromatogram）指樣品注入色譜柱后，信號隨時間變化的曲線。當待測組分流出色譜柱時，檢測器就可檢測到其組分的濃度，在流出曲線上表現為峰狀，叫色譜峰。5.分離分析技術下圖是兩個物質經過不同色譜柱后的流出曲線，請問哪個好？ABCD5.分離分析技術氣相色譜5.分離分析技術

H2,N2或Ar氣路系統(tǒng)進樣系統(tǒng)檢測系統(tǒng)分離系統(tǒng)溫控系統(tǒng)氣相色譜儀的結構五大系統(tǒng)5.分離分析技術氣相色譜儀的結構一、氣路系統(tǒng)獲得純凈、流速穩(wěn)定的載氣。載氣要求化學惰性，不與有關物質反應。

二、進樣系統(tǒng)以進樣器（微量注射器或六通閥）將樣品注入氣化室(汽化室溫度比樣品中最易蒸的物質的沸點高約50oC)5.分離分析技術氣相色譜儀的結構三、分離系統(tǒng)色譜柱：填充柱、空心毛細管柱填充柱：制備簡單，可供使用的單體，固定液，吸附劑繁多，可解決各種分離分析問題。填充柱外形有U型，和螺旋型兩種，內徑均為2～4mm，長度在1～3m之間?？捎刹讳P鋼，玻璃，聚四氟乙烯等制成?？招拿毠埽悍治鏊俣瓤?，樣品用量少，柱容量低，內徑為0.1～0.5mm，長為50～300m，其外形多為螺旋型，材料：玻璃，尼龍，不銹鋼。5.分離分析技術氣相色譜儀的結構四、控溫系統(tǒng)溫度控制是否準確，升、降溫速度是否快速是市售色譜儀器的最重要指標之一?？販叵到y(tǒng)包括對三個部分的控溫，即，氣化室、柱箱和檢測器?？販胤绞剑汉銣睾统绦蛏郎亍?.分離分析技術1.熱導檢測器(TCD);2.氫火焰離子化檢測器(FID);3.電子捕獲檢測器(ECD);4.火焰光度檢測器(FPD);5.氮磷檢測器（NPD）也稱熱離子檢測器(TID);6.原子發(fā)射檢測器(AED);7.硫熒光檢測器（SCD）氣相色譜儀的結構五、檢測和放大記錄系統(tǒng)5.分離分析技術根據檢測器的響應原理，可將其分為濃度型和質量型檢測器。濃度型：檢測的是載氣中組分濃度的瞬間變化，即響應值與濃度成正比。質量型：檢測的是載氣中組分進入檢測器中速度變化，即響應值與單位時間進入檢測器的量成正比。氣相色譜儀的結構5.分離分析技術氣相色譜固定相可分為兩類：1）用于氣液色譜的固定相：固定液+載體2）用于氣固色譜的固定相：固體吸附劑氣相色譜固定相5.分離分析技術氣液色譜固定相

氣液色譜固定相——載體

載體為固定液提供大的惰性表面，以承擔固定液，使其形成薄而勻的液膜。5.分離分析技術氣液色譜固定相

氣液色譜固定相——固定液

對固定液的要求：

a)熱穩(wěn)定性好、蒸汽壓低——流失少

b)化學穩(wěn)定性好——不與其它物質反應

c)對試樣各組分有合適的溶解能力（分配系數K適當）

d)對各組分具有良好的選擇性固定液選擇：按“相似相溶”原理選擇固定液。非極性組分——非極性固定液極性物質——極性固定液Ps:相對極性P：規(guī)定非極性固定液角鯊烷的極性為0，強極性固定液

,-氧二丙腈的極性為100，其余物質的P在0～100之間，每20單位為一級，即將極性分為5級：0～+1(非極性)；+2(弱極性)；+3(中等極性；+4～+5(強極性)5.分離分析技術氣液色譜固定相5.分離分析技術氣固色譜固定相

氣固色譜固定相——固體吸附劑

該類型色譜柱是利用其中固體吸附劑對不同物質的吸附能力差別進行分離。主要用于分離小分子量的永久氣體及烴類。常用的固體吸附劑：硅膠(強極性)、氧化鋁(弱極性)、活性炭(非極性)、分子篩(極性，篩孔大小)5.分離分析技術氣固色譜固定相5.分離分析技術液相色譜5.分離分析技術

氣相色譜與液相色譜1．分析對象的區(qū)別GC：適于能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品；但對高沸點、揮發(fā)性差、熱穩(wěn)定性差、離子型及高聚物的樣品，尤其對大多數生化樣品不可檢測占有機物的20%

LC：適于溶解后能制成溶液的樣品（包括有機介質溶液），不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，對分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差的生化樣品及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機物的80%GC與LC5.分離分析技術

2．流動相差別的區(qū)別GC：流動相為惰性，氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相有相互作用。HPLC：流動相為液體，流動相與組分間有親合作用力，能提高柱的選擇性、改善分離度，對分離起正向作用。且流動相種類較多，選擇余地廣，改變流動相極性和pH值也對分離起到調控作用，當選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相也可以增大分離選擇性。

3．操作條件差別GC：加溫操作LC：室溫（液體粘度大，峰展寬小）GC與LC5.分離分析技術HPLC與LC1．高速HPLC：高壓！2．高效HPLC：顆粒極細、規(guī)則均勻的固定相3．高靈敏度HPLC：高靈敏檢測器5.分離分析技術HPLC的主要類型5.分離分析技術HPLC的主要類型SO3H+M+

SO3M+H+

5.分離分析技術Agilent11005.分離分析技術5.分離分析技術對于未知的復雜樣品，如何知道流出的每個峰對應于什么物質？5.分離分析技術氣/液-質聯(lián)用5.分離分析技術質譜質譜法（massspectrometry,MS）是通過將樣品轉化為運動的氣態(tài)離子并按質荷比（m/z）大小進行分離記錄的分析方法，所得結果即為質譜圖（massspectrum）。質譜法的主要作用是：（1）準確測定物質的分子量（2）根據碎片特征進行化合物的結構分析

在鑒定有機物的四大重要手段（NMR、MS、IR、UV-vis）中，也是唯一可以確定分子式的方法。

5.分離分析技術1、進樣化合物通過汽化引入離子化室2、離子化在離子化室，組分分子被一束加速電子碰撞（能量約70eV），撞擊使分子電離形成正離子；M——M++e或與電子結合，形成負離子M+e——M-原理5.分離分析技術4、荷電離子被加速電壓加速，產生一定的速度v，與質量、電荷及加速電壓有關：原理3、離子也可因撞擊強烈而形成碎片離子5.分離分析技術3、分離管為一定半徑的圓形管道，在分離管的四周存在均勻磁場。在磁場的作用下，離子的運動由直線運動變?yōu)閯蛩賵A周運動。此時，圓周上任何一點的向心力和離心力相等。故：

R為圓周半徑，H為磁場強度。

合并上述兩式：原理5.分離分析技術質譜圖5.分離分析技術色譜－質譜聯(lián)用色譜：化合物分離質譜：純物質結構分析色譜-質譜聯(lián)用：分離-分析SampleSample

58901.0DEG/MINHEWLETTPACKARDHEWLETTPACKARD5972AMassSelectiveDetectorDCBA

ABCDChromatographMassSpectrometerSeparationIdentificationBACDADBCMSGC/LC-MS5.分離分析技術色譜質譜聯(lián)用儀關鍵點：接口技術GC-MS的“接口”：常采用噴射分子離子分離器。GC-MS接口：除去載氣，只讓組分分子進入離子源。LC-MS的“接口”：常采用離子噴霧、電噴霧技術。LC-MS接口：除去流定相，只讓組分分子進入離子源。GC/LC-MS5.分離分析技術島津GCMS-QP2010氣質聯(lián)用儀GC/LC-MS5.分離分析技術GC/LC-MS譜圖總離子流色譜圖（TotalIoncurrentchromatogram,TIC) 樣品離子化后形成的各種離子（包括碎片離子）流強度隨時間變化的曲線。橫坐標：每種離子強度最大時對應的時間?？v坐標：每種離子產生信號的強度。質譜圖GC/LC-MS譜圖5.分離分析技術總離子流圖和質譜圖的關系GC/LC-MS譜圖5.分離分析技術應用：苯烷基化反應產物的檢測。儀器：HP6890GC-5973MS氣質聯(lián)用儀；色譜柱為HP-5MS彈性石英毛細管柱,30m×250μm×0.25μm；載氣為氦氣；電離方式為EI，離子源溫度為230℃，電子能量為70eV.

氣相色譜條件：進樣口溫度為310℃，接口溫度為280℃，進樣量為0.2μl，流速為0.8mL/min，分流比為50:1，柱溫從100℃開始，以15℃/min升至300℃，保持2min。C6H6+RBrC6H5－R

（R=C14H29）應用實例——GC-MS5.分離分析技術苯烷基化產物的總離子流圖t/min十四烷基苯的質譜圖m/e應用實例——GC-MS5.分離分析技術應用：測定牛奶中4種四環(huán)素類藥物殘留量。

我國規(guī)定牛奶中四環(huán)素類的最大殘留量0.1mg/Kg。應用實例——LC-MS美他環(huán)素金霉素四環(huán)素土霉素5.分離分析技術儀器：Finnigan公司LCQ型液相色譜－質譜聯(lián)用儀，包括

ESI（電噴霧電離）源。

HypersilBDSC18(5μm,5.0mm×150mm)色譜柱.

條件:流動相為乙腈-水-甲酸（37.5:62.5:1.2），流速

0.5mL/min；離子源（ESI）噴射電壓4.2Kv；氮氣流速0.75L/min。四種四環(huán)素類藥物色譜圖應用實例——LC-MS5.分離分析技術四環(huán)素土霉素金霉素美他環(huán)素四種四環(huán)素類藥物的質譜圖應用實例——LC-MS5.分離分析技術定性分析：將待測樣品（牛奶）進行LC-MS分析，與四種四環(huán)素類藥物標準品的保留時間和質譜圖進行對比分析。定量分析：標準曲線法（峰面積～濃度）。應用實例——LC-MS5.分離分析技術毛細管電泳5.分離分析技術經典電泳分析

在電解質溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質的不同，遷移速率不同，可實現分離。按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。經典電泳與毛細管電泳5.分離分析技術毛細管電泳分析

CapillaryElectrophoresis(CE)高效毛細管電泳在技術上采取了兩項重要改進：

一是采用了50μm(0.05mm)內徑的毛細管,

二是采用了高達數千伏的電壓。

毛細管的采用使產生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應，使電場電壓可以很高。電壓升高，電場推動力大，又可進一步使柱徑變小，柱長增加，高效毛細管電泳的柱效遠高于高效液相色譜，理論塔板數高達幾十萬塊/米，特殊柱子可以達到數百萬。經典電泳與毛細管電泳5.分離分析技術高效毛細管電泳普通色譜毛細管電泳與色譜5.分離分析技術1、高靈敏度：紫外檢測器的檢測極限在10-13—10-15mol之間，熒光檢測可達10-19—10-21mol。2、速度快:許多分析在10分鐘內完成。3、進樣少:一般需要毫微升的進樣量。4、成本低:一般只需要可長期使用的毛細管和極微量的可自己配制的緩沖液。5、應用范圍廣:有機物、無機物、生物、中性分子、生物大分子等。毛細管電泳的特點5.分離分析技術電滲現象與電滲流

electroosmosisandelectroosmoticflow

當固體與液體接觸時，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。

當液體兩端施加電壓時，就會發(fā)生液體相對于固體表面的移動，這種液體相對于固體表面的移動的現象叫電滲現象。

電滲現象中整體移動著的液體叫電滲流（electroosmoticflow，簡稱EOF）。

毛細管電泳的基本原理5.分離分析技術電滲流的方向取決于毛細管內表面電荷的性質：內表面帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內表面帶正電荷，溶液帶負電荷，電滲流流向陽極；石英毛細管柱，內充液pH>3時，表面電離成-SiO-,管內壁帶負電荷，形成雙電層。

在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴散層向陰極移動，由于這些陽離子實際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負極移動，速度ν電滲流。毛細管電泳的基本原理改變電滲流方向的方法：（1）毛細管改性表面鍵合陽離子基團；（2）加電滲流反轉劑內充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細管壁帶正電荷，溶液表面帶負電荷。電滲流流向陽極。5.分離分析技術CE中電滲流的流形

電荷均勻分布，整體移動，電滲流的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很?。灰合嗌V中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。毛細管電泳的基本原理5.分離分析技術

各種電性離子在毛細管柱中的遷移速度為：

ν+=ν電滲流

+ν+ef陽離子運動方向與電滲流一致；

ν-=ν電滲流

-ν-ef陰離子運動方向與電滲流相反；

ν0=ν電滲流

中性粒子運動方向與電滲流一致；（1）可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；（2）改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；（3）電滲流的微小變化影響結果的重現性；在CE中，控制電滲流非常重要。毛細管電泳的基本原理5.分離分析技術CE中影響電滲流的因素1.電場強度的影響：電滲流速度和電場強度成正比2.毛細管材料的影響

3.電解質溶液性質的影響4.溫度的影響5.添加劑的影響毛細管電泳的基本原理5.分離分析技術淌度

mobility

淌度：帶電離子在單位電場下的遷移速度；

淌度不同是電泳分離的基礎。毛細管電泳的基本原理5.分離分析技術毛細管區(qū)帶電泳

Capillaryzoneelectrophoresis，CZE

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。

正離子：兩種效應的運動方向一致，在負極最先流出；中性粒子：無電泳現象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子：兩種效應的運動方向相反；ν電滲流>ν電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。

最基本、應用廣的分離模式毛細管區(qū)帶電泳5.分離分析技術毛細管凝膠電泳

Capillarygelelectrophoresis，CGE將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。蛋白質、DNA等的電荷/質量比與分子大小無關，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DNA排序的重要手段。其他毛細管電泳類型

在毛細管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定相，或在管內填充固定相，根據溶質在固定相和流動相中的分配系數的不同和自身的電泳淌度差異得以分離．毛細管電色譜(CEC)

Capillaryelectrochromatography膠束電動毛細管色譜（MECC，MEKC）毛細管等電聚焦（CIEF）5.分離分析技術1.高壓電源0～30

kV穩(wěn)定、連續(xù)可調的直流電源；2.毛細管柱

（1）材料：石英；玻璃；聚四氟乙烯（2）規(guī)格：內徑20～75μm，外徑350～400μm；長度<=1m毛細管電泳儀3.緩沖液池4.檢測器紫外-可見、熒光、激光誘導熒光、電導等5.分離分析技術離子分析

analysisofion陽離子分析

遷移方向和電滲流方向一致；

4.5min內分離了24種金屬離子；陽極進樣，陰極檢測；具有很高的靈敏度；毛細管電泳的應用5.分離分析技術陰離子分析

陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時間長、效率低；質量小、電荷密度大的離子如：SO4-2、